Département de Médecine Faculté de Médecine

Département de Médecine
Faculté de Médecine
COURS de BIOLOGIE MOLECULAIRE
Pr N.Ait Hammou.
PLAN.
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-Structure des Acides Nucléiques.
-Chromatine.
-Réplication de l’ADN.
-Réparation de l’ADN.
-Transcription de l’ADN.
Traduction de l’ADN.
-Régulation de l’expression des gènes.
Virus
Génome court
ADN ou ARN ,
protégé par des
protéines et
éventuellement entouré
d’une membrane.
Procaryote.
• Un chromosome formé
d’ADN circulaire de plus
ou moins grande taille
dans le cytoplasme.
Eucaryote
• ADN présent dans une
organelle spécialisé le
noyau
Sa stabilité
• Trois types de force contribuent à la
stabilité de l’ADN :
• lien P dans les côtés
• lien H entre les bases
• hydrophobe (bases azotés) et hydrophiles (gr. P
+ sucre)
Ses Fonctions
• Sa principale fonction est de stocker l’information génétique.
Cette information est contenue dans l’enchainement non
aléatoire de nucléotides.
• Une autre fonction essentielle de l’ADN est de transmettre
l’information de génération en génération de manière fidèle:
c’est ce qu’on appelle l’ hérédité
• L’information portée par l’ ADN peut se modifier au cours du
temps par des erreurs au cours de la réplication des
séquences d’ADN lors de la division cellulaire.
C’est un des moteurs de l’évolution.
ADN des êtres vivants
Différence
eucaryotes(E)/procaryotes(P).
-ADN isolé(E)
-Non isolé (P) du cytoplasme par
1 membrane nucléaire.
PlusieursmoléculesE(chromosom
es)
-1 seule molécule (P).
-Forme linéaire(E)/circulaire(P).
-Nombres de nucléotides:
Des milliards(répartis sur
plus.mol)(E)
Des milliers chez les P.
Similitude
eucaryotes/procaryotes.
- Structure commune:
enchainements de nucléotides.
-Bicaténaire (sauf pour qq virus).
-Séquence de bases caractéristiques de
chaque molécule d’ADN.
ADN Mitochondrial:
2 brins, circulaire.
Code pour les ≠ ARN nécessaire à la
∑ des prot de la chaine respiratoire.
Hérédité cytoplasmique et
maternelle.(Maladie mit transmise
par la mère)
Différents types et état des ADN
• L’ADN bactérien:
• Il correspond à l’ADN des procaryotes.
-non contenu dans un noyau pourvu d’enveloppe nucléaire.
-ADN=1 seule molécule.
-circulaire.
-bicaténaire.
-structure très condensée.
Ex: E.coli: ADN=4. 106 p.b,3109 Da; 1,36mm dans une bactérie
d’environ 5 µm de long.
Structure en superhélices avec des torsades négatives.
L’ ADN mitochondrial.
•
Les mitochondries des cellules eucaryotes
contiennent:
- 4à6 molécules d’ADN.
- bicaténaire et circulaire.
- de composition nucléotidique différente de
celle du noyau.
- avec un taux de GC faible.
L’ADN des plasmides.
• Plasmides= éléments génétiques extrachromosomiques
présents chez de nombreuses bactéries,
porteurs de gènes et capable d’autoreproduction.
•
A D N= bicaténaire, circulaire et de taille variable.
L’ADN viral
• Les virus ne comportent pas tous de l’ADN
(certains virus portent de l’ARN)
• La structure la plus courante de l’ADN des virus à
ADN : bicaténaire et circulaire
Mais il existe aussi des virus à
• ADN monocaténaire circulaire (phage X174
d’E.coli)
• ADN circulaire ou linéaire selon le stade de son
développement (phage λ) car possède des
extrémités monocaténaires complémentaires
permettant la cyclisation.
Hydrolyse chimique des Acides Nucléiques
-Les ADN résistent aux Ph basiques: par ex , à Ph 13et à 37 °c on a une
dizaine de coupures de ponts phosphodiester par millions de ponts.
