Typages moléculaires en sélection avicole.

TYPAGES MOLECULAIRES EN SELECTION AVICOLE
fixier-Boichard Michèle
INRA, Laboratoirede GénétiqueFactorielle,78 352Jouy-en-Josas
Cedex
Résumé
Les outils de la biologie moléculairepermettentd'identifier les individus porteurs d'un gène donné quels que
soient leur âge, leur état physiologique ou leur sexe. Parmi les gènesmajeurs déjà connus chez le poulet, deux
exemples sont immédiatement accessiblesau sélectionneuravicole : dans le cas du gène de nanisme lié au sexe
(dw), un typage moléculaire du gène du récepteur à l'hormone de croissancepermet d'identifier directement la
mutation responsabledu nanisme et de détecter facilement les porteurs hétérozygotesapparcmment normaux;
dans le cas du gène lié au sexe de réduction de la vitesse d'emplumement (I9, un typage moléculaire permet
d'identifier un gène viral endogène(ev2l) lié de façon très étroite avec le gène K, de rechercherdes recombinants
éventuelset de mieux comprendre la structurede ce locus complexe. Dans les deux cas, le typage a évolué d'une
méthode relativement lourde (RFLP) vers un test plus rapide (amplification PCR). Ces tests de dépistagepeuvent
être une aide précieuse lors de certaines étapes cruciales dans un schéma de sélection. Dans I'avenir, le
développement des programmes de cartographie du génome devrait augmenter considérablementle nombre de
gènesd'intérêtéconomiquequi serontaccessibles
par ces méthodes.
Abstract
Molecular typing in poultry breeding
Molecular biology offers a wide range of tools in order to identify the carriers of a given gene, whatever the age,
physiological conditions or sex of the animals studied. Among major genes already known in the chicken, two
exemples are immediately available to the poultry breeder. In the case of sex-linked dwarfism (dw), molecular
typing of the growth hormone receptor gene directly shows the mutation responsible for the dwarfrsm and
provides an easy identification of heterozygouscarriers which are phenotypically normal. In the case of sexlinked late-featheringmutation (K), molecular studieshave shown a linkage with the endogenousviral geneev2l;
molecular typing can be used to searchfor recombinantsand to improve the knowledge of this complex ev2l-K
locus. In each case, techniques have evolved from a relatively heavy methodology (RFLP) towards a faster
methodology (PCR). Such diagnostic tests can be very helpful at some critical stagesof breeding programs. In
the future, genome mapping programs are expected to increasedramatically the number of genesof economical
importancethat will be identifiedat the molecularlevel.
Introduction
Le développement des techniques de la biologie moléculaire a permis, entre autres, de révéler directement la
variabilité de I'ADN du génomedes animaux domestiques. De nombreux travaux visent à mettre en relation cette
variabilité avec des caractéristiques morphologiques ou fonctionnelles des animaux. Dans certains cas on
commencepar s'intéresserà un gène particulier dont on connaît la fonction, on parle alors de gène "candidat"; ou
bien, il n'existe aucune information a priori et on identifie des gènes anonymes, voisins du gène inconnu
recherché,ce sont des gènes"marqueurs". L'obtention d'un grand nombre de marqueurs,leur localisation les uns
par rapport aux autres ainsi que sur les chromosomesfont partie des programmesde cartographiedu génome qui
ne seront pas discutés ici. Il existe déjà chez le poulet un nombre non négligeable de gènesconnus parce qu'ils
ont un effet quantitatif important sur un caractèreéconomiqueou bien parce qu'ils ont un effet qualitatif exploité
pour la production. Deux exemples ont été choisis ici pour illustrer I'utilisation des outils de la biologie
moléculaire avec les deux approchesde gène candidat ou de gène marqueur.
