these de doctorat

Ministère de l’Enseignement Supérieur, de la Recherche
Scientifique et de la Technologie
Université de Monastir
Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir
THESE DE DOCTORAT
En vue de l’obtention du grade de
Docteur d’Université en Sciences Biologiques et Biotechnologiques
Présentée par : Mohamed Ridha HACHANA
Laboratoire d’Anatomie et de Cytologie Pathologiques, CHU Farhat Hached de Sousse
Soutenue le 31 octobre 2009 devant les membres de jury :
Président : Mr. Bartegi AGHLEB, Professeur
Rapporteur : Mr. Jawhar GHARBI, Maître de Conférences
Rapporteur : Mme. Besma BEL HAJ JRAD, Maître de Conférences
Examinateur : Mr. Boulbaba SELMI, Maître de Conférences
Encadreur : Mr. Mounir TRIMECHE, Professeur Agrégé
Année Universitaire 2008-2009
Contribution à l’étude de l’implication des virus
et évaluation de leur valeur pronostique dans le
cancer du sein de la femme dans la région du
centre tunisien

REMERCIEMENTS
A l’occasion de la soutenance de ma thèse de doctorat, il m’est agréable d’exprimer ma gratitude
envers tous ceux qui ont contribué à ma formation et qui m’ont aidé à réaliser ce travail.
En premier lieu, je tiens à remercier Monsieur le Professeur Sadok Korbi, chef de service du
laboratoire d’Anatomie et Cytologie Pathologiques du CHU Farhat Hached de Sousse pour
m’avoir accueilli au sein de son équipe et de m’avoir accordé la confiance pour mener à terme le
sujet qui m’a été proposé. Qu’il trouve ici l’assurance de ma profonde gratitude.
Je tiens aussi à adresser mes plus vifs remerciements au Professeur Agrégé Mounir TRIMECHE
(laboratoire d’Anatomie et Cytologie Pathologiques du CHU Farhat Hached) pour sa présence
remarquable durant la réalisation de ce travail et son engagement dans toute les étapes de mon
encadrement.
Je souhaite remercier vivement, pour l’honneur qu’ils me font, Monsieur le professeur Bartegi
AGHLEB (Département de Biochimie, Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir), qui a
accepté de présider ce jury, Monsieur le Maître de Conférences Jawhar GHARBI (Département de
Microbiologie, Institut Supérieur de Biotechnologie de Monastir) et Madame le Maître de
Conférences Besma BEL HAJ JRAD (Département d’Immunologie, Institut Supérieur de
Biotechnologie de Monastir), qui ont accepté d’être rapporteurs de cette thèse et Monsieur le
Maître de Conférences Boulbaba SELMI (Département de Biochimie, Institut Supérieur de
Biotechnologie de Monastir), qui a accepté d’examiner ce travail.
Mes remerciements s’adressent également aux membres du Laboratoire d’Anatomie Pathologique
du CHU Farhat Hached de Sousse, en particulier Mme Intissar Toumi, pour leur aide.
J’aimerais aussi remercier mes parents, à qui je dois tout ce que je suis, que Dieu vous préserve et
vous accorde longue vie.
Enfin, Je remercie de tout mon cœur mon épouse Essia qui n’a cessé de m’encourager tout au long
de ces années, d’être a coté de moi dans les moments les plus difficiles et pour son aide précieuse
dans la préparation et de la rédaction de ce mémoire.
Je dédie particulièrement ce travail à mon petit ange Mehdi, le nouveau rayon de soleil de ma vie.

Table de matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction générale
Chapitre I : Synthèse Bibliographique
I.1. Le cancer du sein …………………………………………………………………………………………
1
I.1.1. Définition ………………………………………………………………………………………………
1
I.1.2. Epidémiologie …………………………………………………………………………..……………...
2
I.1.3. Facteurs pronostiques …………………………………………………………………………………..
3
I.1.3.1. Facteurs cliniques ……………………………………………………………………………….
3
I.1.3.2. Facteurs anatomopathologiques ………………………………………………………………...
