Principe de fonctionnement
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Cours de Cytologie & Physiologie Cellulaire ELAHCENE Promo: 2015-2016 CHAPITRE II MÉTHODES D’ÉTUDES DE LA CELLULE Plan Introduction I / Les microscopes photoniques : Le microscope photonique /M .optique ou microscope photonique à fond clair Description Principe de fonctionnement Technique histologique Le microscope photonique à fluorescence Description Principe de fonctionnement Technique de détection et de localisation de composés cellulaires II / LES MICROSCOPES ÉLECTRONIQUES : Le microscope électronique à transmission ( MET ) Description Principe de fonctionnement Techniques de coupes minces + coloration positive Technique d’autoradiographie Technique de coloration négative Le microscope électronique à balayage (MEB ) Description Principe de fonctionnement Technique de cryofracture / cryodécapage + ombrage métallique III / AUTRES TECHNIQUES Le fractionnement & isolement subcellulaire Technique d’UCD et UGD Objectifs principaux: 1- Citer les instruments d’observation des cellules 2- Nommer les techniques utilisées. 3- Associer l’instrument d’observation et la technique préparatoire de l’échantillon appropriés à l’objectif recherché. 4- Appliquer ces techniques dans la détection des altérations tissulaires CHAPITRE II Plan Introduction MÉTHODES D’ÉTUDES DE LA CELLULE Objectifs spécifiques 1. Définir la notion de pouvoir séparateur. 2. Donner le principe de fonctionnement du microscope photonique à fond clair 3. Indiquer les domaines de son application. 4. Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue d’une observation au microscope à fond clair (la technique histologique). Notion de pouvoir séparateur = pouvoir de résolution C’est la capacité de l’œil à distinguer nettement 2 points très rapprochés 0,2mm = 25 cm 0,2mm œil humain Organismes de taille plus petite Invisibles à l’œil Nécessité d’utiliser des instruments destinés à observer de petits objets dont un système de lentilles (optiques , électroniques … ) fournit une image agrandie Ces instruments les microscopes Connaissance de la cellule Etude morphologique •Description Structurale et Ultrastructurale Etude biochimique •Détection composés •Localisation cellulaires •Quantification Etude moléculaire •Nature des molécules • Leur organisation Echelle des dimensions dans le monde du vivant Les premiers microscopes optiques Microscope Carl Zeiss 1891 Microscope optique (1751) Composants du microscope optique actuel Echelle des dimensions dans le monde du vivant homme LES MICROSCOPES PHOTONIQUES : Microscope optique /Le M P à fond clair Pouvoir séparateur de 0,2µm Description Principe de fonctionnement Technique histologique HISTORIQUE Les premiers microscopes optiques Observation d’un morceau de liège Le MO simple de ROBERT HOOKE 1870 M O avec caméra numérique Schéma du MO p .24 condensateur Principe de fonctionnement : Observation par transmission Milieu Source d’éclairement Réfringent Porte 1ere échantillon image Faisceau de photons Lame en verre Lentilles en verre Lentilles objectif Résultat : image en couleur Observation Lentilles oculaire L’échantillon est traversé par des photons , les lentilles en verre permettent l’obtention d’une image réelle et agrandie qui est reprise par l’oculaire Principe de formation de l’image Le M O est un système optique à lentilles dans le but d’obtenir une image agrandie de l’échantillon à observer : L’objectif L’oculaire image agrandie inversée image agrandie virtuelle EXERCICE : titrer et légender 1 2 3 4 5 6 La technique histologique p .28 Méthode de préparation de l’échantillon pour une observation au microscope photonique But : étude morphologique et structurale des tissus prélèvement Fixation 4 – Inclusion à la paraffine Déshydratation (bains d’alcool) Blocs de paraffine Réhydratation Etalement des coupes Coloration : par des colorants chimiques spécifiques Observation des coupes Résultat : image en couleurs Épithélium de la trachée Cellule nerveuse Ilot de Langerhans du pancréas endocrine Tissu musculaire squelettique Escherichia coli observée au microscope photonique Micrographie d’un frottis sanguin humain CHAPITRE II MÉTHODES D’ÉTUDES DE LA CELLULE Plan Le microscope photonique à fluorescence Description Principe de fonctionnement Technique de détection et de localisation de composés cellulaires Objectifs spécifiques 1. Définir un fluorochrome. 