Diapositive 1

Nouvelles approches pour l'étude
des cellules endothéliales en
microscopie
Ceci n’est pas un poulpe!
CHATELAIS Mathias
Ingénieur Hospitalier
Le 29-03-12
INSERM U1064 Nantes
Dir : ANEGON Ignacio
Introduction
La Cellule endothéliale :
Rôle de barrière cellulaire / activités de contrôle
 De l’inflammation
 De Réponse immune innée et adaptative
 De l’Homéostasie vasculaire
Cellules endothéliales
Cellule
Endothéliale
La Migration cellulaire permet :
CD31 / α-actine / Dapi
 D’étudier le remodelage vasculaire
 Les mécanismes impliqués dans la formation des adhésions focales
 De trouver des molécules régulant la migration
La migration cellulaire 2D
Tapis cellulaire endothélial, induction mécanique
Inconvénients :
 Tracking difficile
perte cellule dans champ
perte de la cellule
présence de débris cellulaire
 Vélocité difficile à mesurer
 Résultats en % de recouvrement (biais)
Nombreuse interactions cell/cell
Division cellulaire/étalement
Effet de détassement (migration?)
Avantages :
 Peu coûteux
 Rapide
Zone de recouvrement
La migration cellulaire 1D
Technologie CYTOO :
Migration 1D sur rail de fibronectine
Surface cytophobe
Fibronectine
Cellule
Milieu
Lame de verre
1 puce CYTOO motility :
 4 tailles de rails différentes
 4 conditions simultanées
 n=200cellules/condition
 Vélocité, Immunofluorescence
Migration sur rail 10µm
Migration 1D sur rail 10µm
La migration cellulaire 1D
Cellules isolées sur rails de fibronectine
Avantages :
Tracking facile
Cellule en permanence dans le champ
Multitracking possible
Absence de débris cellulaire
 Vélocité facile à mesurer (µm/h)
 Nombreuses cellules analysées
 Peu d’interaction cell/cell
 Division/étalement contrôlé
 Pas d’effet de détassement
 Nécessite peu de cellules (5000 par puits)
Zone de migration
Inconvénients :
 Plus coûteux
 Analyse plus longue
Le tracking en vidéomicroscopie
Exemple d’un Tracking
Vélocité moyenne en
fonction de la taille du rail
Vélocité en fonction du temps
Distance moyenne parcourue
La vidéomicroscopie : c’est aussi des résultats!
2.5µm
5µm
10 µm
20 µm
Devallière et al, FASEBJ, 2012 (in Press)
Après la vidéomicroscopie : l’immunofluorescence
Sens de migration
Phase
ObjX60
Lamelipode
Protrusion
Actine / Vinculine / DAPI
Vinculine
Actine
Icorr
= 0.351
Désassemblage actine/vinculine
Vinculine
Actine
Icorr
= 0.598
Assemblage actine/vinculine
La normalisation
CYTOO CHIPS
La normalisation
CYTOO CHIPS
La normalisation
CYTOO CHIPS
Max
Membrane Ruffling
Nucleus
Lamellipodium
Average
Stress fibers
Actine
n=59 DAPI
Membrane Ruffling
Min
Profil d’intensité d’expression
de la vinculine
Vinculine
n=19
n=59
localisation
AF Immature
&
Mature
Mature
&
Supermature
Remerciements
INSERM U1064
PF MicroPICell
Dir : ANEGON Ignacio
Dir : LE PENDU Jacques
Equipe 5, Dysfonction endothéliale en
HULIN Philippe (responsable technique)
transplantation
ROBARD Myriam (responsable technique)
CHARREAU Béatrice (coordinatrice)
GUITTON Christophe
DEVALLIERE Julie
TONNERRE Pierre
[email protected]
[email protected]
GERARD Nathalie
PABOIS Angélique
GAVLOVSKY Pierre-Jean
www.cytoo.com