syndrome dysgénésique et respiratoire du porc

1222 Manuel terrestre de l’OIE 2008
CHAPITRE 2.8.7.
SYNDROME DYSGÉNÉSIQUE ET
RESPIRATOIRE DU PORC
RÉSUMÉ
Le syndrome dysgénésique et respiratoire du porc (SDRP) est caractérisé par des troubles de la
reproduction chez les truies et des problèmes respiratoires chez les porcelets ainsi que les porcs en
croissance. La maladie est causée par le virus SDRP, un virus actuellement classé dans l’ordre des
Nidovirales, dans la famille des Arteriviridae et le genre Arterivirus. La principale cellule-cible du
virus est le macrophage alvéolaire du porc. Il existe deux principaux types antigéniques du virus, le
type européen et le type nord-américain. Le virus est essentiellement transmis par des porcs
infectés mais aussi par les fèces, l’urine, la semence et le fumier.
Le SDRP est présent dans la grande majorité des régions productrices de porcs à travers le
monde. Les problèmes reproducteurs sont caractérisés par de l’infertilité, une momification des
fœtus en fin de gestation, des avortements, de la mortinatalité et par la mise bas de porcelets
chétifs qui souvent mourront tôt après la naissance suite à des troubles respiratoires et des
infections secondaires. Les porcs en croissance peuvent développer des signes modérés de la
maladie respiratoire, en général compliquée par des infections secondaires. Aucune autre espèce
n’est connue pour être infectée naturellement par le virus SDRP.
Identification de l’agent pathogène : le diagnostic virologique de l’infection par le virus SDRP est
difficile ; le virus peut être isolé de différents tissus ou organes provenant des porcs atteints, tels le
sérum, les liquides d’ascite, les poumons, les amygdales, les nœuds lymphatiques et la rate.
Puisque les macrophages alvéolaires porcins constituent le système de culture le plus sensible
pour l’isolement du virus de l’un ou l’autre type antigénique, l’utilisation de ces cellules pour
l’isolement viral est recommandée. Les cellules MARC-145 (un clone de la lignée MA-104)
conviennent également. Il existe une variabilité entre les lots de macrophages quant à leur
sensibilité au virus SDRP. Il est donc nécessaire d’identifier d’abord un lot de macrophages ayant
une sensibilité élevée et de le conserver dans l’azote liquide jusqu’à l’utilisation. L’identification et la
caractérisation du virus s’effectuent par une coloration immunologique utilisant des antisérums
spécifiques. D’autres techniques ont également été développées pour la confirmation en laboratoire
de l’infection par le virus SDRP, notamment l’immunohistochimie et l’hybridation in situ effectuées
sur des tissus fixés, ainsi que la transcription inverse suivie de l’amplification en chaîne par
polymérase.
Épreuves sérologiques : une grande variété d’épreuves sérologiques est actuellement disponible
pour la détection des anticorps sériques contre le virus SDRP. L’épreuve d’immunopéroxydase sur
monocouche cellulaire est réalisée sur des macrophages alvéolaires, habituellement infectés par le
virus de type européen, et l’épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) est réalisée sur les
cellules MARC-145, habituellement infectées par le virus de type nord-américain. Ces deux
épreuves peuvent toutefois être élaborées en utilisant des cellules et les deux types de virus. Des
méthodes immuno-enzymatiques (ELISA), commerciales ou propres aux laboratoires, sont
maintenant souvent utilisées. Il existe un test ELISA commercial qui est spécifique pour les deux
types de virus, européen et nord-américain. Un ELISA indirect, un ELISA de blocage et un double
ELISA permettant de différencier les réactions sérologiques aux types européen et nord-américain,
ont été décrits.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
les vaccins peuvent être utiles pour la prévention des formes reproductrice et respiratoire du SDRP.

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Les vaccins vivants atténués ne sont pas appropriés pour la vaccination des truies et des cochettes
gestantes ni pour les verrats. La vaccination peut entraîner l’excrétion du virus vaccinal dans la
semence. Les vaccins de virus vivant atténué peuvent persister chez les animaux vaccinés, et la
transmission aux animaux non vaccinés ainsi que l’apparition subséquente de la maladie causée
par la souche vaccinale ont été rapportées.
