Sujet Stage de Recherche 2008

Proposition de stage de recherche Ingénieur AGRONOME 3
ème
année - 2008
D. Giron
Défenses induites par les lépidoptères mineurs chez la plante hôte
Impact du comportement alimentaire de l’insecte
et médiation de ses performances par application de substances naturelles
Contexte
Un grand nombre d’hypothèses cherchent à expliquer les bases adaptatives liées à l’émergence du mode
de vie endophyte. Dans ce contexte, l’avantage nutritionnel lié à un développement directement au sein des
tissus végétaux apparaît comme central. Les insectes endophytes, et plus particulièrement les insectes mineurs,
sont ainsi susceptibles d’accéder aux tissus les plus nutritifs tout en évitant les tissus présentant de nombreuses
défenses physiques et/ou biochimiques.
Etat des Lieux
Une première étude a montré la capacité des insectes endophytes mineurs à manipuler leur
environnement végétal par la production d’hormones végétales de type cytokinines. Cette accumulation de
cytokinines au sein de la mine serait ainsi responsable du maintien de l’activité photosynthétique au niveau des
zones minées dans un contexte automnal normalement associé à la dégradation de l’appareil photosynthétique et
la résorption des éléments nutritifs (Giron et al. 2007). Le maintien de l’appareil photosynthétique au niveau des
zones minées permet le maintien d’un environnement nutritif favorable caractérisé par un maintien des
concentrations en sucres et protéines égales à celles qu’on peut trouver au sein d’une feuille verte non minée.
Ceci a un impact écologique primordial pour l’insecte car il lui permet d’achever son développement dans un
microenvironnement autonome découplé du reste de la plante (Giron et al. 2007). L’avantage nutritif obtenu par
cette manipulation est encore plus flagrant en condition non-automnale car il permet une concentration accrue en
nutriments dans la zone exploitée par l’insecte.
Parallèlement, la question de l’origine du niveau élevé de cytokinines au sein des îles vertes a été
abordée. La première hypothèse est que l’insecte lui-même synthétise des cytokinines. La deuxième hypothèse
est que l’insecte manipule la plante pour induire la synthèse de cytokinines végétales. Une troisième hypothèse
fait intervenir un troisième partenaire dans l’interaction Phyllonorycter blancardella-pommier. En effet, les
endosymbiontes associés aux insectes sont connus pour jouer des rôles importants dans différents aspects de la
physiologie des insectes. Il est légitime de poser l’hypothèse qu’un endosymbionte puisse être impliqué dans la
synthèse de cytokinines.
En utilisant des amorces spécifiques d’un endosymbionte de type Wolbachia nous avons pu dans un
premier temps démontrer que cette bactérie est présente chez Phyllonorycter blancardella. Il a ensuite été
possible d’amplifier par RT-PCR, à partir d’ARN extrait de Phyllonorycter blancardella, un gène de Wolbachia
codant pour une isopentenyltransférase (iPt : enzyme clée dans la voie de biosynthèse des Cytokinines). Ce
résultat montre qu’un endosymbionte du genre Wolbachia, associée à l’insecte mineur exprime un gène codant
pour les cytokinines. Actuellement nous réalisons des tests fonctionnels afin d’apporter la preuve irréfutable que
ce gène permet à l’insecte de produire des Cytokinines fonctionnelles par le biais des bactéries de type
Wolbachia. Parallèlement, le curage des bactéries par traitement antibiotique des adultes lépidoptères nous a
permis de montrer une annulation significative de l’accumulation en cytokinines dans les zones minées et la
suppression effective du phénomène d’île verte (la persistance de la couleur verte au niveau de la mine lors de la
sénescence de la feuille à l’automne).

