Typages moléculaires en sélection avicole.

TYPAGES
MOLECULAIRES EN SELECTION AVICOLE
fixier-Boichard Michèle
INRA, Laboratoire de Génétique Factorielle, 7 8 352 Jouy-en-Josas
Cedex
Résumé
Les outils de la biologie moléculaire
permettent
d'identifier
les individus
porteurs
d'un gène donné quels que
soient leur âge, leur état physiologique ou leur sexe.
Parmi les gènes
majeurs déjà connus chez le poulet, deux
exemples
sont immédiatement accessibles au sélectionneur
avicole : dans le cas du gène de nanisme
lié au sexe
(dw), un typage moléculaire du gène du récepteur à l'hormone de croissance permet d'identifier directement la
mutation responsable du nanisme
et de détecter facilement les porteurs hétérozygotes
apparcmment
normaux;
dans le cas du gène lié au sexe de réduction de la vitesse
d'emplumement
(I9, un typage moléculaire permet
d'identifier un gène viral endogène
(ev2l) lié de façon très étroite avec le gène
K, de rechercher des recombinants
éventuels et de mieux comprendre la structure de ce locus complexe.
Dans les deux cas, le typage a évolué d'une
méthode relativement lourde (RFLP) vers un test plus rapide (amplification PCR). Ces
tests de dépistage
peuvent
être une aide précieuse lors de certaines étapes cruciales dans un schéma de sélection. Dans I'avenir, le
développement des programmes de cartographie
du génome devrait augmenter
considérablement le nombre de
gènes
d'intérêt économique
qui seront accessibles
par
ces méthodes.
Abstract
Molecular typing in poultry breeding
Molecular biology offers a wide range of tools in order to identify the carriers of a given gene,
whatever the age,
physiological conditions or sex of the animals studied. Among major genes
already known in the chicken, two
exemples are immediately available to the poultry breeder.
In the case
of sex-linked dwarfism (dw), molecular
typing of the growth hormone receptor gene directly shows the mutation responsible for the dwarfrsm and
provides an easy identification of heterozygous carriers which are phenotypically normal. In the case of sex-
linked late-feathering mutation (K), molecular studies have shown a linkage with the endogenous
viral gene ev2l;
molecular typing can be used to search
for recombinants and to improve the knowledge of this complex ev2l-K
locus. In each case, techniques have evolved from a relatively heavy methodology (RFLP) towards a faster
methodology (PCR). Such diagnostic tests
can be very helpful at some critical stages
of breeding programs. In
the future, genome mapping programs are expected to increase
dramatically the number of genes
of economical
importance
that
will be identified
at the molecular
level.
Introduction
Le développement des techniques de la biologie moléculaire a permis, entre autres, de révéler directement la
variabilité de I'ADN du génome
des animaux domestiques.
De nombreux
travaux visent à mettre en relation cette
variabilité avec des caractéristiques morphologiques ou fonctionnelles des animaux. Dans certains cas on
commence
par s'intéresser à un gène particulier dont on connaît la fonction, on parle alors de gène "candidat"; ou
bien, il n'existe aucune information a priori et on identifie des gènes anonymes, voisins du gène inconnu
recherché, ce sont des gènes
"marqueurs". L'obtention d'un grand nombre
de marqueurs, leur localisation les uns
par rapport aux autres ainsi que sur les chromosomes font partie des programmes de cartographie
du génome
qui
ne seront pas discutés ici. Il existe déjà chez le poulet un nombre non négligeable
de gènes
connus parce qu'ils
ont un effet quantitatif important sur un caractère économique ou bien parce
qu'ils ont un effet qualitatif exploité
pour la production. Deux exemples ont été choisis ici pour illustrer I'utilisation des outils de la biologie
moléculaire avec les deux approches
de gène
candidat
ou de gène
marqueur.
Mise en évidence d'un polymorphisme au niveau moléculaire
Le premier niveau d'étude est généralement une recherche d'un polymorphisme de longueur des fragments de
restriction (RFLP). L'ADN génomique est digéré par une enzyme qui reconnait une séquence
spécifique et
158

connue de 4, 6 ou 8 bases, les fragments sont séparés par électrophorèse
en fonction de leur taille et une
hybridation moléculaire avec une sonde permet de visualiser les fragments qui ressemblent plus ou moins
complètement à cette sonde. La sonde est le plus souvent
un fragment d'ADN qui est obtenu par clonage d'un
gène connu. Des fragments de différente taille sont révélés selon la position des sites de coupure de I'enzyme
dans
I'ADN génomique.