A. INTRODUCTION
Le syndrome dysgénésique et respiratoire du porc (SDRP) est caractérisé par des problèmes reproducteurs chez
les truies et une maladie respiratoire chez les porcs (2). La maladie est apparue en 1987 aux États-Unis et a
entraîné une pandémie en quelques années. Le SDRP est dû au virus SDRP. Il a été isolé en 1991 aux Pays-Bas
(33) et est classé comme membre de l’ordre des Nidovirales, famille des Arteriviridae, genre Arterivirus (4). Le
virus du SDRV est un virus à ARN, simple brin, de polarité positive, et sa biologie a été bien caractérisée. Peu
après la découverte du virus, il est apparu que les isolats nord-américains (NA) et européens (EU) du virus du
SDRV constituaient deux génotypes aux caractéristiques antigéniques différentes (20, 25, 32). Des recherches
complémentaires ont mis en évidence des différences régionales au sein de chaque continent. Ces différences
ont tendance à s’estomper depuis que des virus de type nord-américain ont été introduits en Europe (par le biais
de vaccin à virus vivants produits à partir d’isolats nord-américains) et que des virus de type européen ont été
retrouvés en Amérique du Nord. La plupart des virus du SDRV isolés en Amérique du Sud et en Asie sont du type
nord-américain ; il est généralement admis que ces virus ont été introduits par les transports de porcs et/ou de
semence.
La diversité s’accroît parmi les souches des deux génotypes ; cette diversité est attribuée au taux élevé d’erreurs
lors de la réplication des virus du SDRV (5), et à la recombinaison entre les souches (28). Récemment, des
souches ayant un haut degré de polymorphisme ont été décrites, ce qui a apporté des éclaircissements sur
l’émergence d’agents pathogènes de porcs relativement nouveaux (26). Les effets de cette diversité sur le
diagnostic et les vaccins sont mal connus et devraient être pris en considération.
Le syndrome reproductif est caractérisé par des avortements tardifs avec fœtus momifiés et par la naissance de
porcelets mort-nés ou de porcelets chétifs. Une augmentation des retours en œstrus (repeat breeders) pendant la
phase aiguë d’une épizootie est fréquemment signalée. Moins fréquemment des échecs de la reproduction en
début ou au milieu de la gestation sont également constatés. Chez les verrats, les cochettes de remplacement et
les truies, une fièvre passagère et de l’anorexie peuvent être observées. Le syndrome respiratoire est caractérisé
par de la dyspnée, de la fièvre, de l’anorexie et de l’abattement. Les jeunes porcs sont plus fréquemment affectés
que les vieux animaux, et les verrats ou les truies présentent fréquemment des formes asymptomatiques. Les
infections secondaires sont de plus en plus fréquentes et la mortalité peut être élevée. Chez les verrats infectés
par le virus SDRP et ceux qui ont été vaccinés avec le vaccin vivant atténué, le virus peut être excrété dans la
semence, et des modifications dans la morphologie et la fonction spermatique ont été décrites (7). Le virus est
transmis essentiellement directement par des porcs infectés mais aussi par les fèces, l’urine et le sperme. Il peut
aussi être transmis indirectement, vraisemblablement par des aérosols ou des vecteurs mécaniques. Les lésions
macroscopiques et les microscopiques en relation avec l’infection par le virus SDRP ont été largement décrites
(13). En général, ces lésions sont plus sévères chez les jeunes animaux que chez les plus âgés. Des
observations de terrain et des études expérimentales laissent à penser que des différences de virulence existent
entre les isolats de virus SDRP, tant au sein d’un génotype qu’entre les génotypes (13). En dépit des nombreux
résultats de la recherche depuis la découverte du virus, il existe encore de nombreuses zones d’ombre en ce qui
concerne les relations entre le virus SDRP et les autres maladies, ainsi que la réponse immunitaire.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
L’identification du virus SDRP peut être réalisée par isolement, par détection des acides nucléiques ou par
détection des protéines virales. L’isolement du virus est problématique car tous les isolats de virus (en particulier
les virus de type européen) peuvent ne pas infecter facilement une lignée cellulaire dérivée de la lignée de rein de
singe MA-104 (16). Étonnamment, cette lignée de culture cellulaire continue semble être la seule qui permette
