TP Liaison Antigène Anticorps
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Immunologie TP : La liaison antigène / anticorps Objectifs méthodologiques - Réaliser une manipulation à partir d'un protocole - Utiliser des logiciels de traitement de données et de visualisation - Réaliser un schéma - Adopter une démarche explicative Objectifs notionnels Spécificité antigène / anticorps Problème à résoudre : Nous savons qu'un antigène est une molécule, un fragment de molécule ou un groupe de molécules qui, introduite chez un individu, induit la synthèse d'anticorps. La synthèse d'un anticorps est donc la signature d'une réaction immunitaire. Quelles sont les propriétés des anticorps : leur nature, leur spécificité, leur fonction, les conditions de leur production? 1. Activité 1 : Expériences d’électrophorèse de sérums On réalise deux électrophorèses : - a : une électrophorèse du sérum d'une souris saine - b : une électrophorèse de la même souris 15 jours après une injection d'antigène On réalise ensuite une lecture des électrophorégrammes par mesure de la densité optique : Electrophorégramme a : Electrophorégramme b : Ligne de départ Cathode Sens de migration Ligne de départ Anode Cathode Sens de migration Anode 1.1. Rappeler le principe d'une électrophorèse. 1.2. Indiquer les résultats observés en complétant chaque électrophorégramme (utilisez les mesures de la densité optique). 1.3. En déduire la nature des anticorps et les conditions dans lesquelles ils sont sécrétés. 2. Activité 2 : Observations microscopiques On met des anticorps (solubles) en présence d'antigènes (solubles). On obtient un précipité (insoluble) appelé complexe immun. 2.1. Légender les deux photos de microscopie électronique ci-dessous avec les mots : antigène, anticorps. 2.2. Sur les photos, colorer : en rouge, sur les anticorps, les sites de fixation sur l'antigène en bleu, sur les antigènes, les régions reconnues par les anticorps Photo a (x 500 000): Complexe immun Photo b (x1 000 000): Une molécule d'anticorps (en forme de "Y") Immunologie 3. Activité 3 : Test d'Ouchterlony 3.1 Principe : C’est l’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact se traduit par un arc de précipitation visible à l’œil nu lorsque les deux solutions réagissent (complexe immun insoluble). 3.2 But de l'expérience : On veut montrer que la réponse immunitaire est spécifique. Pour cela, on a injecté un antigène à un lapin : de l’albumine de bœuf. Trois semaines plus tard, on prélève du sérum à ce lapin (tube S) afin de rechercher la présence d'anticorps. Vous allez donc tester la spécificité de ce sérum à l'aide de différents antigènes : tube S : sérum de lapin (à qui on a injecté un antigène) tube A : eau distillée (témoin) tube B : Caséine tube C : Hémoglobine tube D : Albumine de bœuf tube E : Ovalbumine Attention, tous les produits utilisés sont des produits de substitution et non de véritables anticorps et antigènes. 3.3 Préparation d’un gel d’Agar à couler dans une boîte de Pétri : • • • • • • • Peser dans la coupelle 0,2g d’Agar prélevés à l’aide de la spatule. Verser 14 mL d'eau puis l’Agar dans le Bécher et dissoudre soigneusement l’Agar avec la spatule. Chauffer le mélange en remuant à la spatule jusqu'à ce que le mélange devienne limpide et arrêter au tout début de l’ébullition. Retirer à l’aide de la pince en bois et attendre une minute pour manipuler le Bécher sans vous brûler. Pipeter 5 mL de gel d’Agar chaud et fluide et versez-le dans une boîte de Pétri. Egaliser le niveau et supprimer rapidement les bulles. Ne pas remuer la boîte avant prise du gel d’Agar : environ 5 min. 3.4 Réalisation des tests : • Creuser les puits nécessaires avec l’emporte-pièce dans la gélose de la boîte de Pétri (un trou central et 5 trous autour) avec un gabarit. Utiliser le cure-dent pour éliminer les disques de gélose si nécessaire. Attention à ne pas fendre la gélose. • Marquer, sur la boite de Pétri, la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l’anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. Compléter le schéma de la boîte de pétri ci-dessous en indiquant la disposition des différents produits. • Remplir les puits. Le produit prélevé dans un tube avec un compte goutte propre doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d’agar. La surface de dépôt doit être plane (ni concave, ni convexe). • Prévoir les résultats dans 24 h, si notre hypothèse de spécificité des anticorps par rapport à un antigène est juste. • Observer les résultats 24 h plus tard, en plaçant la boîte sur un fond noir en utilisant un éclairage rasant. Noter ces résultats sur le schéma de la boîte ci-dessous. • Conclure. • Réaliser un schéma, à l'échelle moléculaire, permettant d'expliquer les résultats obtenus. Schéma de la boite de Pétri Immunologie 4. Activité 4 : Spécificité moléculaire de la liaison antigène-anticorps 4.1 Mise en évidence de la structure des anticorps Ouvrir le fichier iggtotal.pdb avec le logiciel Rastop. . Ce fichier représente une immunoglobuline humaine (= Anticorps) entière anti-VIH. Afficher cette molécule en rubans. Colorer chaque chaîne différemment. Afficher les ponts disulfures présents entre les chaînes. Sans fermer Rastop, ouvrir le dossier igg-si.edi avec Anagène. Il contient les 4 séquences correspondant aux quatre chaînes de l’immunoglobuline observée avec Rastop. Attribuer les séquences h, i, l, m, aux 2 types de chaînes mises en évidence à la question précédente. Comparer ces séquences 2 à 2 (deux chaines « lourdes » h et i, deux chaines « légères » l et m). Ouvrir, avec Anagène, le dossier igg-vi.edi. Il contient 8 séquences correspondant aux chaînes lourdes et légères de 4 Anticorps différents. Effectuer une comparaison des chaînes légères d’une part, et des chaînes lourdes d’autre part. Noter vos observations. Formuler une hypothèse sur la fonction de cette partie variable. Compléter et légender le schéma ci-dessous d’une molécule d’anticorps. 4.2 Mise en évidence de la fonction des anticorps Dans Rastop ouvrir 1ACY et 1E 6J qui représentent les extrémités d’un des deux bras courts de deux anticorps anti VIH différents liés avec un antigène (gp120 et p24). Afficher simultanément ces deux représentations moléculaires à l’écran. Pour chacune, représenter l’antigène sous la forme de sphères rouges et la partie variable de l’anticorps identifiée sous forme de rubans colorés comme précédemment pour chacune des deux chaînes. Colorer le fond d’écran en blanc. Copier vos images sous Word et utiliser les fonctionnalités de Word pour les légender. Préciser la localisation de la zone de fixation de l’Ag.