-Les ARN sont totalement hydrolysés en leur ribonucléotides en qq min à
37 °C et à Ph 11 .C’est la présence de l’hydroxyle libre en 2’ qui permet
cette hydrolyse qui donne un intermediaire cyclique 2’3’P aboutissant à
des nucléotides 2’P ou 3’P
Hydrolyse enzymatique des Acides Nucléiques
• Ce sont phosphodiestérases spécifiques appelées nucléases
• Elles présentent des niveaux de spécificité et sont classées par :
• -leur mode d’attaque de la chaine : extrémité (exo) ou intérieur (endo)
• -leurs spécificité vis-à-vis du substrat : ADN, ARN ou les deux et de la
structure, simple ou double brin
• - leur spécificité de reconnaissance des sites : bases ou leur
enchaînement
• -le type de coupure de la liaison phosphodiester
Hydrolyse enzymatique des Acides Nucléïques
• Exonucléases: libèrent par hydrolyse le nucléotide situé à
l’extrémité 5’ ou 3’
• Endonucléases: hydrolysent une liaison ester interne.
Hydrolyse enzymatique des Acides Nucléiques
Endonucléases de restriction
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Origine
Système de protection des bactéries
Spécifiques et d’une séquence de 4 à 10 nucléotides
le site est palindromique
Nomenclature
Escherichia coli R y13
EcoR I : 1ère enzyme trouvée chez E. coli
EcoR V : 5ème enzyme trouvée chez E.coli
Hydrolyse enzymatique des Acides Nucléiques
• COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex : EcoRI
↓
5’ ……..G A A T T C ………3
5’…………..G AATTC …………..3’
3’………C T T A A G ……….5’
3’…………..CTTAA G……………5’
↑
• COUPURES A BOUTS FRANCS (B LUNT ENDS) ex : Sma I
↓
5’………C C C G G G………..3’
5’…………..C C C
G G G ………..3’
3’………G G G C C C………..5’
3’…………...G G G
C C C………….5’
↑
Les ARNs.
• ARNm:
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2à3% copie d’une séquence (information pour 1protéine)
Transfère l’information du noyau au cytoplasme.
Synthétisé dans noyau:transcrit primaire,taille très variable.
Mature dans le cytoplasme.
Durée de vie très courte qq min à qq jours.
Décodés par ribosomes:synthèse protéique.
Décodés plusieurs fois par ribosomes puis dégradés.
ARNr:
Les ARN ribosomiques s’associent aux protéines et forment les ribosomes avec deux types de
sous unité (grande et petite )complexes nucléoprotéiques colossaux de 300000 atomes
•
Organisme Caractéristiques Petite Sous Unité Grande Sous Unité
ou organite
________________________________________________________________________________
Procaryotes
70 S
30 S
1 ARN
50 S 1 ARN
ribosomique 16 S
ribosomique 5S
Mitochondries
1540 nucléotides
120 nucléotides
1ARNribosomique
23S 2300 nucléotides
Chloroplastes
21 protéines
34 protéines
Eucaryotes
80 S
40 S 1 ARN ribosomique 60 S 1 ARN ribosomique
18 S 1869 nucléotides
5 S 121 nucléotides
1 ARN ribosomique
33 protéines
5,8S 156 nucléotides
1 ARN ribosomique
28 S 5070 nucléotides
49 protéines
S est le symbole du Svedberg unité de mesure du taux de sédimentration
ARNt:
Caractéristiques des tRNA.
• Tige ou bras accepteur
• :Le trinucléotide terminal en 3’
est toujours 5’CCA3’
• Fixe l’AA par le OH en 2’ ou 3’ du
ribose de l’adénine de l’extrémité
3’ au groupement COOH de l’AA
• L’extrémité 5’ est toujours
phosphorylée
• La tige est en double hélice par
appariement de 7 pb
• Boucle et tige anticodon :
• Anticodon = 3 bases de l’ARNt
complémentaires du codon de
l’ARNm correspondant à l’AA
porté par l’ARNt
Caractéristiques des tRNA.
• Boucle et tige D :
“D”= dihydrouridine
• Bras TYC :
Contient séquence : thyminepseudouridine-cytosine
• Boucle variable :
Contient plus ou moins de
nucléotides pour compenser le
fait que les ARNt n’ont pas tous le
même nombre de nucléotides
mais ont la même structure
(basée sur 76 nt).
Organisation de l’ADN en chromatine
Réplication du DNA.
Réplication du DNA.
ADN polymérase III de E. coli
Analyse de l’ADN: Southern blot
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Un transfert d'ADN1 est une méthode de biologie moléculaire permettant
l'analyse de l'ADN: Nous partons des fragments d'ADN obtenus par les enzymes de
restriction.
Les fragments d'ADN sont placés dans les puits d'un gel d'électrophorèse (gel
d'agarose à faible concentraon → 0,6 à 0,8 %).
Le gel est alors mis dans une cuve horizontale contenant une solution tampon et
deux électrodes (+ et -). On procède alors à une migration en mettant le courant
(90 mV pendant une heure).