l’infection par le virus SDRP. Les macrophages alvéolaires de porc (MAP) permettent la réplication de la plupart,
sinon de toutes les souches isolées. Cependant, la récolte des MAP n’est pas une chose facile car seulement des
porcs en bonne santé et âgés de moins de 8 semaines doivent être retenus comme source de MAP (33). Les
différents lots de MAP ne sont pas tous également sensibles au virus SDRP ; il est donc nécessaire de tester
chaque lot avant son emploi pour l’isolement. Les MAP peuvent être conservés dans de l’azote liquide jusqu’à
leur utilisation comme décrit ci-dessous. L’isolement du virus à l’aide des MAP est une technique qui peut être
réalisée dans la plupart des laboratoires de diagnostic. Cette technique est sensible pour l’isolement de toutes les

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souches du virus SDRP et sera décrite en détail. La détection des acides nucléiques du virus SDRP peut être
réalisée par une transcription inverse suivie d’une amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR), une RT-
PCR nichée et une RT-PCR en temps réel (17, 18, 22, 30, 31). Ces épreuves sont fréquemment utilisées pour la
recherche de l’acide nucléique dans les tissus ou le sérum. Elles sont particulièrement utiles quand l’isolement
viral est problématique, par exemple pour tester la semence (7) ou des tissus partiellement dégradés par autolyse
ou par la chaleur durant le transport des échantillons. Une épreuve PCR multiplexe a été élaborée pour
différencier les souches nord-américaines et européennes du virus SDRP (11). L’analyse du polymorphisme des
longueurs des fragments de restriction (RFLP) réalisée sur des produits amplifiés par PCR a été développée pour
différencier les souches vaccinale et sauvage du virus SDRP (34) et récemment, des études moléculaires
épidémiologiques de souches du virus SDRP ont été réalisées par des analyses phylogénétiques de séquences
spécifiques des gènes structuraux. Toutes ces épreuves basées sur l’acide nucléique sont plus rapides que
l’isolement du virus et ne nécessitent pas de locaux dédiés aux cultures cellulaires. Bien que rarement employée
pour le diagnostic, l’hybridation in situ permet de détecter et de différencier les génotypes des souches nord-
américaines et européennes du virus SDRP dans les tissus fixés au formol (20). L’immunohistochimie peut être
réalisée pour identifier les protéines virales (12, 19) et quand elle est appliquée sur des tissus fixés au formol, elle
permet la visualisation de l’antigène en même temps que les lésions histologiques.
a) Récolte des macrophages alvéolaires des poumons
Les poumons devraient de préférence être obtenus de porcs EAPS ou de porcs provenant d’un troupeau
dont on a démontré qu’il était indemne de l’infection par le virus SDRP. De meilleurs résultats sont obtenus
lorsque les porcs sont âgés de moins de 8 semaines. Les macrophages devraient être récoltés des
poumons le jour même où le porc est abattu. Les poumons doivent être lavés 3 à 4 fois avec un volume total
d’environ 200 ml de solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) et stérile. Le liquide de lavage
récolté est ensuite centrifugé 10 min à 1 000 g. Le culot de macrophages ainsi obtenu est suspendu dans du
PBS et centrifugé (lavé) deux autres fois. Le culot final est dilué dans 50 ml de PBS, et le nombre de
macrophages est compté pour déterminer la concentration cellulaire. On peut utiliser les macrophages frais,
ou ils peuvent être conservés dans l’azote liquide suivant les méthodes recommandées, à une concentration
finale approximative de 4 × 107 macrophages/1,5 ml. Les différents lots de macrophages ne doivent pas être
mélangés.
b) Analyse d’un lot de macrophages alvéolaires
Avant d’utiliser un lot de macrophages, celui-ci doit être validé. Ceci se fait en titrant une souche de
référence du virus SDRP ayant un titre connu sur les nouveaux macrophages, et en réalisant la réaction
d’immunopéroxydase sur monocouche cellulaire (IPMA) avec des sérums positifs et négatifs connus, sur
des plaques ensemencées avec les nouveaux macrophages. Les macrophages sont adéquats seulement si
la souche de référence se réplique à son titre habituel (DICT50, Dose de virus infectant 50 % de la culture
tissulaire). Il est recommandé que les macrophages alvéolaires et le sérum fœtal bovin (SFB) utilisé dans le
milieu de culture soient exempts de pestivirus.