La variabilité des sites
de coupure peut être due à I'existence de mutations ponctuellei ou
de modifications structurales plus importantes,
délétion ou insertion de séquences nucléotidiques plus ou moins
grandes. Les polymorphismes RFLP sont généralement
codominants et permettent d'identifier les génotypes
hétérozygotes
ou homozygotes au locus reconnu par la sonde. L'ensemble
des étapes à mettre en oeuwe rend
cette méthode assez longue; elle a cependant permis d'étudier de nombreux gènes
et d'établir Ia première carte
génétique
moléculaire du poulet (B
umstead
et P aly
ga, 1992).
Une autre approche du polymorphisme de I'ADN est devenue possible avec I'invention du procédé
d'amplification en chaîne
de I'ADN ou PCR. Ce procédé n'utilise pas une sonde
comme le RFLP mais èxige la
connaissance
même partielle de la séquence
nucléotidique du gène étudié. A partir de cette séquence, on
synthétise
des petits fragments
d'ADN (amorces
en simple brin) qui vont s'apparier, dans
certaines
conditions de
température, avec leur séquence complémentaire dans I'ADN génomique; puis une enzyme particulière (1a4
polymerase) va synthétiser le brin d'ADN complémentaire
à la séquence
génomique qui se trouve entre deux
amorces. La taille et le nombre de fragments amplifiés sont facilement révélés par électrophorèse. Une
modification
de taille indique
une
délétion
ou une
insertion,
l'absence
d'un fragment peut suggérer
une mutation
au niveau
de la séquence
d'appariement
de I'amorce.
La présence
d'un nombre variable
de très
courtes séquences
répétées
au sein du fragment amplifié est à I'origine du polymorphisme
de type microsatellite très utilisé dans les
programmes de cartographie du génome. L'existence d'une mutation ponctuelle au sein du fragment amplifié
peut être révélée par hybridation du produit de I'amplification avec un oligonucléotide portant la mutarion (A) ou
un oligonucléotide
de séquence
normale (B), on obtient un seul signal positif avec A pour un génotype
homozygote
muté, un seul signal positif avec
B pour un homozygote normal et la présence
des deux signaux pour
un hétérozygote (méthode PCR-ASO). La réaction PCR est rapide et peut se faire à partir d'une préparation
simplifiée d'ADN génomique.
Plusieurs
variantes peuvent
encore être
proposées
(Rafalski et Tingey, 1993).
Les modifications de I'ADN ainsi mises en évidence ne sont pas forcément associées à une différence
fonctionnelle du gène
étudié. Il faut alors procéder
à une
étude de I'ARN messager
correspondant au gène
étudié.
Mutations d'un gène candidat : le cas du gène de nanisme lié au sexe
La mutation
récessive
liée au sexe
dw est
connue
depuis
plus
de 40 ans et se trouve à I'origine
de la création de la
lignée commerciale Vedette, mère nanifiée du poulet de chair. Son mode d'action est resté longtemps inconnu
mais une accumulation d'informations physiologiques pouvait suggérer un défaut du récepteur à I'hormone de
croissance
(Tixier-Boichard et al., 1989). Cette hypothèse
a pu être verifiée grâce au clonage de la séquence
d'ADN codant pour le récepteur
à I'hormone
de croissance
(rGH) chez le poulet (Burnside et al., 1991).
L'utlisation de la sonde
rGH en RFLP a permis d'identifier trois défauts moléculaires
différents chez des poulers
nains
d'origine génétique
indépendante
(Tableau
l).
TABLEAU l- Différents
types
d'anomalies
moléculaires
du gène rGH chez les poulets
nains
(dw)
Les modifications de I'ARN messager
des mutations (l) et (3) permettent
de comprendre le déficit fonctionnel
créé par les anomalies
de I'ADN. La mutation ponctuelle décrite en læghorn (2) modifie un seul acide aminé à
une position critique dans la protéine et suffit à rendre le récepteur non fonctionnel. Une des premières
applications possibles de ces travaux est de pouvoir distinguer directement les mâles hétérozygoæs des
homozygotes normaux lors de l'introduction du gène dw dans une nouvelle lignée, sans faire de contrôle sur
descendance
ni d'études
de performances.
Pour cela le test de typage doit être simple et la procédé PCR est
toujours préférable. Devant le polymorphisme moléculaire trouvé chez les nains, on peut aussi penser à
rechercher d'autres
variants
du gène
rGH chez les animaux normaux avec une approche RFLP.
