Résistance au froid chez les plantes alpines

RAPPORT DE STAGE
Résumé
INTRODUCTION
J’ai réalisé mon stage au sein du
département d’écophysiologie Végétale du
laboratoire d’écologie, systématique et
évolution de l’université paris XI, plus
particulièrement sur la physiologie des
plantes en conditions extrêmes. Les études
sont réalisées par Peter Streb,en grande
partie à la station alpine de l’université
Joseph Fourier de Grenoble durant l’été,
située au col du Lautaret à 2100m
d’altitude. Ces études concernent quelques
plantes alpines, en particulier Soldanella
Alpina et Ranonculus Glacialis, qui sont
soumises aux fortes contraintes de l’étage
alpin. En effet, l’étage alpin situé entre
2300mètres et 3000m dans les alpes, est un
milieu ou les conditions climatiques
peuvent varier très rapidement et atteindre
des valeurs extrêmes. Par exemple au
Lautaret, il peut geler tout les mois, il
arrive ainsi qu’il neige durant les mois
d’été, alors quelques heures plus tard,
l’intensité du rayonnement devient très
forte pouvant atteindre jusqu’à 3000 µmol
de lumière /cm2 et les UV sont jusqu’à
30% plus fort qu’en plaine. Les basses
températures ralentissent le métabolisme,
alors que les fortes lumières peuvent
endommager le système photosynthétique
en formant des formes d’oxygène réactif
très toxique. Du fait de la présence de la
neige jusque tard au printemps, le cycle de
vie des plantes alpines ne dure que très peu
de temps entre les mois de juin et octobre.
Certaines plantes renouvellent entièrement
leur appareil photosynthétique grâce aux
réserves accumulées l’année précédente,
d’autres telles que Homogyna Alpina,
Soldanella Alpina, et Geum Montanum
sont capables de garder leurs feuilles
durant tout l’hiver sous la neige et ainsi, à
la fonte, ces plantes réalisent la
photosynthèse rapidement.
A la sortie de la neige, le changement de
conditions de ces feuilles est assez rapide.
Les feuilles passent d’un milieu protégé
des fortes lumières, avec une température
constante, à un milieu variant et contrasté.
Les feuilles sont elles adaptées aux
conditions externes dès leur sortie de la
neige ? On a cherché à comparer ces
feuilles aux nouvelles synthétisées, et aux
feuilles après la sortie de la neige, sur
différents points : a savoir, la capacité
photosynthétique, leur protection au stress
oxydatif par la formation de molécules
antioxydantes telles que l’ascorbate
glutathion, induite par les fortes lumières et
UV, et leur protection par les pigments et
molécules épidermiques phénoliques
indispensable à la protection au UV.
( Caldwell et al. 1983; Tevini et al. 1991;
Bornman and Teramura 1993; Jordan
1996)
D’autre part, afin de mieux comprendre si
les UV sont un stress pour les plantes en
altitude, et peuvent influencer sur les
performances de la plante, (ainsi que dans
une optique de compréhension du futur sur
la productivité photosynthétique, due à une
déplétion d’ozone), l’étude de mélèzes
sous filtre absorbant les UV a été réalisée
profitant d’un projet mis en place par
l’INRA au jardin alpin du col du Lautaret.
Au contraire des plantes sortant de la
neige, cet expérience permet de tester
l’effet de la soustraction d’un possible
stress UV de la plante sur des feuilles
nouvellement synthétisées. La contribution
des UV-B aux radiations solaires totales
tend à augmenter avec l’altitude ( ref),
donc on peut simuler ainsi une
augmentation d’UV-B en plaine. Les
rayonnements UV-B entre 280 et 320nm
ont une faible transmitance et peuvent
potentiellement causer des dommages chez
les organismes.
Dans les deux études sur plantes alpines et
mélèzes, on a cherché à comparer la
capacité photosynthétique, la protection au
stress oxydatif et la protection aux UV.