c) Isolement viral sur macrophages alvéolaires
Les macrophages alvéolaires sont ensemencés dans les cupules des plaques de microtitrage à fond plat
pour culture cellulaire. Après leur adhésion, les macrophages sont inoculés avec l’échantillon. Ces
échantillons peuvent être des sérums, des liquides d’ascite ou des suspensions à 10 % de broyats
d’organes tels les amygdales, poumons, nœuds lymphatiques et rate. En général, le virus SDRP induit un
effet cytopathogène (ECP) dans les macrophages après 1 à 2 jours de culture, mais il peut y avoir des
isolats qui se répliquent en induisant peu d’ECP ou qui induisent un ECP seulement après des passages
répétés. Après un délai de 1 à 2 jours ou une fois l’ECP observé, la présence du virus SDRP doit être
confirmée à l’aide d’un antisérum spécifique ou d’un anticorps monoclonal (AcM) que l’on utilise dans une
coloration immunologique.
i) Ensemencement des macrophages dans les plaques de microtitrage
Décongeler une fiole contenant 6 × 107 macrophages/1,5 ml. Laver les cellules une fois avec 50 ml de
PBS et centrifuger la suspension cellulaire 10 min à 300 g (à température de la pièce). Suspendre les
cellules dans 40 ml de milieu RPMI (Rose-Peake Memorial Institute) 1640 contenant 5 % de sérum
fœtal bovin (SFB) et 10 % d’un mélange antibiotique (milieu de croissance). Distribuer 100 µl de la
suspension cellulaire dans chaque cupule de la plaque de microtitrage (avec une fiole de cellules,
4 plaques peuvent être ensemencées à une concentration de 105 cellules dans chaque cupule de la
plaque).

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ii) Préparation des dilutions d’échantillons (sérum, liquide d’ascite, broyat d’organe 10 %) dans une
plaque non ensemencée
Distribuer 90 µl de milieu de croissance dans chaque cupule d’une plaque de microtitrage. Ajouter 10 µl
d’échantillon dans les cupules des rangées A et E (duplicata de la dilution 1/10). Agiter les plaques et
transférer 10 µl des cupules des rangées A et E aux cupules des rangées B et F (dilution 1/100). Agiter
les plaques et transférer 10 µl des cupules des rangées B et F aux cupules des rangées C et G
(dilution 1/1 000). Agiter les plaques et transférer 10 µl des cupules des rangées C et G aux cupules
des rangées D et H (dilution 1/10 000). Agiter les plaques.
iii) Incubation des échantillons
Transférer 50 µl des dilutions des échantillons de la plaque non ensemencée aux cupules
correspondantes d’une plaque ensemencée avec les macrophages (premier passage). Incuber de 2 à
5 jours et observer quotidiennement pour vérifier la présence d’un ECP. Le second jour, ensemencer
des macrophages dans de nouvelles plaques de microtitrage (voir ci-dessus). Transférer 25 µl des
surnageants des plaques du premier passage aux cupules correspondantes des plaques fraîchement
ensemencées (second passage). Incuber 2 à 5 jours et vérifier l’ECP chaque jour.
iv) Lecture et interprétation des résultats
Les cupules dans lesquelles on observe un ECP seulement au premier passage sont considérées
comme de fausses positivités dues à la toxicité de l’échantillon. Les cupules dans lesquelles on
observe un ECP dans les 2 passages ou dans le second passage seulement sont considérées comme
d’éventuels positifs. Toutes les cupules contenant des macrophages qui ne présentent aucun ECP
doivent être confirmées quant à leur négativité au virus SDRP par une coloration immunologique avec
un antisérum positif au virus SDRP ou un AcM. Les échantillons démontrant un ECP doivent être
confirmés positifs au virus SDRP soit par la remise en culture sur les macrophages de ces surnageants
d’échantillon, soit par la culture des dilutions originales de l’échantillon, pendant 24 et 48 h, suivie d’une
coloration immunologique avec un antisérum positif au virus SDRP ou un AcM.
v) Coloration immunologique avec un antisérum positif au virus SDRP ou un AcM
Inoculer les macrophages avec 50 µl de surnageant de l’échantillon tel que décrit dans la section B.2.a,
et laisser pousser les cellules infectées 24 et 48 h. Préparer une dilution appropriée du sérum positif au
virus SDRP dans un tampon de dilution, et faire la coloration immunologique sur les macrophages tel
que décrit dans les sections B.2.a ou B.2.b.
