Typage moléculaire par électrophorèse en champ pulsé des S

19e congrès de la de la Société Algérienne de Chirurgie Orthopédique et
Traumatologique
Typage moléculaire par électrophorèse en champ pulsé
des S. aureus isolées d’infections du site opératoire
en chirurgie orthopédique et traumatologique à
l’hôpital militaire de Constantine
A. Zerouki 1,*, H. Tali-Maamar 2, S. Abada 3, M. Naim 4, K. Rahal
1 Laboratoire
de microbiologie / HMRUC
de bactériologie médicale / IPA
3 Service de chirurgie orthopédique et traumatologique / HMRUC
4 Service de microbiologie / HCA
2 Servie
2
Introduction
La politique nationale de surveillance des infections du
site opératoire (ISO) est basée sur l’adhésion volontaire
des services de chirurgie.
En mai 2008, le service de chirurgie orthopédique et
traumatologique de l’hôpital militaire régional
universitaire de Constantine (HMRUC) s’est engagé dans
cette dynamique de surveillance en collaboration avec le
laboratoire de microbiologie.
Entre le 1er mai 2008 et 30 avril 2010 :
ƒ Nous
avons dénombré
interventions surveillées.
63
ISO
pour
1492
ƒ Un Staphylocoque a été isolé dans 52,4% des ISO
diagnostiquées (n = 33) ;
¾ S. aureus : 90,9% (n = 30)
¾ SCN : 9,1%
I. Objectif :
Étudier
les
marqueurs
épidémiologiques
phénotypiques et génotypiques des S. aureus isolés
d’ISO afin de vérifier l'hypothèse d’une dissémination
de souches clonales épidémiques dans ce service.
II. Matériel et méthodes
2. Souches bactériennes :
30 S. aureus
• Les prélèvements :
Ont été pris en considération les résultats des prélèvements
profonds :
• Peropératoires
• Ponctions et les aspirations profondes
Sont exclus : les prélèvements cutanés de type « écouvillonage »
non confirmés par un prélèvement profond.
• Examen microscopique
• Mise en culture et isolement
• Identification :
Chaque micro-organisme isolé a été identifié d’après ses caractères :
ƒ Culturaux.
ƒ Morphologiques.
ƒ Biochimiques : ID 32 Staph (Bio Mérieux).
• Étude de la sensibilité aux antibiotiques :
ƒ
Antibiogramme :
Réalisé par la méthode de diffusion sur milieu gélosé selon les
recommandations du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
ƒ
Tests complémentaires :
o
Recherche de la résistance des staphylocoques à la méticilline :
9
9
Test à la céfoxitine (diamètre ≤ 20mm).
Recherche du gène mecA par le test Genotype®MRSA (Hain Life
science); PCR multiplex + bandelette.
Ce test permet parallèlement de détecter la production de la cytotoxine de
virulence PVL (Panton Valentine Leucocidine)
3. Analyse des marqueurs épidémiologiques bactériens :
ƒ
Marqueurs phénotypiques :
o
o
ƒ
Le biotype (obtenu sur galeries ID 32 Staph).
L’antibiotype et le phénotype de résistance aux antibiotiques
Marqueurs génotypiques :
o
Electrophorèse en champ pulsé (PFGE).
Bactéries en milieu gélosé
PFGE
Méthode
de
typage moléculaire
qui permet d’obtenir
des
profils
de
restriction
caractéristiques
d’une
souche
donnée.
Les
profils
génomiques obtenus
par cette techniques
sont utilisées comme
marqueurs
épidémiologiques
moléculaires
Bactéries en milieu liquide
Lavage du culot
Bactéries emprisonnées dans un gel d’agarose
(plugs)
Tampon de lyse (lysozyme)
Tampon de protéolyse (protéinase K)
Lavage
Enzyme de restriction (Sma I)
Electrophorèse en champ pulsé
Séparation des fragments d’ADN chromosomique
Interprétation selon les critères de Tenover et al
(logiciel FPQuest)
¾ Profils identiques : même pulsotype (clone A)
¾ Profils différents de ≤ 3 bandes: sous-pulsotypes (A1,
A2, ..) du même clone (A).
¾ Profils différent > 3 bandes: souches différentes
(clone B).
Tenover FC, et al. J Clin Microbiol, 1995
II. Résultats
30 souches de S. aureus responsables d’ISO.
• L’identification des souches a été réalisée à l’aide des galeries ID 32 STAPH
• L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a révélé :
19 SARM
ƒ 11 SASM
Afin de faciliter l’interprétation des résultats, les SARM ont été analysés
séparément des SASM
ƒ
Les marqueurs
phénotypiques des
SARM :
Biotype
Caractères différentiels :
- Uréase
- Acetoine
- Pyrrolidonyl arylamidase.
