extraction de la cellule dendritique splenique du rat sain

J. sci. pharm. biol., Vol.8, n°2 - 2007, pp. 72-78
© EDUCI 2007
DASSE S. R.1,
AKRE D.P.2,
N’GUESSAN K.1,
SOMBO M. F.1,
JAMAL K.3
EXTRACTION DE LA CELLULE DENDRITIQUE
SPLENIQUE DU RAT SAIN PAR LA TECHNIQUE DE
DOUBLE SELECTION UTILISANT L’ANTICORPS OX62.
RESUME
L’obtention en grand nombre des cellules
dendritiques a été faite souvent grâce
aux techniques de culture cellulaire à
cause de sa rareté dans l’organisme. Pour
étudier cette cellule dans son milieu naturel,
des techniques d’extraction basées sur la
sélection positive en fonction d’un marqueur
exprimé ont été utilisées avec des résultats
souvent en deçà des espérances. L’objectif de
cette étude était d’extraire au moins 80% de
cellules dendritiques de la rate chez le rat sain
par la technique de double selection utilisant
l’anticorps OX62.
Cette étude expérimentale a été menée
chez trois rats Fischer F344 en utilisant la
technique de double sélection en fonction du
gradient de densité et de l’expression de l’αE2
intégrine reconnue par l’anticorps OX62. La
purification a été contrôlée en microscopie
optique. La proportion de cellules a été
évaluée en cytométrie de flux.
Cette technique nous permis d’extraire
89,19% de cellules spléniques de grande
taille, de basse densité qui sont OX62high ,
pourvues de prolongements cytoplasmiques
qui sont les cellules dendritiques. Une
proportion assez faible de cellules OX62low ;
ces cellules qui n’ont morphologiquement
pas les mêmes caractéristiques que les
précédentes peuvent être assimilées aux
lymphocytes T γς.
Ces données permettent de conclure
que même si l’α3 intégrine n’est pas
spécifique de la cellule dendritique du rat,
la technique de purification de cette cellule
en fonction de l’expression de ce marqueur
peut être utilisée pour son extraction.
Mot-clés : Cellules dendritiques, OX62,
Double sélection
SUMMARY
Because of its rarity in tissues, dendritic
cell achievement usually requires overnight
culture. Selection methods according to
marker expressed on the cell has been
used to study dendritic cell in its natural
environment but results are not sometimes
exploitable. Here we used the double sorting
method according to density gradient and
1 Laboratoire d’Immunologie, CHU de Cocody Abidjan, Côte d’ivoire
2 Laboratoire d’Immunologie, CHU de Bouaké, Côte d’Ivoire
3 Institut Pasteur de Lille, INSERM U547, France
Correspondance : DASSE SERY ROMUALD, BP V13 Service d’Immunologie et Hématologie, CHU Cocody,
Abidjan - Côte d’Ivoire, Tél : 00(225) 08 98 44 68 E-mail : [email protected]
αE2 integrin expression on rat dendritic cell,
controlled by FACS and morphologically
to extract dendritic cells splenic in Fischer
F744 rats.
The results revealed in the final
suspension 89,19% largest cells of low
density OX62high provided with dendrites.
These characteristics identify dendritic
cells. Otherwise, FACS control shows a
low proportion of cells probably the Tγδ
expressing lowly αE2 integrin.
All these allowed to conclude that even
if αE2 integrin could not consider specific
marker of rat dendritic cell, it can be used
for its purification.
Key words : Dendritic cells, OX62,
Double sorting method.
INTRODUCTION
La cellule dendritique (DC ou «dendritic
cell») est la cellule présentatrice d’antigène
professionnelle. Elle joue un rôle clé dans
la réponse immunitaire. Ses fonctions sont
essentiellement la captation et préparation
de l’antigène, la présentation de celui-ci sous
forme de peptides aux cellules T et l’orientation
de la réponse adaptative en fonction du type
d’antigène vers un profil Th1 ou Th2 . Au plan
phénotypique, la DC présente une grande
hétérogénéité. Chez le rat, la majorité des DC
exprime l’intégrine CD103 ou αE-intégrine
reconnue par l’anticorps monoclonal OX62
[BRENAN 1992].