Orieine RFLP ARN Nature et localisation de I'anomalie Tvoase oossible
(1)
poulet
de chair
commercial,
(Agarwal
et al.. 1994)
oul modifié délétion domaine intra-cellulaire
du
récepteur RFLP ou PCR
(2) Leghorn,
(Duriez
et al..
1993) non normal mutation ponctuelle domaine extra-cellulaire PCR-ASO
(3) poulet
de chair,
(Huans
et al., 1993) non modifié mutation
ponctuelle domaine exEa-cellulaire PCR-ASO (non
testé)
159

Liaison d'un gène viral endogène
avec la mutation K
La mutation dominante liée au sexe notée K est utilisée depuis de nombreuses
années
pour I'autosexage de
certaines souches commerciales. Son mode d'action sur la croissance
du follicule plumeux est inconnu. Une
liaison génétique entre la mutation K et un gène viral, noté ev2l, a été mise en evidence chez les poules Leghorn
par un procédé
RFLP à I'aide d'une
sonde
virale (Bacon et al., 1988). Le gène
ev2l constitue
donc un marqueur
moléculaire
pour le gène
K, lui-même inconnu. Ce résultat
peut
avoir plusieurs applications:
* établir si la liaison K-evLl existe dans toutes
les souches;
* rechercher
des recombinants ayant
gardé
la mutation K sans
le gène
ev21;
x utiliser
le gène ey2l comme un point
de départ
pour
identifier
le gène
contrôlant
la vitesse d'emplt
mement.
Un progrès
décisif a été accompli avec le clonage
d'une sonde
spécifique
du site d'insertion
du gène ev2l dans
le
génome
du poulet
(Levin et Smith, 1990). L'utilisation
de cette
sonde
en RFLP a permis
de confirmer
la présence
de l'ev21 dans les différentes souches
possédant
la mutation
K (Smith et Levin, 1991).
Une description
plus
complète a été obtenue avec le séquençage
de la région d'insertion (Levin et Smith, 1991). Cependant,
cette
région a révélé une complexité inattendue
: elle est
dupliquée,
si bien
qu'il existe conjointement un site d'insertion
(noté
OS) occupé
par le virus ev2l etune région "jumelle" adjacente
(notée
US) dépourvue
del'evZl. Une des
applications de cette
étude moléculaire est
de rechercher
des
animaux
K dépourvus
du gène
ev2l, dans
le but de
réaliser I'autosexage avec un allèle d'emplumement
lent sans
effets secondaires.
La rareté apparente
du génotype
US-K exige l'étude d'une grand nombre d'individus, notamment
dans les souches commerciales. Un test
diagnostic rapide et peu coûteux reposant sur un procédé PCR a été mis au point dans ce but (Tixier-Boichard et
al., 1994). Si le variant US-K est vraiment très rare, sa fréquence
ne poulra être augmentée
que très lentement si
on ne veur
pas
augmenter
aussi la consanguinité.
La conduite
à tenir dépendra
des effectifs
de la lignée,
du coût
du sexage
et du coût lié à I'utilisation du génotype
défavorable
ev2l-K .
L'étape ultime de ces études serait t'identification du gène contrôlant la vitesse d'emplumement et dont
fonctionnement apparaît
perturbé par la proximité du gène viral ev2l, il s'agit
d'un travail bien plus lourd que
recherche
de
polymorphismes.
Perspectives
Les deux exemples choisis correspondent à des situations
génétiques simples a priori, où un
impliqué. A chaque
fois, l'approche moléculaire
a montréune variabilité inattendue et a soulevé de nouvelles
questions. La situation du gène candidat
associé
à une mutation classique
est évidemment
la plus complète,
obt"nue à I'issue d'une longue accumulation
de données
génétiques et physiologiques. En I'absence
d'un
mécanisme d'action supposé, il sera particulièrement important d'utiliser au maximum toute information
préliminaire sur les effets associés
à un gène pour orienter la stratégie
d'identification. L'exemple du gène K
comme de nombreux autres exemples
chez I'Homme et les mammifères
montrent qu'il y a encore
un long chemin
entre I'identification d'un marqueur lié et la connaissance
du gène proprement dit. Cependant I'information
apportée par le marqueur peut déjà être directement utilisée pour éliminer des génotypes indésirables lors des
étapes de tri inhérentes à tout programme de sélection.
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