2. Épreuves sérologiques
Différentes épreuves ont été décrites pour la détection des anticorps contre le virus SDRP dans le sérum. Le
diagnostic sérologique est, en général, facile à réaliser, résultant en une bonne spécificité et une bonne
sensibilité, particulièrement lorsqu’il est utilisé à l’échelle du troupeau. Les sérums de porcs, individuellement,
peuvent causer des difficultés dues à des réactions non spécifiques, mais ce problème est résolu en
échantillonnant à nouveau le porc 2 à 3 semaines plus tard. La sérologie est habituellement réalisée par une
épreuve de blocage telle l’IPMA, d’immunofluorescence ou immuno-enzymatique (ELISA) – épreuve pour laquelle
différents protocoles ont été décrits (1, 6, 8, 14, 23, 25, 33, 35). Ces épreuves sont souvent réalisées avec un
antigène viral d’un type antigénique, ce qui signifie que les anticorps dirigés contre l’autre type antigénique,
hétérologue, peuvent être détectés de façon moins sensible. Un ELISA de blocage a été largement utilisé au
Danemark et consiste en un double ELISA utilisant les deux virus, européen et américain, comme antigènes, et
permet donc de différencier une réaction sérologique au type européen d’une réaction au type américain (25). Il a
été observé que le premier vaccin vivant atténué pour le SDRP, fait à partir d’un virus de type américain, se
transmettait à des animaux non vaccinés (3, 27), et le développement subséquent dans les troupeaux de
problèmes reproducteurs causés par la souche vaccinale a été rapporté au Danemark (3, 21). On peut s’attendre
à une réaction à la souche vaccinale de type américain dans les pays qui utilisent ou ont utilisé ce vaccin ; les
pays européens peuvent donc observer des réactions et isoler les deux types antigéniques (3, 21). L’identification
de souches de virus SDRP de type européen aux États-Unis et au Canada a aussi été rapportée (10), mais la
prévalence de l’infection par de telles souches n’est pas bien documentée.
Les anticorps contre le virus peuvent être détectés par des épreuves sérologiques aussi tôt que 7 à 14 jours
après l’infection, et les niveaux d’anticorps atteignent des titres maximaux vers 30 à 50 jours après l’infection.
Certains porcs peuvent redevenir séronégatifs entre 3 et 6 mois, mais d’autres demeurent séropositifs beaucoup
plus longtemps. Les anticorps neutralisants se développent lentement et n’atteignent pas des titres très élevés. Ils
peuvent être détectés à partir de 3 à 4 semaines après l’infection et peuvent persister 1 an ou davantage. Il a été
rapporté que la présence de complément dans le mélange réactionnel rendait le test de séroneutralisation plus
sensible (15). Il n’existe pas de recherche exhaustive quant à la durée des titres en anticorps après l’infection, et,
en outre, les résultats dépendent de l’épreuve utilisée. Les anticorps maternels ont une demi-vie de 12 à 14 jours,

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et le titre en anticorps maternels peut, en général, être détecté jusqu’à 4 à 8 semaines après la naissance,
dépendant du titre en anticorps de la mère au moment de la naissance et de l’épreuve utilisée. Dans un
environnement infecté, les porcs nés de mères séropositives peuvent séroconvertir à partir de l’âge de 3 à 6
semaines.
