Suivi en molécule unique des GTPases durant la migration cellulaire La polarité cellulaire est un processus clé de la biologie cellulaire et du développement. Elle se manifeste par des mécanismes complexes à l'issu desquels les composants cellulaires (protéines, organelles, cytosquelette,...) sont répartis et maintenus de façon asymétrique dans la cellule, aboutissant à l'activation locale, à l'échelle subcellulaire, de voies de signalisation. En particulier, lors de la migration cellulaire, une polarité avant/arrière se met en place, avec un système protrusif basé sur la nucléation d'actine à l'avant et la rétraction de l'arrière de la cellule. Il est maintenant établi que les GTPases Rac, Rho et cdc42 sont les chefs d'orchestre de la polarisation. Ces protéines -de petits interrupteurs moléculaires- ne sont activées qu'à l'avant ou à l'arrière des cellules dans des compartiments particuliers et en conséquence voient leurs activations se distribuer selon des gradients subcellulaires. La manière dont une cellule traite l’information extérieure pour initier puis pour maintenir ces patrons spatiotemporels d'activations biochimiques est encore largement incompris [1]. Figure 1. Cartographie de l'activité de la GTPase Rac1 dans une cellule en migration obtenue à l'aide de la sonde de FRET Raichu. Un gradient d'activité de Rac est observé de l'avant à l'arrière de la cellule. Le stage portera sur le rôle des GDIs dans la création et la régulation de ce gradient. Une classe de régulateur des GTPases, les GDIs, est soupçonnée d'avoir un rôle important dans ce phénomène. Alors que les GTPases portent une modification post-traductionnelle les localisant à la membrane, les GDIs forment un complexe avec les GTPases afin de les solubiliser dans le cytosol et de les rendre ainsi inactives. Une hypothèse que nous aimerions tester expérimentalement serait que l’association des GTPases à la membrane ainsi que leur extraction est régulée spatialement dans les cellules en migration, ce qui constituerait un mécanisme aboutissant à la polarisation observée de l'activité des GTPases. Nous proposons dans ce stage d'étudier ce problème à l'aide du suivi de particules uniques à la membrane par microscopie TIRF. Nous étudierons dans un premier temps les modes de diffusion de la GTPase Rac sous sa forme active, inactive et sauvage [2]. Cette étude sera menée dans des cellules polarisées (fibroblastes en migration) et non polarisées. Avec l’aide de protéines photoactivables, nous quantifierons dans un second temps la cinétique de départ et d'arrivée de GTPases à la membrane en fonction de la région cellulaire (avant et arrière). Un modèle mathématique pourra ensuite être développé grâce aux résultats obtenus pour caractériser l'extension spatiale et la pente du gradient. 1. 2. Pertz, O., Spatio-temporal Rho GTPase signaling - where are we now? J Cell Sci, 2010. 123(Pt 11): p. 1841-50. Lommerse, P.H.M., et al., Single-molecule diffusion measurements of H-Ras at the plasma membrane of live cells reveal microdomain localization upon activation. Journal of Cell Science, 2005. 118(9): p. 1799-1809.