Multiplication végétative in vitro du Saint

Multiplication végétative in vitro du Saint-Paulia
1. PRINCIPE:
La multiplication végétative in vitro est une technique de reproduction asexuée. Partant d'un fragment de
feuille saine, on peut obtenir des milliers de plantes identiques à la plante mère dans un temps très
court.
Obtenir une telle multiplication avec les techniques de culture classique serait impossible car la
contamination par les bactéries du sol et la nécrose détruiraient le fragment .
Une feuille de Saint-Paulia est désinfectée, rincée à l'eau déminéralisée stérile, découpée avec un
scalpel dans une boite de pétri stérile puis déposée dans un milieu de culture au préalable stérilisé.
Après environ 4 à 6 semaines, sous l'effet des phytohormones contenues dans le milieu, on voit
apparaître un grand nombre de feuilles de quelques millimètres. A ce stade, on peut diviser cette touffe
en plusieurs parties et les placer de nouveau sur le milieu SP 1. De nouvelles feuilles apparaissent et la
touffe se reconstitue. Après 4 semaines, on peut procéder de nouveau à une division de la touffe : cette
opération s'appelle la MICROPROPAGATION puisqu'on peut obtenir en quelques mois un grand nombre
de touffes. Quand on a obtenu suffisamment de touffes , on peut les repiquer sur un milieu ne contenant
plus de phytohormones : le milieu SP 2 .
Après 2 ou 3 mois, les plantules avec feuilles, tiges et racines sont transférées en petits pots et portées
en serre avant de les faire pousser à l'air libre : c'est la phase d1ACCLIMATATION .
2. MANIPULATION:
2.1. Préparation du milieu de culture:
– Stériliser à l'autoclave le milieu de culture puis le maintenir en surfusion.
– Répartir le milieu SP 1 dans des pots stériles de culture à raison de 15 à 20mL par flacon en
prenant la précaution de travailler en conditions stériles, sous la hotte à flux laminaire et après
s'être soigneusement désinfecté les mains à l'alcool .
– Incliner les flacons jusqu'à solidification.
2.2. Désinfection de la feuille de Saint-Paulia :
– Laver soigneusement à l'eau courante une feuille.
– Tremper la feuille environ 5 minutes dans une solution de mouillant ( eau additionnée d'une
goutte de liquide vaisselle).
– Désinfecter la feuille par passage dans l'alcool à 70 pendant 15 secondes en l'agitant puis la
déposer dans une solution de Domestos diluée au 1/5.
– Rincer ensuite soigneusement la feuille dans 3 flacons contenant de l'eau distillée stérile (3 fois 3
minutes en agitant de temps en temps).
A partir de la sortie de la solution désinfectante, toute la manipulation doit être réalisée dans des
conditions stériles :
– travailler sous la hotte à flux laminaire ou près du bec bunsen.
– désinfecter soigneusement le plan de travail à l'eau de Javel ou à l'alcool
– les instruments (pinces, scalpels, ...) sont désinfectés par passage à la flamme après trempage
dans l'alcool puis posés sur une surface stérile (B. Pétri). Ils ne doivent pas être utilisés trop
chauds.
2.3. Mise en culture:
– Dans la boite de Pétri, découper un petit carré de 1 cm de côté à la base de la feuille (ce
fragment contenant un morceau de nervure ) . Ces fragments sont appelés explants.
– Déposer les explants sur le milieu de culture, face inférieure contre le milieux.
– Fermer les flacons de culture sans trop serrer et entourer la partie supérieure de papier
cellophane.
– Laisser les flacons à 20-25°C soit à la lumière du jour, soit sous un éclairage artificiel
convenable.
Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles
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2.4. Micropropagation: Au bout de quelques semaines, l'explant gonfle, des feuilles apparaissent et on
peut alors procéder a la propagation.
– La:touffe est divisée stérilement en plusieurs fragments qui sont placés dans des flacons de
milieu SP 1.
– La touffe se reconstitue et, au bout de quelques semaines (4 environ), on peut de nouveau
procéder à la propagation.
2.5. Enracinement: Lorsque la touffe est bien développée sur le milieu SP 1, elle peut être transférée
stérilement et délicatement sur un milieu d'enracinement SP 2.
La touffe se développe, les feuilles deviennent plus grandes et des racines apparaissent. Lorsque la
plantule est suffisamment développés (après 4 à 8 semaines), elle peut être transférée en pot, sous
serre.
2.6. Transfert en serre: A partir de ce stade, les conditions d'asepsie ne sont plus indispensables mais il
faut éviter que la plante, encore fragile soit soumise à des contaminations importantes.
– Sortir les plantules du pot en veillant à ne pas abîmer les racines (éliminer le gel qui colle
éventuellement aux racines en les trempant dans l'eau).
– Sectionner quelques mm des racines et les tremper dans un mélange terreau-tourbe de
consistance épaisse. Cette opération: le pralinage sert à préparer les racines à la mise en terre.
– Placer la plante dans un pot contenant un mélange terreau-tourbe humide.
– Recouvrir le pot d'une demi-bouteille d'eau minérale avec son bouchon qui va jouer le rôle d'une
mini-serre.
– Au bout de quelques jours, pour acclimater la plante à une atmosphère plus sèche, on peut
enlever le bouchon puis quand la plante est suffisamment vigoureuse, enlever totalement la
bouteille.
Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles
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