Ce chapitre décrit le test IPMA en détail puisque ce test peut facilement être réalisé dans les laboratoires qui ont
établi les méthodes d’isolement viral sur macrophages, et parce que ce test peut être réalisé avec un virus de l’un
ou l’autre type antigénique. Cette épreuve peut aussi être adaptée à la lignée cellulaire MARC-145 infectée par
les deux types, européen et américain (25). Une épreuve d’immunofluorescence indirecte (IFI) utilisant les cellules
MARC-145 peut également être réalisée pour la sérologie de l’infection par le virus SDRP et est décrite dans le
présent chapitre. Des kits ELISA commerciaux démontrant une bonne sensibilité et une bonne spécificité sont
disponibles et ont été comparés (9).
a) Détection des anticorps avec l’épreuve d’immunopéroxydase sur monocouche cellulaire
Les macrophages alvéolaires sont ensemencés dans les cupules des plaques de microtitrage. Après leur
adhésion, les macrophages sont inoculés avec le virus SDRP. L’objectif est d’infecter environ 30 à 50 % des
macrophages dans une cupule de façon à pouvoir aisément distinguer les sérums non spécifiques. Après
une période d’incubation, les macrophages sont fixés et utilisés comme substrat cellulaire pour la sérologie.
Une autre méthode consiste à utiliser des cellules MARC 145 au lieu des macrophages. Sur chaque plaque,
11 sérums peuvent être testés en duplicata. Les sérums testés sont dilués et incubés sur les cellules. Si des
anticorps sont présents dans le sérum testé, ils se fixeront à l’antigène présent dans le cytoplasme des
macrophages. Lors de l’étape suivante, les anticorps liés seront détectés avec un anticorps secondaire
couplé à la peroxydase de raifort (HRPO). Enfin, les cellules sont incubées avec une solution substrat
chromogène1. La lecture du résultat de l’épreuve se fait au microscope inversé.
• Ensemencement des macrophages dans les plaques de microtitrage
i) Décongeler une fiole contenant 6 × 107 macrophages/1,5 ml ;
ii) Laver les cellules une fois avec 50 ml de PBS et centrifuger la suspension cellulaire 10 min à 300 g (à
température de la pièce) ;
iii) Suspendre les cellules dans 40 ml de milieu RPMI 1640 contenant 5 % de SFB, 100 UI (Unités
Internationales) de pénicilline et 100 µg de streptomycine (milieu de croissance) ;
iv) Distribuer 100 µl de suspension cellulaire dans chaque cupule d’une plaque de microtitrage (avec une
fiole de cellules, 4 plaques peuvent être ensemencées à une concentration de 105 cellules dans
chaque cupule d’une plaque) ;
v) Incuber les plaques de 18 à 24 h à 37 °C dans une étuve avec 5 % de CO2 en atmosphère humide. Le
tampon HEPES (N-2-hydroxyéthylpiperazine, acide N-2-ethanesulfonique) peut également être utilisé
dans le milieu.
• Inoculation des cellules avec le virus SDRP
i) Ajouter dans chaque cupule 50 µl de suspension virale contenant 105 DICT50/ml, mais laisser
2 cupules non inoculées qui serviront de témoins ;
ii) Incuber les plaques de 18 à 24 h à 37 °C dans une étuve avec 5 % de CO2.
• Fixation des cellules
i) Rejeter le milieu de croissance et rincer les plaques une fois avec une solution saline ;
ii) Tapoter délicatement les plaques sur une serviette pour enlever l’excès de liquide restant et laisser
sécher (sans leur couvercle) pendant 45 min à 37 °C ;
1 Préparation de la solution chromogène
Solution stock de chromogène (3-amino-9-ethyl-carbazole [AEC]) : (a) 4 mg AEC; (b) 1 ml N,N-diméthyl-formamide.
Dissoudre (a) dans (b) et conserver la solution stock d’AEC à 4 °C à la noirceur.
Préparation de la solution substrat chromogène (préparer juste avant usage)
Préparer le tampon d’acétate de sodium 0,05 M, pH 5, comme suit : dissoudre 4,1 g d’acétate de sodium dans 1 litre
d’eau distillée. Ajuster le pH à 5,00 avec l’acide acétique 100 %.
Ajouter 1 ml de solution stock d’AEC à 19 ml du tampon d’acétate de sodium 0,05 M.
Ajouter 10 µl d’H2O2 30 % pour chaque volume de 20 ml de la solution substrat chromogène.
Filtrer la solution à travers un filtre de 5 µm.