Proposition de stage de recherche Ingénieur AGRONOME 3
ème
année - 2008
D. Giron
Question Scientifique
L’ensemble des éléments obtenus à ce jour semblent confirmer l’hypothèse d’une alimentation sélective
en raison de : 1) la concentration de l’activité alimentaire dans les tissus les plus nutritifs, et 2) la manipulation
active de l’environnement végétal aux bénéfices de l’insecte.
Afin de confirmer de façon irréfutable l’hypothèse d’alimentation sélective, il convient néanmoins à
présent d’investiguer le niveau de défenses végétales au sein des tissus minés et plus généralement au niveau des
plantes attaquées par les insectes endophytes mineurs. La réaction des plantes à différents stress biotiques et
abiotiques fait l’objet d’une intense recherche en perpétuelle évolution. Néanmoins, l’essentiel des études
menées jusqu’à ce jour se concentrent sur l’activation des défenses végétales en réponse aux agents pathogènes
(bactéries, fungus, etc) ou aux herbivores ectophages. Très peu d’études se sont intéressées à la réaction des
plantes en réponse aux organismes phytophages endophytes, et ce, malgré leur importance économique et leur
résistance à la grande majorité des agents de lutte chimique.
Le projet de recherche se décompose en 4 étapes majeures.
1. Bibliographie. La première étape consistera à recenser et à analyser l’ensemble des études menées sur
la réponse des plantes aux organismes endophytes.
2. Expérimentation de laboratoire (Biologie moléculaire). La seconde étape visera à mettre en
évidence, au niveau moléculaire, les voies de défenses majoritaires activées (ou mises en silence) par
l’activité alimentaire de lépidoptères mineurs. L’étude sera complétée par une analyse dynamique en
fonction du stade de développement de l’insecte. En effet, on distingue chez ces organismes 2 stades
distincts, un stade dit « sap-feeder » et un stade « tissue-feeder ». En raison du mode d’alimentation
spécifique de ces 2 stades, on attend l’activation spécifique de voies métaboliques différentes
(activation des voies type pathogène pour le stade sap-feeder et des voies de type insectes broyeurs pour
le stade tissue-feeder). Suivant l’avancée des travaux, l’analyse comparative de plusieurs variétés de
pommiers pourrait être envisagée.
Techniques : Extraction d’ADN, PCR.
3. Expérimentation de terrain. De récente découvertes, nous ont permis de mettre en évidence une
action négative de la pulvérisation de substances naturelles sur le développement de différents
ravageurs du pommiers (Carpocapse, tavelure, oïdium). A l’heure actuelle, l’action potentielle de ce
type de lutte naturelle sur les ravageurs endophytes et les mécanismes impliqués dans la résistance des
plantes sont inconnus. La troisième étape consistera à réaliser en champ différents traitements afin
d’évaluer ensuite en laboratoire les mécanismes d’action potentiels.
Techniques : Pulvérisations, Cinétiques de traitement.
4. Expérimentation de laboratoire (Biochimie). Cette quatrième étape visera à évaluer l’impact
potentiel du traitement réalisé en champ sur les capacités de développement des insectes endophytes
mineurs. L’altération des voies métaboliques de défenses mis en évidence en 2. sera évaluée ainsi que
les altérations de la chimie de surface et la chimie interne des feuilles (acides aminés et sucres).
Techniques : Extraction ADN, PCR, HPLC, GCMS.
Résultats attendus
- Caractérisation des voies métaboliques de défenses en fonction du stade de développement des insectes
mineurs.
- Caractérisation des perturbations moléculaires (défenses) et biochimiques (chimie interne et chimie de
surface) suite à la pulvérisation de X.
Faisabilité
L’ensemble du projet sera réalisé sous la direction du Dr. David GIRON ([email protected]) à
l’Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte (Tours) dans le cadre du projet ECOREN financé par
l’Agence Nationale de la Recherche (ANR). Les techniques nécessaires ont été développées à l’IRBI dans le
cadre du projet EcOrEn et/ou en partenariat avec le CRITT Innophyt.
Ce projet bénéficiera du soutien technique du Dr. Elisabeth HUGUET et de M. Wilfried KAISER pour les
aspects moléculaires ainsi que de Mme Ingrid ARNAULT et du Prof. Jacques AUGER pour les aspects
biochimiques et les essais en champ.
Le programme se déroulera en association avec le Centre Régional d'Innovation et de Transfert de Technologies
Innophyt et les appuis techniques de la station d’expérimentation de la Morinière (37).
http://www.critt-innophyt.asso.fr/

Proposition de stage de recherche Ingénieur AGRONOME 3
ème
année - 2008
D. Giron
Références
Cytokinin-mediated leaf manipulation by a leafminer caterpillar. Giron D, Kaiser W, Imbault N & Casas J.
Eiology Letters, 2007 (3) 340-343.
Plant interactions with microbes and insects: from molecular mechanisms to ecology. Pieterse CMJ & Dicke M.
Trends in Plant Science, 2007 (in press).
Contact
David Giron
[email protected]
Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte
Faculté des sciences et techniques
37200 Tours
02 47 36 73 49
Il est attendu que l’étudiant ne compte pas ses heures et que son travail puisse déboucher sur une
publication.