4
I.1.3.3. Facteurs biologiques ……………………………………………………………………………
5
I.1.4. Facteurs de risque ……………………………..……………………………………………………….
8
I.1.4.1. Facteurs de risques hormonaux …………………………………………………………………
8
I.1.4.2. Facteurs de risques génétiques ………………………………………………………..………...
8
I.1.4.3. Facteurs de risques environnementaux …………………………………………………………
9
I.1.5. Mécanismes cellulaires et moléculaires de la carcinogenèse mammaire ……………………………...
10
I.2. Le virus simien 40 (SV40) ………………………………………………………………........................
14
I.2.1. Epidémiologie et transmission du virus SV40 …………………………………………………………
14
I.2.2. Structure et organisation du génome du virus SV40 …………………………………………………..
15
I.2.3. Cycle de réplication du virus SV40 ……………………………………………………………………
15
I.2.4. Pouvoir transformant du virus SV40 …………………………………………………………………..
17
I.2.5. Pathologies associées au virus SV40 …………………………………………………………………..
19
I.3. Le Virus MMTV-like ……………………………………………………………………………………
20
I.3.1. Introduction et caractéristiques du virus MMTV ………………………………………………………
20
I.3.2. MMTV et cancer du sein chez la femme ………………………………………………………………
21
I.3.3. MMTV-like et cancer du sein chez la femme ………………………………………………………….
22
I.4. Les papillomavirus humains (HPV) …………………………………………………………………..
24
I.4.1. Introduction et classification des papillomavirus humains …………………………………………….
24
I.4.2. Structure du virus et organisation génomique …………………………………………………………
24
I.4.2.1. Cadre précoce de lecture: Région E …………………………………………………………….
25
I.4.2.2. Cadre tardif de lecture: Région L ……………………………………………………………….
25
I.4.2.3. Longue région de contrôle: LCR ……………………………………………………………….
25
I.4.3. Physiopathologie de l’infection à papillomavirus ……………………………………………………...
25
I.4.4. Pouvoir oncogène des HPV ……………………………………………………………………………
26
I.4.5. Pathologies associées aux HPV ………………………………………………………………………..
27
I.5. Les herpesvirus humains ……………………………………………………………………………….
29
I.5.1. Introduction et classification des herpesvirus humains ………………………………………………..
29
I.5.2. Structure et organisation du génome des herpesvirus ………………………………………………….
30
I.5.3. Le cycle de réplication virale …………………………………………………………………………..
31
I.5.3.1. Les gènes intervenants dans le cycle de réplication des herpesvirus humains …………………
31
I.5.3.2. Le cycle viral latent ……………………………………………………………………………..
31
I.5.3.3. Le cycle viral lytique ……………………………………………………………………………
32
I.5.4. Pathologies associées aux herpesvirus humains ……………………………………………………….
32
I.6. Epigénétique et cancer …………………………………………………………………………………..
34
I.6.1. La méthylation de l'ADN ………………………………………………………………………………
34
I.6.2. Méthylation de l’ADN et cancers ……………………………………………………………………...
36
I.6.2.1. Hypométhylation globale ……………………………………………………………………….
36
I.6.2.2. Hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeurs …………………………………………
37
I.6.3. Méthylation de l’ADN et virus ………………………………………………………………………...
39
Objectifs et plan du travail ……………………………………………………………………………….....
40

Chapitre II : Techniques générales
II.1. Population d’étude ……………………………………………………………………………………...
42
II.2. Méthodes …………………………………………………………………………………………………
43
II.2.1. Extraction de l’ADN à partir des tissus congelés ……………………………………………………..
43
II.2.1.1. Principe ………………………………………………………………………………………...
43
II.2.1.2. Protocole ……………………………………………………………………………………….
43
II.2.1.3. Analyse de la quantité et de la qualité de l’ADN extrait ………………………………………
44
II.2.2. Amplification d’ADN par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ……………………………...
45
II.2.2.1. Principe ………………………………………………………………………………………...
45
II.2.2.2. Conditions expérimentales ……………………………………………………………………..
46
II.2.2.2.1. Vérification de la qualité de l’ADN obtenu après extraction ………………………….