Mise en évidence d'un polymorphisme au niveau moléculaire
Le premier niveau d'étude est généralementune recherche d'un polymorphisme de longueur des fragments de
restriction (RFLP). L'ADN génomique est digéré par une enzyme qui reconnait une séquence spécifique et
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connue de 4, 6 ou 8 bases, les fragments sont séparés par électrophorèseen fonction de leur taille et une
hybridation moléculaire avec une sonde permet de visualiser les fragments qui ressemblent plus ou moins
complètement à cette sonde. La sonde est le plus souvent un fragment d'ADN qui est obtenu par clonage d'un
gène connu. Des fragments de différente taille sont révélés selon la position des sites de coupure de I'enzyme
dans I'ADN génomique. La variabilité des sites de coupure peut être due à I'existencede mutations ponctuellei ou
de modifications structuralesplus importantes,délétion ou insertion de séquencesnucléotidiques plus ou moins
grandes. Les polymorphismes RFLP sont généralementcodominants et permettent d'identifier les génotypes
hétérozygotesou homozygotes au locus reconnu par la sonde. L'ensemble des étapes à mettre en oeuwe rend
cette méthode assezlongue; elle a cependantpermis d'étudier de nombreux gènes et d'établir Ia première carte
génétiquemoléculaire du poulet (B umsteadet P alyga, 1992).
Une autre approche du polymorphisme de I'ADN est devenue possible avec I'invention du procédé
d'amplification en chaîne de I'ADN ou PCR. Ce procédé n'utilise pas une sonde comme le RFLP mais èxige la
connaissance même partielle de la séquence nucléotidique du gène étudié. A partir de cette séquence, on
synthétisedes petits fragments d'ADN (amorcesen simple brin) qui vont s'apparier,dans certainesconditions de
température, avec leur séquencecomplémentaire dans I'ADN génomique; puis une enzyme particulière (1a4
polymerase) va synthétiser le brin d'ADN complémentaire à la séquencegénomique qui se trouve entre deux
amorces. La taille et le nombre de fragments amplifiés sont facilement révélés par électrophorèse. Une
modification de taille indique une délétion ou une insertion,l'absenced'un fragmentpeut suggérerune mutation
au niveau de la séquenced'appariementde I'amorce.La présenced'un nombre variablede très courtesséquences
répétéesau sein du fragment amplifié est à I'origine du polymorphisme de type microsatellite très utilisé dans les
programmes de cartographie du génome. L'existence d'une mutation ponctuelle au sein du fragment amplifié
peut être révéléepar hybridation du produit de I'amplification avec un oligonucléotide portant la mutarion (A) ou
un oligonucléotide de séquencenormale (B), on obtient un seul signal positif avec A pour un génotype
homozygote muté, un seul signal positif avec B pour un homozygote normal et la présencedes deux signaux pour
un hétérozygote (méthode PCR-ASO). La réaction PCR est rapide et peut se faire à partir d'une préparation
simplifiée d'ADN génomique. Plusieurs variantespeuvent encore être proposées(Rafalski et Tingey, 1993).
Les modifications de I'ADN ainsi mises en évidence ne sont pas forcément associées à une différence
fonctionnelle du gène étudié. Il faut alors procéderà une étude de I'ARN messagercorrespondantau gène étudié.
Mutations d'un gène candidat : le cas du gène de nanisme lié au sexe
La mutation récessiveliée au sexedw est connuedepuisplus de 40 anset se trouve à I'originede la créationde la
lignée commerciale Vedette, mère nanifiée du poulet de chair. Son mode d'action est resté longtemps inconnu
mais une accumulation d'informations physiologiques pouvait suggérer un défaut du récepteur à I'hormone de
croissance (Tixier-Boichard et al., 1989). Cette hypothèse a pu être verifiée grâce au clonage de la séquence
d'ADN codant pour le récepteur à I'hormone de croissance(rGH) chez le poulet (Burnside et al., 1991).
L'utlisation de la sonde rGH en RFLP a permis d'identifier trois défauts moléculaires différents chez des poulers
nainsd'origine génétiqueindépendante(Tableaul).
TABLEAU l- Différents typesd'anomaliesmoléculairesdu gènerGH chezles pouletsnains (dw)
Orieine
RFLP
ARN
Nature et localisationde I'anomalie
Tvoaseoossible
délétion
domaineintra-cellulairedu RFLP ou PCR
récepteur
(1) pouletde chair
commercial,
(Agarwal et al.. 1994)
oul
modifié
(2) Leghorn,(Duriez
et al.. 1993)
non
normal mutationponctuelle domaine extra-cellulaire
(3) poulet de chair,
(Huans et al., 1993)
non
modifié
PCR-ASO
mutationponctuelle domaineexEa-cellulaire PCR-ASO(non
testé)
Les modifications de I'ARN messagerdes mutations (l) et (3) permettent de comprendre le déficit fonctionnel
créé par les anomalies de I'ADN. La mutation ponctuelle décrite en læghorn (2) modifie un seul acide aminé à
une position critique dans la protéine et suffit à rendre le récepteur non fonctionnel. Une des premières
applications possibles de ces travaux est de pouvoir distinguer directement les mâles hétérozygoæs des
homozygotes normaux lors de l'introduction du gène dw dans une nouvelle lignée, sans faire de contrôle sur
descendanceni d'études de performances. Pour cela le test de typage doit être simple et la procédé PCR est
toujours préférable. Devant le polymorphisme moléculaire trouvé chez les nains, on peut aussi penser à
rechercherd'autres variants du gène rGH chez les animaux normaux avec une approcheRFLP.
