Session5 - Club Exocytose

Regulation of SNARE function by Complexins
Nils Brose.
Max-Planck-Institut für Experimentelle Medizin, Abteilung Molekulare Neurobiologie,
Göttingen, Germany.
Git1 : a bridge between Arf6 and Rac1, is involved in regulated exocytosis
Nicolas Vitale, Sylvette Chasserot-Golaz and Marie-France Bader (CNRS UPR-2356
Strasbourg).
CNRS UPR-2356 Strasbourg.
Neuroendocrine cells release hormones and biologically active peptides by exocytosis, a
highly regulated process in which secretory granules fuse with the plasma membrane to
release their contents in response to a calcium trigger. We have recently described that the
granule-associated ARF6 GTPase plays a crucial role in hormonal release in chromaffin and
PC12 cells, presumably by regulating lipid modifying enzymes and therefore promoting the
fusion reaction between the two membrane bilayers. The exchange factor ARNO was shown
to be involved in the ativation process of ARF6 during cell stimulation. We show here that
overexpression and microinjection of recombinant GIT1, a GTPase-activating protein (GAP)
for ARF6, inhibited exocytosis from PC12 and chromaffin cells. This effect was completely
abolished when the ARF-GAP activity of GIT1 was impaired. Additionally, immunostaining
experiments revealed that the diffuse cytosolic GIT1 distribution relocated to the periphery of
the cell during stimulation. A pull-down assay for GTP-bound ARF6 showed that the
exchange factor ARNO and GIT1 directly regulate the GDP/GTP cycle of ARF6 during cell
stimulation. Using several means, we also found that GIT1 was part of a macromolecular
complex including the exchange factor bPIX, the tumor suppresor factor hScrib and the
GTPase Rac1. We found that hScrib is required to anchor bPIX at the cell cortex and that
dominant-negative bPIX, Rac1 or hScrib proteins can each inhibit Ca2+-dependent exocytosis
in neuroendocrine PC12 cells, demonstrating a functional relationship between these proteins.
Our results provide the first direct evidence that GIT1 plays an important function in
neuroendocrine exocytosis, most likely by controlling the activation level of ARF6 and
potentially by modulating Rac1 activity.
Session 5 - Club ExoEndo 2004

Rôle de Rab27a et Munc13-4 dans l’exocytose des granules lytiques des
lymphocytes
Jérôme Feldmann(1), Gaël Ménasché(1), Isabelle Callebaut(2), Graça Raposo(3), Françoise
Le Deist(1), Alain Fischer(1), Geneviève de saint Basile(1).
(1)INSERM U 429, Hôpital Necker, 75015, (2)LMCP CNRS UMR7590, Pari6&7, 75005,
(3)CNRS-UMR144, 75005.
La fonction cytotoxique des lymphocytes, qui utilise la voie de sécrétion des granules
lytiques, joue un rôle primordial dans notre organisme en permettant l’élimination des cellules
infectées par un virus et des cellules tumorales. Après reconnaissance entre un lymphocyte T
et une cellule cible, les granules lytiques des lymphocytes se trouvent polarisés avec le MTOC
et l’appareil de Golgi vers le point de contact entre les deux cellules, la synapse
immunologique, puis libèrent leur contenu dans une fente synaptique formée transitoirement
entre les deux cellules. Les protéines lytiques comme la perforine et les granzymes A et B,
stockées dans ces granules, agissent alors sur la cellule cible et déclenchent sa mort par
apoptose. Une anomalie de la fonction cytotoxique des lymphocytes conduit à une
dérégulation de l’homéostasie lymphocytaire, fatale chez l’homme, comme observée dans le
syndrome de Griscelli ou la lymphohistiocytose familiale. La caractérisation des défauts
moléculaires responsables du défaut cytotoxique des lymphocytes dans ces deux pathologies,
a permis d’identifier deux effecteurs indispensables à l’exocytose des granules lytiques,
respectivement Rab27a(1) et Munc13-4(2). Rab27a est une petite protéine GTPase capable de
s’associer aux granules lytiques des lymphocytes. Un défaut de Rab27a n’affecte pas la
polarisation des granules lytiques, mais est associé à un défaut d’arrimage des granules à la
membrane plasmique, au site de sécrétion de la synapse immunologique. Munc13-4 est
également un effecteur indispensable à l’activité cytotoxique des lymphocytes. Contrairement
aux autres membres de la famille Munc13 principalement exprimés dans le cerveau, Munc13-
4 est exprimé majoritairement dans les cellules du système immunitaire. Un défaut de
Munc13-4 résulte en un défaut d’exocytose du contenu des granules cytotoxiques, malgré une
polarisation effective de ces granules et leur arrimage à la membrane plasmique au niveau de
la synapse immunologique. Munc13-4 agit à une étape d’amorçage de la sécrétion des
granules cytotoxiques, qui précède immédiatement la fusion de la membrane vésiculaire avec
la membrane plasmique. Par contre la voie de sécrétion constitutive des lymphocytes utilisée
pour la sécrétion des cytokines n’est pas affectée par un défaut de l’une ou l’autre de ces
protéines. Avec la mise en évidence récente d’une interaction directe possible entre Rab27a et
Munc13-4(3), les bases moléculaires de la voie d’exocytose régulée des granules lytiques
commencent à être décryptées.
1. Ménasché, G. et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome
associated with hemophagocytic syndrome. Nature Genet 25, 173-176 (2000).
2. Feldmann, J. et al. Munc13-4 is essential for cytolytic granules fusion
and is mutated in a form of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis
(FHL3). Cell 115, 461-73. (2003).
3. Shirakawa, R. et al. Munc13-4 is a GTP-Rab27-binding protein regulating
dense core granule secretion in platelets. J Biol Chem 279, 10730-7 (2004).
Session 5 - Club ExoEndo 2004