La purification de cette cellule et son
obtention en grand nombre ont été toujours
difficiles du fait de sa rareté et sa dispersion
dans l’organisme. Ceci a été longtemps un
obstacle à son étude. Depuis dix ans, des
techniques efficaces de culture in vitro à
partir de pro géniteurs hématopoïétiques
et de leurs précurseurs sanguins ont été
développés [DAKIS 2003, TRAVER 2000].
Ces approches ont permis d’apprendre des
connaissances déterminantes sur la biologie
de cette cellule [BANCHEREAU 2000].
Cependant, un besoin de plus en plus
impérieux d’isoler un grand nombre de
cellules dendritiques in vivo s’est fait
sentir. Il est guidé par le souci de mieux
comprendre le comportement de cette
cellule dans son milieu naturel face à une
agression extérieure. Parmi les techniques
développées récemment, on peut citer la
méthode de double sélection [CÉCIL 2002,
TRINITÉ 2000]. Elle est basée d’une part, sur
la sélection des cellules en fonction de leur
gradient de densité et d’autre part, sur le tri
des cellules exprimant le CD103 (cellules
OX62+) parmi les cellules de basse densité.
Cette technique assez simple a l’inconvénient
majeur de donner des faux négatifs et ou
une suspension cellulaire assez pauvre. La
perte cellulaire est due aux différents lavages
et à l’adhérence des macrophages au verre.
Cependant sa maîtrise parfaite peut donner
de très bons résultats estimés à plus de 80%
de cellules dendritiques dans la suspension
cellulaire finale.
L’objectif de cette étude était d’extraire
par cette technique, au moins 80% de
cellules dendritiques de la rate du rat sain
en vue d’étudier leur profil phénotypique
et cytokinique.
MATERIEL ET METHODE
Nous avons effectué une étude
expérimentale pendant 2 semaines à
l’Institut Pasteur de Lille (France) sur
une population de 3 rats Fischer F344
de 4 à 8 semaines achetés au centre
d’élevage HARLAN (en Hollande). Les
cellules dendritiques ont été purifiées par
la technique de la double sélection en
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réalisé avec le cytomètre de flux Facscalibur™
de Becton Dinkinson utilisant le logiciel Cell
Quest™ et un dispositif MACS (Magnetic
Cell Sorting) de tri cellulaire du laboratoire
Miltenyi Biotec composé de LS Columns
(capacité de 108 cellules marquées maximum
sur un total de 2 109 cellules). Deux fractions
de suspension cellulaire ont été recueillies :
l’une contenant des cellules OX62+, l’autre
avec des cellules OX62-.
fonction de la densité cellulaire et de
l’expression du marqueur CD103. (Phase
avant Nycodenz).
La rate a été d’abord écrasée et digérée
dans la collagénase D (clostridiopeptidase du
laboratoire Roche, Réf. 70028621). Ensuite,
la suspension cellulaire a subit un premier
tri dans la solution de Nycodenz, en fonction
de la densité des cellules. Ceci a permis de
sélectionner les cellules de faible densité
(cellules de grande taille avec un faible rapport
nucléo cytoplasmique) ; c’est la phase après
Nycodenz. Cette suspension de cellules de
faible densité contenant entre autres les
cellules dendritiques a subit une deuxième
sélection. Les cellules ont été trié en fonction
de l’expression de la chaîne αE de l’intégrine
CD103 grâce à l’utilisation de l’anticorps
OX62 ou anti CD103 (Isotype IgG1, de clone
OX62 marqué à la biotine succimide de
CALBIOCHEM, Réf. 130-090-663). Ce tri a été
La pureté de l’extraction de la cellule
dendritique dans les quatre suspensions
cellulaires (Avant Nycodenz, après
Nycodenz, OX62+, OX62-) a été vérifiée à
l’objectif 100 avec le microscope binoculaire
de marque LEITZ.
L’enrichissement en cellules dendritiques
de la suspension OX62+ a été apprécié
au cytomètre de flux qui a déterminé
le pourcentage de cette cellule dans la
suspension finale.
RESULTATS
presque le même. Il y a une faible proportion
de cellules OX62+ dans l’ensemble des
cellules nucléées spléniques.