46
II.2.2.2.2. Mise en évidence de l'ADN du virus SV40 par PCR ………………………………….
47
II.2.2.2.3. Mise en évidence du virus MMTV-like par PCR ……………………………………...
53
II.2.2.2.4. Mise en évidence de l'ADN des papillomavirus humains par PCR …………………..
55
II.2.2.2.5. Mise en évidence de l'ADN des herpesvirus humains par PCR ……………………….
58
II.2.3. Séquençage de l’ADN ………………………………………………………………………………...
59
II.2.3.1. Principe ………………………………………………………………………………………...
57
II.2.3.2. Application du séquençage pour l’analyse de la séquence env du virus MMTV-like amplifiée
par PCR …………………………………………………………………………………………………
60
II.2.4. Immunohistochimie …………………………………………………………………………………...
61
II.2.4.1. Principe ………………………………………………………………………………………...
61
II.2.4.2. Protocole ……………………………………………………………………………………….
62
II.2.5. Hybridation in situ …………………………………………………………………………………….
64
II.2.5.1. Détection de l’EBV …………………………………………………………………………….
64
II.2.5.2. Détection du virus HPV ………………………………………………………………………..
66
II.2.6. Analyse de la méthylation de l’ADN …………………………………………………………………
68
II.2.6.1. Principe ………………………………………………………………………………………...
68
II.2.6.2. Les gènes étudiés ………………………………………………………………………………
70
II.2.6.3. Conditions expérimentales …………………………………………………………………….
71
II.2.6.3.1. Traitement de l’ADN génomique au bisulfite de sodium ……………………………..
71
II.2.6.3.2.Contrôle de la qualité de l’ADN après traitement au bisulfite de sodium ……………..
73
II.2.6.3.3. Analyse de l’ADN traité par PCR spécifique à la méthylation (MSP) ………………..
73
II.2.7. Analyses statistiques ………………………………………………………………………………….
77
II.2.7.1. Association entre deux variables catégorielles ………………………………………………...
77
II.2.7.2. Analyse d’association entre une variable catégorielle et une variable continue………………
77
II.2.7.3. Analyse de la survie ……………………………………………………………………………
77
Chapitre III : Prévalence et caractéristiques clinico-pathologiques des cancers
du sein associés au virus SV40
III.1. Introduction …………………………………………………………………………………………….
78
III.2. Méthodologie …………………………………………………………………………………………...
79
III.2.1. Population d’étude…………………………………………………………………………………….
79
III.2.2. Extraction de l’ADN ……………………………………………………………………..…………..
80
III.2.3. Recherche de l'ADN du virus SV40 par PCR ………………………………………………………..
80
III.2.3.1. Détection de la région de transcription précoce du virus ……………………………………..
80
III.2.3.2. Détection de la région de transcription tardive du virus ……………………………………...
80
III.2.3.3. Détection de la région régulatrice de la transcription virale ………………………………….
80
III.2.3.4. Contrôles positifs et négatifs de la PCR ………………………………………………………
81
III.2.4. Détection des oncoprotéines virales par immunohistochimie ………………………………………..
81
III.2.5. Analyse statistique ……………………………………………………………………………………
82
III.3. Résultats …………………………………………………………………….…………………………...
83
III.3.1. Contrôle de la qualité d’ADN après extraction …………………………..…………………......
83
III.3.2. Détection du virus SV40 par PCR ………………………………………………………………
84
III.3.3. Expression des oncoprotéines t/Tag du virus SV40 …………………………………………….
87
III.3.4. Caractéristiques clinico-pathologiques des cas de cancer du sein associés au virus SV40 …….
89
III.3.5. Valeur pronostic de la détection du virus SV40 ………………………………………………...
91
III.4. Discussion ……………………………………………………………………………………………….
92

Chapitre IV : Corrélation entre la présence du virus SV40 dans le cancer du
sein et l’hyperméthylation des promoteurs des gènes suppresseurs de tumeurs
IV.1. Introduction ……………………………………………………………..……………………………...
97
IV.2. Méthodologie ………………………………………………………..………………………………….