Antibiotype
1
Biotype
(ID 32 STAPH)
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
2
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
3
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
4
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
5
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
6
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
7
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
8
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
9
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
10
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
11
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
12
267312610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
13
367336610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE, C
14
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE, C
15
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE, C
16
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE, C
17
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
18
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
19
367332610
P, OXA, FOX, AN, K, TM, GM, OFX, TE
Numéro
Antibiotype
P : Pénicilline, OX : Oxacilline, FOX : Céfoxitine, MOX : Moxalactame,
VAN : Vancomycine, TEC : Teicoplanine.
NA : Amikacine, K : Kanamycine, GN : Gentamicine, TM : Tobramycine, FOS :
Fosfomycine, C : Cloramphénicol, FA : Acide fusidique, TE : Tétracycline,
TMP : Triméthoprime, SXT : Triméthoprime/Sulfaméthoxazole, OFX :
Ofloxacine, RA : Rifampicine, PT : Pristinamycine, L : Lincomycine, E :
Erythromycine, CM : Clindamycine.
Antibiogramme SARM
Tous les SARM
étaient :
- Gène mecA positif
- PVL négatif
Test Genotype®MRSA (SARM mecA +, PVL-)
Marqueurs génotypique des SARM (Gels PFGE SARM)
Lambda Ladder
SARM n°13
SARM n°14
SARM n°15
SARM n°16
SARM n°17
SARM n°18
SARM n°19
Lambda Ladder
Lambda Ladder
SARM n°12
SARM n°11
SARM n°10
SARM n°9
SARM n°8
SARM n°7
SARM n°6
SARM n°5
SARM n°4
SARM n°3
SARM n°2
SARM n°1
Lambda Ladder
Selon les critères définis par Tenover :
- Pulsotype majoritaire A (souches 1 à
12).
- Pulsotype B : constitué de 3 souspulsotypes B1, B2 et B3 (souches 14,
15, 16)
- Pulsotype C : constitué de trois souspulsotypes C1, C2 et C3 (souches 17, 18
et 19).
- Pulsotype D (souche 13).
Le clone A était responsable d’une
épidémie observée durant la première
année de notre étude. Les clones B et C
étaient
responsables
de
petites
épidémies observées durant la deuxième
année. Le clone D était responsable
d’une infection sporadique.
Dendrogrammes PFGE SARM
Les marqueurs
phénotypiques des
SASM :
Biotype
Caractères différentiels :
- Uréase,
- Arginine dihydrolase
- Lactose
- Tréhalose
- Arginine arylamidase
- Pyrrolidonyl arylamidase.
Antibiotype
Numéro
Biotype
(ID 32 STAPH)
1
267312610
P, TE
2
267312610
P, TE
3
267212610
P, RA
4
067312610
P, TE
5
363311610
P
6
363311610
P
7
067312610
P, TE
8
067312610
P, TE
9
363311610
P
10
067312610
P, TE
11
363311610
P
Antibiotype
Marqueurs génotypique des SASM (Gel PFGE SASM)
Lambda Ladder
SASM n°11
SASM n°10
SASM n°9
SASM n°8
SASM n°7
SASM n°6
SASM n°5
SASM n°4
SASM n°3
SASM n°2
SASM n°1
Lambda Ladder
Selon les critères définis par Tenover :
- Profil A
- Profil B
- Profil C
- Profil D
- Profil E
(souches 4, 7, 8 et 10)
(souches 6, 9 et 11).
(souches 1 et 2).
(souche 3)
(souche 5).
Dendrogramme PFGE SASM
III. DISCUSSION
L’analyse des marqueurs phénotypiques et génotypiques des souches de
S. aureus, épidémiologiquement liées, responsables d’ISO, nous a
permis :
y De confirmer le plus fort pouvoir discriminant de la méthode
génotypique utilisée (PFGE) par rapport aux techniques phénotypiques
(biotypie, antibiotypie).
y De déceler une situation épidémique à SARM, particulièrement
distincte, observée durant le 2ème semestre de notre étude due à un
pulsotype majoritaire (A) incriminé dans 12 cas d’ISO.
Epidémie à SARM
(12 cas d’ISO)
Isolement septique
• Signalisation sur les portes des chambres et regroupement dans
des ISO à SARM :
une aile duDiminution
service avecdeunl’incidence
personnel dédié,
- 1edes
année
= 2%
• Renforcement du lavage
mains
par FHA avant d’entrer et à la
sortie de la chambre, - 2e année = 0,8%.
• Port de vêtements de protection (gants, surblouse) et utilisation
(psoins.
= 0,04)
de matériel individuel lors des
Conclusion
Les profils de restriction générés par PFGE ont permis
d’obtenir une meilleure différenciation des souches de
S. aureus que le biotypage ou l’antibiotypage et de suggérer
la présence de clones épidémiques.
Isolement septique
MERCI POUR VOTRE
ATTENTION