Le tableau I présente les résultats de
l’extraction de la cellule dendritique par
la méthode de double sélection. Pour les
trois expériences, le nombre absolu de
cellules spléniques dans chaque fraction
de suspension cellulaire et le pourcentage
de cellules dendritiques OX62+ par rapport
aux cellules spléniques de départ est
Ces chiffres sont les résultats de 3
séries d’expérience de purification de la
cellule dendritique splénique d’un rat par
expérience.
Tableau I : Résultats d’extraction des cellules OX62+ chez le rat sain
Fraction cellulaire (Nombre absolu en x
106 de cellules)
Rat 1
Rat 2
Rat 3
Moyenne
Cellules avant Nycodenz
199,99
230
184,74
204,83
Cellules après Nycodenz
88,15
90,7
89,65
89,48
(43,68%)
Cellules OX62-
78,15
66,2
74,15
72,78
Cellules OX62+
7
5,61
7,51
6,19
5,60
4,01
6,2
5,29
Pourcentage de cellules OX62+ (%)
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La figure 1 présente l’aspect des cellules
observées au microscope. La figure 1a
montre le polymorphisme morphologique
des cellules avant le tri en fonction de la
densité cellulaire. Après cette première
sélection, la grande majorité des cellules
observée (figure 1b) étaient de grande taille
avec un rapport nucléo cytoplasmique faible
(1a) Cellules avant nycodenz
(1c) Cellules OX62-
mais en nombre relativement important.
Les cellules OX62- sont présentées sur la
figure 1c ; elles sont en majorité de grande
taille avec un rapport nucléo cytoplasmique
grand. Les cellules OX62+ (figure 1d) sont
essentiellement de grandes cellules avec
quelques expansions cytoplasmiques et un
rapport nucléo cytoplasmique faible.
(1b) Cellules après nycodenz
(1d) Cellules OX62+ (cellules dendritiques)
Figure 1 : Aspect morphologique des cellules des différentes fractions lors de la purification (x100)
La figure 2 décrit les quatre fractions
cellulaires obtenues au tri par cytométrie
en flux. Parmi toutes les cellules
nucléées spléniques 4,58% de cellules
reconnaissaient l’anticorps OX62. La
sélection par Nycodenz a permis d’enrichir
la suspension en cellules dendritiques
(OX62+) ; le pourcentage de 26,32% a été
calculé par rapport à toutes les cellules
de cette fraction. Cependant, quelques
cellules OX62+ ont échappé à la deuxième
sélection, qui contient en grande partie des
cellules OX62-.
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Figure 2 : Contrôle de la purification en cytométrie de flux
DISCUSSION
La cellule dendritique est une cellule rare
dans la population des leucocytes [TRINITÉ
2000], dans les tissus périphériques [YRLID
2003]. Son étude a toujours nécessité
la méthode de culture qui favorise sa
maturation [STEINMAN 1973]. Cette
méthode a l’avantage de n’obtenir que les
cellules dendritiques dans la suspension
à étudier. Cependant, elle ne permet pas
d’apprécier le comportement de cette cellule
in vivo. C’est pour l’étudier dans son milieu
naturel qu’il s’est avéré nécessaire de l’isoler
fraîchement en se basant sur l’expression
de la molécule αE2 intégrine (le CD103)
reconnue par l’anticorps OX62 [BRENAN
1997] et exprimée spécialement par la cellule
dendritique du rat [BRENAN 1992].
Les résultats de la méthode de double
sélection globalement analysés a montré
une moyenne de 6,19.106 cellules, soit
5,29% de cellules OX62+ de la population
totales de cellules leucocytaires spléniques.
Ce chiffre représente la moyenne des trois
expériences avec une rate par expérience.
Par comparaison, le pourcentage de
cellules dendritiques rapporté par les
différents travaux est compris entre 1 et
2% [CROWLEY 1990, KLINKER 1990,
BRENAN 1992], inférieurs aux nôtres.
En effet cette intégrine exprimée par 80%
des cellules dendritiques spléniques du
rat [TRINITÉ 2000] est aussi retrouvée
chez d’autres types cellulaires tels que
les lymphocytes Tγς qui peuvent prendre
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la taille d’un lymphocyte LGL (LARGE
GRANULAR LYMPHOCYTE) [BRENAN
1992, BRENAN 1997]. Il y avait donc
certainement encore ce type cellulaire
présent dans notre suspension finale
malgré le double filtre représenté par
les deux sélections, surtout que cette
méthode ne permet pas d’identifier la faible
expression du marqueur CD103 au niveau
de ces cellules. Ceci pourrait expliquer la
légère surestimation du taux de cellules
OX62+ (5,29%) dans notre suspension
cellulaire finale.