2. Citer des exemples de fluomarqueurs utilisés (fluorescéine, rhodamine) 3. Donner le principe de fonctionnement du microscope optique à fluorescence 4. Déterminer les domaines de son utilisation. 5. Citer des exemples de composés cellulaires détectables en microscopie à fluorescence Schéma du microscope à fluorescence et chemin suivis par les rayons lumineux 1-lampe à arc 2-filtre d'excitation 3-miroir dichroïque 4-objectif 5-préparation 6-filtre d'émission 7-oculaire Le MO à fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents ou des molécules rendues fluorescentes par des fluorochromes. Le fluorochrome : substance chimique qui absorbe une lumière d ’énergie élevée et de longueur d’onde courte( lumière d’excitation) pour la réémettre en une lumière visible d’énergie faible et de longueur d’onde élevée (lumière de fluorescence ) . on cite la fluorescéine et la rhodamine Observation en utilisant le jeu de filtres spécifique de la rhodamine Observation en utilisant le jeu de fitres spécifique de la fluorescéine Quelques fluorochromes et leur lumière d’excitation Principe de fonctionnement du microscope à fluorescence Décomposition du Spectre de la lumière visible Chaque couleur du spectre visible correspond à une longueur d’onde déterminée Interaction lumière - fluorochrome Lumière d’excitation Lumière d’émission Principe de fonctionnement du microscope à fluorescence Le principe de ce microscope est d'envoyer une lumière excitatrice sur l'échantillon puis de séparer la lumière de fluorescence émise du reste de la lumière excitatrice afin que seule la fluorescence émise puisse être perçue par l'œil . Formation de l’image fluorescente Les longueurs d’ondes sélectionnées excitent le fluorochrome (au niveau de l’objet) ; tandis que les longueurs d’ondes servant à la formation de l’image sont celles émises lorsque le colorant fluoresce. Domaine d’application du microscope à fluorescence Détection et localisation des composés cellulaires / l’immunofluorescence Pour induire la fluorescence on associe le fluorochrome (marqueur )à une molécule (AC)qui peut reconnaître et se fixer spécifiquement sur la molécule recherchée (AG) selon le principe de la réaction immunitaire (AG-AC) qui rendra facile la détection des complexes AG -AC Technique d’immunofluorescence La technique d’immunofluorescence But : Détection ,localisation et quantification d’une ou plusieurs protéines Intérêts de la technique d'immunofluorescence Mise en évidence de la fluidité des protéines membranaires Détection , localisation, quantification de protéines cellulaires (membranaires , hyaloplasmiques ) comme les hormones , les protéines du cytosquelette Expérience de FRYE et EDIDIN (1970 ) La technique d’immunofluorescence sur hétérocaryon (expérience de Frye & Edidin 1970) , p 35 Les complexes Ag-Ac marqué diffusent dans toute la surface de l’hétérocaryon Mise en évidence de la fluidité des protéines membranaires Par immunofluorescence Résultats : déplacement des protéines par diffusion latérale dans le plan membranaire Noyaux cellulaires et fibres du cytosquelette vus au microscope à fluorescence Les chromosomes de la métaphase sont disposés en plaque équatoriale II / LES MICROSCOPES ÉLECTRONIQUES : Le microscope électronique à transmission ( MET ) Description Principe de fonctionnement Techniques de coupes minces + coloration positive Technique d’autoradiographie Technique de coloration négative T Objectifs spécifiques 1. Donner le principe de fonctionnement du microscope électronique à transmission (MET). 2. Déterminer les domaines de son utilisation. 3. Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue de sa caractérisation ultrastructurale (technique des coupes minces et contraste positif). Echelle d’observation du vivant Le microscope électronique Pouvoir séparateur de 0,2 nm Schéma MET en coupe p.24 Principe de fonctionnement Observation par transmission Principe de fonctionnement du MET Source Milieu d’éclairement Porte objet Objectifs observation de Grossissement Grille en Lentilles cuivre Faisceau objectifs Lentilles d‘électrons électromagnétiques Résultats : image en noir et blanc Sur écran fluorescent Principe de transmission dans le MET L’objet ultra fin est traversé par des électrons et les lentilles électromagnétiques permettent l’obtention d’une image agrandie qui est reprise par l’écran fluorescent . Grille en cuivre 1 – Technique des coupes minces + coloration positive / Technique cytologique p. 29 But : Etude Ultrastructurale des cellules , de ses organites et des microorganismes principe : réalisation de coupes ultrafines pour permettre le passage des électrons et le contraste aux sels de métaux lourds Etapes préparatoires pour l’observation au MET Le principe et le procédé sont les même que pour la technique histologique . La différence est dans les produits et les outils utilisés Coupes ultrafines de 300 – 600 Å sur Ultramicrotome Etalement des coupes sur grille métallique Contraste aux sels de métaux lourds , tel l’acétate d’uranyl et le citrate de plomb … Observation micrographies en noir et blanc Imprégnation dans une résine époxy Ultramicrotome blocs de résine Coupes ultrafines 300 – 600 Å Récupération des coupes sur grille Ultramicrotome Coupes ultrafines 300 – 600 Å Ultrastructure de la membrane plasmique du globule rouge (aspect tristratifié) Ultrastructure d’un monocyte sanguin humain Polynucléaire basophile Macrophage observé au MET Escherichia Coli PAR COLORATION POSITIVE Virus de l'Immunodéficience Humaine Portion d’une cellule hépatique Portion d’une cellule glandulaire noyau glycogènes RE mitochondries nucléole Objectif spécifique 1. Indiquer l’apport de chaque procédé de contraste électronique (autoradiographie et coloration négative) dans l’analyse morphologique d’un échantillon. 2. Indiquer les techniques de contraste et d’analyse applicables sur les structures isolées (chromatographie et électrophorèse). 2 – La technique d’autoradiographie : But: Localisation , quantification et suivi de la cinétique des molécules organiques (protéines , acides nucléiques) dans la cellule Principe: Marquage et suivi de molécules intracellulaires par des isotopes radioactifs (C14 , N15 ,H3 …..) Principe de la technique d’autoradiographie p .34 Les sels de Bromures d’argent ( Bromures d’argent ) contenus dans l’émulsion sont réduits par le rayonnement radioactif et apparaissent sous forme de grains noirs Localisation de l’ADN par un marquage de la thymidine radioactive Localisation de la leucine dans la cellule pancréatique par autoradiographie taches noires Localisation et suivi du déplacement de l’ARN dans la cellule après marquage de l’uridine par un isotope radioactif Après 15minute , l’ARN est dans le noyau Après 90 minute , l’ARN est dans le cytoplasme 3 -Technique de coloration négative technique de contraste et d’analyse applicable sur les structures isolées Intérêts Description de la morphologie externe de macromolécules ,de microorganismes et d’organites (ex : ribosomes , virus (après isolement), ATPosomes…) Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette(microtubules , microfilaments) ainsi que la chromatine et pores nucléaires après leur isolement La coloration négative P 32 Principe Isolement de la structure à étudier par ultracentrifugation Contraste de la structure aux sels de métaux lourds Bactériophages Virus de la Mosaïque du tabac ATPosomes des crêtes mitochondriales Microfilaments d’actine Autres techniques de contraste et d’analyse applicables sur les structures isolées La chromatographie L’ électrophorèse III / AUTRES TECHNIQUES Le fractionnement & isolement subcellulaire Technique d’UCD et UGD Objectifs spécifiques 1. Citer les procédés d’isolement des composants cellulaires (UCD, UGD). 2. Lister les structures obtenues dans chaque culot après application d’une ultracentrifugation différentielle (UCD). 