98
IV.2.1. Population d’étude………………………………………………………………………...………….
98
IV.2.2. Traitement de l’ADN génomique au bisulfite de sodium ……………………………………………
98
IV.2.3. Contrôle de la qualité de l’ADN après traitement au bisulfite de sodium …………………………...
98
IV.2.4. Amplification de l’ADN par PCR spécifique de la méthylation (MSP) ……………………………..
99
IV.2.5. Analyse statistique …………………………………………………………………………………...
99
IV.3. Résultats …………………………………………………………………………………………………
100
IV.3.1. Contrôle de la qualité d’ADN après traitement par le bisulfite ……………………………………...
100
IV.3.2. Profil de méthylation de l’ADN ……………………………………………………………………...
101
IV.3.3. Relation entre l’hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeurs et la présence du virus SV40
104
IV.4. Discussion ……………………………………………………………………………………………….
105
Chapitre V : Prévalence et caractéristiques clinico-pathologiques des cancers
du sein associés au MMTV-like en Tunisie
V.1. Introduction ……………………………………………………………………………………………...
118
V.2. Méthodologie …………………………………………………………………………………………….
120
V.2.1. Population d’étude …………………………………………………………………………………….
120
V.2.2. Recherche de l'ADN du virus MMTV-like par PCR …………………………………………………
120
V.2.3. Analyse des séquences du virus MMTV-like détectées par séquençage ……………………………..
120
V.2.3. Analyse statistique …………………………………………………………………………………….
120
V.3. Résultats ………………………………………………………………………………………………….
121
V.3.1. Détection du virus MMTV-like par PCR ……………………………………………………………..
121
V.3.2 Analyse des séquences du virus MMTV-like par séquençage ………………………………………...
122
V.3.3. Caractéristiques clinico-pathologiques des cas de cancer du sein associés au virus MMTV-like ……
124
V.3.4. Valeur pronostic de la détection du virus MMTV-like ……………………………………………….
126
V.4. Discussion ………………………………………………………………………………………………...
127
Chapitre VI : Papillomavirus humains et cancer du sein en Tunisie
VI.1. Introduction ………………………………………………………………………………...…………..
134
VI.2. Méthodologie …………………………………………………………………………….……………..
135
VI.2.1. Population d’étude …………………………………………………………………………………...
135
VI.2.2. Recherche des papillomavirus humains par PCR ……………………………………………………
135
VI.2.3. Recherche des HPV par hybridation in situ ………………………………………………………….
136
VI.3. Résultats ……………………………………………………………………..…………...……………...
137
VI.3.1. Recherche des papillomavirus humains par PCR ……………………………………………………
137
VI.3.2. Détection des papillomavirus humain par hybridation in situ ……………………………………….
140
VI.4. Discussion ……………………………………………………………………………………………….
140
Chapitre VII : Herpesvirus humains et cancer du sein en Tunisie
VII.1. Introduction …………………………………………………………………………………………...
147
VII.2. Méthodologie …………………………………………………………………………………………..
148
VII.2.1. Population d’étude …………………………………………………………………………………..
148
VII.2.2. Recherche de l'ADN génomique des herpesvirus par PCR …………………………………………
148
VII.2.3. Immunohistochimie …………………………………………………………………………………
148
VII.2.4. Hybridation in situ …………………………………………………………………………………..
148
VII.2.5. Analyse statistique …………………………………………………………………………………..
148
VII.3. Résultats ………………………………………………………………………………………………..
150
VII.3.1. Détection des herpesvirus par PCR …………………………………………………………………
150
VII.3.2. Détection des protéines virales LMP-1 et ZEBRA par immunohistochimie ……………………….
151
VII.3.3. Détection du génome de l’EBV par hybridation in situ …………………………………………….
151
VII.3.4. Caractéristiques clinico-pathologiques des cas de cancer du sein associés à la présence de l’ADN
génomique de l’EBV …………………………………………………………………………………………
151
VII.3.5. Valeur pronostic de la détection des herpesvirus humains ………………………………………….
154
VII.4. Discussion ………………………………………………………………………………………………
155
163