L’analyse par fraction cellulaire a montré
que la suspension «Avant Nycodenz»
contenait les cellules de la lignée blanche
de différentes densités. On en dénombre
204,83.10 6 . Nous avons montré le
polymorphisme morphologique des cellules
de cette suspension où un nombre assez
faible de cellules OX62+ a été observé.
Cette fraction a subi la première sélection
faite en fonction du gradient de densité
grâce à la solution de Nycodenz.
Les cellules de basse densité sélectionnées
(«Fraction après Nycodenz») représentaient
en moyenne 89,48 10 6 cellules, soit
43,68% des leucocytes. Cette proportion
comprenait des cellules dont le rapport
nucléo cytoplasmique est faible: ce
sont les monocytes/macrophages, les
cellules dendritiques et les lymphocytes
dits LGL et même les polynucléaires.
L’aspect morphologique de ces cellules de
grande taille était majoritaire dans cette
suspension, comparativement à celui
des cellules de petite taille avec le noyau
occupant la presque totalité du cytoplasme
prédominaient. Le contrôle en cytométrie
après immuno phénotypage en fonction
du marqueur OX62 a permis d’identifier
deux sous populations cellulaires dans
cette fraction: l’une OX62- et l’autre
OX62+ représentant le 1/3 des cellules de
basse densité. C’est cette population qui
comprenait outre les cellules dendritiques,
des cellules CD3+CD103+ identifiées
par Brenan comme les lymphocytes T γς
[BRENAN 1992, BRENAN 1997].
Après la deuxième sélection (en fonction
de l’expression du CD103) qui a été soumise
à la suspension de cellules de basse densité
(«Fraction après Nycodenz»), la majorité
des cellules soit 72,78.106 cellules sur
89,48.106 était OX62- avec une morphologie
type grande cellule à noyau arrondi et un
cytoplasme visible ; pour quelques cellules
ce cytoplasme est en couronne. La minorité
de cellules (6,19 106) était OX62+.
Ces deux suspension cellulaires (OX62+
et OX62-) ont été soumises au contrôle en
cytométrie de flux. La fraction OX62- a
montré trois sous populations en fonction
du marqueur CD103: une population
OX62low relativement forte reconnue OX62+
par la technique de double sélection et
une très faible autre OX62high. Ce sont
ces deux populations cellulaires qui
pourraient être à l’origine du taux de
5,29% de cellules dendritiques isolées
par la méthode de double sélection; Cette
distribution du marqueur OX62 observée
sur l’histogramme montre qu’il existe
un type cellulaire capable d’exprimer
faiblement l’αE2 intégrine [BRENAN
1992, BRENAN 1997]. Cette cellule est
différente de la cellule dendritique avec
une grande taille, un noyau réniforme
qui laisse visible un large cytoplasme qui
émet des expansions [STEINMAN 1973]. La
troisième sous population n’exprimant pas
le CD103 (OX62-) était majoritaire.
Quant à la fraction OX62+, son contrôle
en cytométrie de flux montre que cette
suspension est composée à 89,16% de
cellules OX62high dont la morphologie est
décrite ci dessus. Ce degré de pureté de la
suspension finale en cellules dendritiques
montre que même si l’α3 intégrine n’est
pas exclusivement exprimé par la cellule
dendritique du rat, elle peut être utilisée
pour isoler cette cellule [STEINMAN 1973,
NUSSENZNEIG 1981, BRENAN 1992].
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CONCLUSION
Le marqueur OX62 n’est certainement
pas spécifique de la cellule dendritique
du rat car certains lymphocytes Tγς sont
OX62+. Cependant, la technique basée sur
la double sélection en fonction d’une part
du gradient de densité et d’autre part de
l’expression du marqueur OX62 que nous
avons utilisée nous a permis de purifier
89,16% des cellules dendritiques du rat
sain. Cette méthode d’extraction pourra
permettre d’étudier cette cellule fraîchement
obtenue, dans son milieu naturel face à des
agressions extérieures car elle est reconnue
être à l’interface entre l’immunité naturelle
et l’immunité spécifique.
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