3. Lister les structures recueillies à partir de chaque culot après application d’une ultra centrifugation sur gradient de densité (UGD). But : Séparation des organites cellulaires et les macromolécules biologiques contenus dans un homogénat suivant leur différence de poids moléculaire Principe : Elle consiste à séparer les différents constituants le plus souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante 4 - Technique d’isolement A Homogénéisation du tissu B Ultracentrifugation Ultracentrifugation différentielle UCD Homogénat cellulaire Culots Surnageants Ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose UGD Bandes P .37 Homogénat cellulaire La centrifugeuse et centrifugation Cette technique permet la séparation des macromolécules et des organites cellulaires selon leur densité La centrifugeuse tourne à grande vitesse afin d’isoler les différents constituants des cellules AXE P .38 Procédé d’ultracentrifugation différentielle (P .39) g = force de gravité terrestre Principe de la centrifugation Les éléments se déposent selon leur poids et leur taille But : séparation des organites cellulaires et même des petites particules biologiques présentant de très faibles différences dans leurs caractéristiques, et ce en fonction de leur densité Principe : elle consiste à déposer l’échantillon (culot ) dans un gradient de saccharose (pour isoler les organites). Après centrifugation les organites se répartissent dans les zones de gradient de même densité qu’eux . Les zones de gradient ou bandes finales sont collectées en perçant le tube de centrifugation . Procédé d’UGD 12 % saccharose La centrifugation entraine le déplacement des composants du culot à travers le gradient de densité et s’arrêtent en une bande dont la densité est égale à leur propre densité Culot d’UCD Gradient de densité Récupération des bandes Organite isolé contrasté aux métaux lourds observés au MET ( le contraste est négatif ) Contraste négatif de virus isolés des cellules infectées Nucléocapside du virus de la rougeole LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE À BALAYAGE Pouvoir séparateur de 22 nm Description Principe de fonctionnement Technique appliquées : Technique de cryofracture / cryodécapage + ombrage métallique L’ ombrage métallique sur échantillon entier Objectifs spécifiques 1. Donner le principe de fonctionnement du microscope électronique à balayage. 2. Déterminer les domaines de son utilisation. Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue de son analyse tridimensionnelle (la technique de cryodécapage). Microscope à balayage (MEB) observation par réflexion Principe de fonctionnement L’échantillon reçoit des électrons primaires qui balayent sa surface mais seuls les électrons émis qui seront utilisés pour la formation de l’image( en trois dimensions ) sur l’écran de télévision. L’observation par réflexion : système de balayage Principe de formation de l’image en MEB Electrons primaires Electrons secondaires Détecteur d’électrons secondaires Grille Echantillon métallisé Image en 3D sur Écran TV Techniques associées au MEB But : étude tridimensionnelle des surfaces internes et externes après un contraste par ombrage métallique Principe Contraste de la surface par ombrage métallique et son balayage par le faisceau d’électrons MEB Ombrage métallique Echantillon entier métallisé Etude des surfaces externes Technique de répliques / Cryodécapage + ombrage métallique Obtention d’une réplique Etude des surfaces internes Observation de surfaces internes d’échantillons après cryodécapage (technique des réplique) Aspect en 3 D Obtention d’une réplique (moule) de la surface interne d’une cellule grille Technique des répliques P . 30 Réplique de la membrane plasmique Réplique d’une portion d’hépatocyte Réplique de la surface du noyau Observation de surfaces externe d’échantillons entiers après ombrage métallique Aspect en 3 D Principe de la réflexion p. 25 l’objet observé est massif . il est bombardé d’électrons et ses atomes provoquent l’émission d’électrons secondaires qui fournissent une image en 3 D . épithélium de la paroi bronchique observé au MEB Staphylococcus aureus Vu au microscope à balayage Chromosomes observés au microscope à balayage Spermatozoïde perforant l’ovocyte Aspect en 3 D de bactériophages Aspect biconcave de globules rouges au MEB