Une fois la migration effectuée, on trempe le gel (contenant les fragments d'ADN)
dans une solution de bromure d'éthidium (BET).
Révélation des fragments d'ADN sous rayons UV.
Le gel d'électrophorèse est ensuite trempé dans une solution alcaline (contenant
habituellement de l'hydroxyde de sodium ou plus communément "soude") afin de
permettre la dénaturation de l'ADN bicaténaire (séparation de l'ADN double-brin
en simple-brin).
Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou encore en nylon) est placée
sur le gel. Une pression est appliquée au gel . L'ADN va se fixer sur la
membrane.
La membrane est alors chauffée, dans le cas de nitrocellulose
(formation de liaisons covalentes entre l'ADN et la membrane).
La membrane est mise en contact avec une sonde spécifique de la
séquence d'ADN recherchée ( fragment d'ADN complémentaire de la
séquence ciblée ). La sonde est au préalable marquée de sorte qu'elle
puisse être détectée, par incorporation de radioisotopes Dans certains cas,
la sonde peut être faite à partir d'ARN, plutôt que d'ADN.
Après hybridation, la sonde en excès est éliminée de la membrane par
différents lavages, et l'hybridation est visualisée par autoradiographie, dans
le cas d'une sonde radioactive .
Analyse de l’ADN
PCR
• amplification en chaîne par polymérase ou réaction en chaîne par
polymérase (PCR est l'abréviation anglaise de polymerase chain
reaction,) est une méthode de biologie moléculaire d'amplification
génique in vitro, qui permet de dupliquer en grand nombre (avec un
facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence
d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (de l'ordre
de quelques picogrammes) d'acide
nucléique (séquence spécifique d’ADN nucléique et d'amorces
spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25
nucléotides). On peut ainsi, par exemple, détecter la présence du
virus VIH ou mesurer une charge virale (concentration du virus dans
le plasma), des traces d'OGM (organismes génétiquement
modifiés), ou encore des virus d'hépatites B, C et D.
- La mutation est une modification héritable de la séquence du génome.
.
- Les mutations permettent l’évolution de l’espèce mais elles sont aussi
responsable d’un grand nombre de maladies.
Additions ou délétions de bases:
Si l’addition ou la délétion de bases n’est pas un multiple de 3, il y aura un
décalage de lecture(frame-shi)→addion ou déléon d’ Aa au niveau de la
protéine.
Substitution de bases:
La transition= remplacement d’1 purine par 1 purine ou d’1 pyr par 1 pyr.
La transversion= remplacement d’1 purine par 1 pyr et inversement.
-Les mutations entraînant le changement d’acides aminés sont des mutations
faux-sens.
-Quand la mutation n’ entraîne pas le changement d’acides aminés :on
parle de mutation silencieuse.
-Lorsque la substitution entraîne l’apparition d’un codon stop (UAA ,UGA et
UAG)
on parle de mutation non -sens.
Réparation de l’ADN
Réparation de l’ADN.
Types de réparation
1- Réversion directe de l’altération
- Dimères de pyrimidine : Action de la photolyase
- Méthylation des guanines : action d’une enzyme spécifique
Réversion directe:
• Photoréactivation: les photolyases coupent les liaisons covalentes au niveau
des dimères de thymine.
• Réversion de coupure de simple brin: action d’une ligase.
• Réversion de dépurination par une purine insertase: restaure la liaison
osidique.
Réparation des mésappariements du à une
erreur de l’ADN polymérase :
chez les procaryotes il existe un système multi
enzymatique comprenant
une endonucléases associée à une exonucléase
bidirectionnelle (3’5’ et 5’3’),
à une ligase et à une ADN pol III.
Réparation par excision de nucléotides
(NER)
• Mécanisme présent chez les procaryotes et les eucaryotes: il permet la
réparation de plusieurs nucléotides.
• Il prend en compte une endonucléase 3’-5’, l’ADN pol I et l’ADN ligase.
• Le système NER correspond au mécanisme de réparation par les UV( Uvr).
Réparation par excision de nucléotides
(NER)
Coupure du double brin
Système SOS
• Le système SOS fonctionne comme un système de type opérateur.
– Il exite 2 états qui utilise nt ou non les protéines Rec A: protéines clé
de la recombinaison procaryote:
– Un état non induit sans Rec A
– Un état induit avec Rec A
– Les différents gènes participant au système SOS forment un régulon
qui est un groupe de gènes dont l’expression est contrôlée par une
protéine.
Système SOS
Système SOS