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Liaison d'un gène viral endogène avec la mutation K
La mutation dominante liée au sexe notée K est utilisée depuis de nombreuses années pour I'autosexagede
certaines souches commerciales. Son mode d'action sur la croissance du follicule plumeux est inconnu. Une
liaison génétique entre la mutation K et un gène viral, noté ev2l, a été mise en evidence chez les poules Leghorn
par un procédéRFLP à I'aided'une sondevirale (Bacon et al., 1988).Le gène ev2l constituedonc un marqueur
moléculairepour le gèneK, lui-même inconnu.Ce résultatpeut avoir plusieursapplications:
* établir si la liaison K-evLl existedanstoutesles souches;
* rechercherdes recombinantsayant gardé la mutation K sansle gèneev21;
x utiliser le gèneey2l comme un point de départpour identifier le gènecontrôlantla vitessed'emplt mement.
Un progrèsdécisif a été accompli avec le clonaged'unesondespécifiquedu site d'insertiondu gèneev2l dansle
génomedu poulet (Levin et Smith, 1990).L'utilisationde cettesondeen RFLP a permisde confirmer la présence
de l'ev21 dans les différentessouchespossédantla mutation K (Smith et Levin, 1991). Une description plus
complète a été obtenue avec le séquençagede la région d'insertion (Levin et Smith, 1991). Cependant, cette
région a révélé une complexitéinattendue: elle est dupliquée,si bien qu'il existeconjointementun site d'insertion
(noté OS) occupé par le virus ev2l etune région "jumelle" adjacente(notéeUS) dépourvuedel'evZl. Une des
applicationsde cette étude moléculaireest de rechercherdes animaux K dépourvusdu gèneev2l, dans le but de
réaliser I'autosexageavec un allèle d'emplumementlent sanseffets secondaires.La rareté apparentedu génotype
US-K exige l'étude d'une grand nombre d'individus, notamment dans les souchescommerciales. Un test
diagnostic rapide et peu coûteux reposantsur un procédé PCR a été mis au point dans ce but (Tixier-Boichard et
al., 1994). Si le variant US-K est vraiment très rare, sa fréquence ne poulra être augmentéeque très lentement si
on ne veur pas augmenteraussila consanguinité.La conduiteà tenir dépendrades effectifs de la lignée, du coût
du sexageet du coût lié à I'utilisationdu génotypedéfavorableev2l-K .
L'étape ultime de ces études serait t'identification du gène contrôlant la vitesse d'emplumement et dont le
fonctionnementapparaîtperturbépar la proximité du gène viral ev2l, il s'agitd'un travail bien plus lourd que l a
recherchede polymorphismes.
Perspectives
simplesa priori, où un seul gène
Les deux exemples choisis correspondent à des situationsgénétiques
de nouvelles
impliqué.A chaquefois, l'approchemoléculairea montréune variabilité inattendue et a soulevé de
plus
complète,
la
questions.La situation du gène candidat associéà une mutation classiqueest évidemment
d'un
I'absence
physiologiques.
En
génétiques
et
obt"nue à I'issue d'une longue accumulation de données
information
toute
maximum
au
d'utiliser
important
particulièrement
mécanisme d'action supposé, il sera
préliminaire sur les effets associésà un gène pour orienter la stratégie d'identification. L'exemple du gène K
comme de nombreux autresexemples chez I'Homme et les mammifères montrent qu'il y a encore un long chemin
entre I'identification d'un marqueur lié et la connaissancedu gène proprement dit. Cependant I'information
apportée par le marqueur peut déjà être directement utilisée pour éliminer des génotypes indésirables lors des
étapesde tri inhérentesà tout programme de sélection.
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