Matériel et Méthodes
Matériel Végétal et lieu de récolte :
Les feuilles des plantes alpines ont été
ramassées durant les mois de juin et juillet
entre le col du Lautaret et le col du
Galibier entre 2400 et 2700m d’altitude
dans le lieu décrit dans Streb et al. (1997 ) .
Ces plantes alpines sont Soldanella Alpina,
Geum Montanum. Trois types de plantes
ont été ramassées. Les plantes « sous la
neige » sont ramassées en creusant, et
cassant les bord des névés, les plantes en
limite de neige ou à un ou deux jours après
la neige, sur les bordures du névé, les
plantes déneigées depuis plus d’une
semaine sont ramassées dans des zones
plus éloignées des névés. D’autre part, les
études sur les UV ont été réalisées sur 30
Mélèzes plantés durant l’année 2001 pour
une étude de l’INRA de Mr ROSE, au
jardin alpin botanique du col du lautaret.
Ces arbres poussent soit sous des filtres
filtrant les UV-B (280-320nm), soit sous
une plaque en plastique (« filtre
plastique ») ou bien« sans filtre ». Dans
tout les cas, les arbres sont arrosés par un
système automatique manière identique
tous les jours.
Les études ont été réalisées au Laboratoire
de la Station alpine du col du Lautaret de
l’université Joseph Fourier de Grenoble à
2100 mètres d’altitude.
Mesure de croissance
Les mélèzes ont été mesurés en hauteur à
l’aide d’une règle en bois dépliable du sol,
à la hauteur de la pointe de la plus haute
épine.
Trois branches ont été marquées, sur 3
arbres de chaque condition. Sur chaque
branche a été mesuré le nombre de pousses
d’épines ainsi que la longueur de la
branche. Ces mesures ont été réalisées
régulièrement au cours du mois de juillet.
Mesures des échanges gazeux
Ces mesures sont réalisées à l’aide d’une
électrode à oxygène Hansatech décrite
dans Streb an s al. ( 1998) à différentes
températures pour l’étude de la sortie de la
neige des plantes alpines, et à 25°C pour
l’étude des mélèzes.
On place d’abord les feuilles à l’obscurité
pour mesurer la respiration, puis à trois
intensités lumineuses successivement :
60,3, 256 et 860 µmol/m².
Mesures enzymatiques et antioxydants:
Nous avons mesuré les activités de trois
enzymes intervenant dans le système de
protection contre le stress oxydatif :
Catalase ( Cat) qui permet de détoxifier
H2O2 dans les péroxysomes ; Ascorbate
Peroxydase ( APx) qui détoxifie H2O2
dans le cytoplasme en utilisant
l’ascorbate ; Glutathion Réductase qui
réduit glutathion afin de régénérer
l’ascorbate. L’activité de la glycolate
oxydase intervenant dans la
photorespiration a été aussi mesurée. La
méthode appliquée est celle de Streb et al.
(1997)
Afin d’obtenir l’activité spécifique des
enzymes, on a mesuré en parallèle les
protéines totales des extraits. La méthode
est issue de Lowry and al ( 1951).
Par ailleurs, on a mesuré aussi le taux
d’antioxydants que sont l’ascorbate et le
glutathion en suivant la méthode décrite
dans Noctor and al. ( 1998).
Ces mesures enzymatiques ne sont
réalisées que sur Soldanella Alpina car la
méthode ne peux s’appliquer à Geum
Montanum pour des raisons d’oxydation
dans la plante lors du broyage rendant
impossible les mesures.
Mesures de pigments :

Fluorescence chlorophyllienne
Les mesures sont réalisées à l’aide d’un
analyseur photosynthétique (Mini-Pam; H.
Walzeltrich, Germany). La fluorescence
initiale (Fo) est déterminée après excitation
d’une feuille adaptée à l’obscurité, avec
une lumière modulée qui confirme que la
lumière du Mini-Pam ne sature pas les
centres réactionnels du PSII. Le maximum
de fluorescence (Fm), est mesuré après un
pulse de lumière d’environ 7000µmol/m.s.
On obtient le rendement maximal de
photosynthèse ŋ=(Fm-Fo)/Fm
Mesure de l’absorption UV
Les mesures ont été réalisées à l’aide d’un
DUALEX 3.3. ( Goulas et al. 2004 ) Cet
instrument est une pince à feuille portable
qui fournit une mesure quantitative de
l’absorbance de l’épiderme des feuilles des
Végétaux dans le domaine de l’ultraviolet
à la longueur d’onde de 375 nm. La mesure
est basée sur l’utilisation de la fluorescence
de la chlorophylle excitée à deux longueur
d’onde( UV et rouge) et sur l’effet d’écran
de l’épiderme qui absorbe une partie de la
lumière UV d’excitation et qui réduit la
quantité de lumière responsable de
l’excitation de la fluorescence de la
chlorophylle.
Les mesures sur les mélèzes ont été
réalisées sur 6 pousses d’épines de chaque
arbre.
Les valeurs obtenues pour les feuilles des
plantes alpines sont une moyenne de
l’absorption de la face supérieure et
inférieure de chaque feuille.
Statistique
Les comparaisons de moyenne ont été
réalisées par un test de student sur le
logiciel Sigmaplot. Les différences sont
considérées comme significativement
différentes si la p value est inférieure ou
égale à 0, 01
Résultats
Etude des mélèzes sous filtre UV
Echanges gazeux
La mesure de la respiration et de la
photosynthèse des mélèzes placés sous les
trois différentes conditions ne montrent pas
de différences significatives. De plus, le
rendement photosynthétique maximum est
de 0,75 pour les trois types
Croissance
La mesure de la hauteur révèle que les
mélèzes sans filtre sont plus petits
d’environ 5 cm que ceux placés sous filtre
UV et plastique ( pvalue<0,10), cependant
les mélèzes sous filtre UV et plastique
n’ont pas une hauteur significativement
différente ( pvalue>0,10).
La croissance globale en hauteur des arbres
au cours du mois de juillet est très faible,
mais ce sont ceux sous filtre qui poussent
le mieux. La croissance moyenne des
branches semble varier selon les conditions
de protection. On ne peux pas dire que la
croissance soit significativement différente
entre les trois types de conditions (
pvalue>0,1), mais la croissance des
branches des mélèzes sous filtre UV et
sans filtre est cependant relativement
différente ( p value= 0,11). Les mélèzes
sous filtre plastique sont ceux qui poussent
le mieux en hauteur et en longueur des
branches.
Absorption UV et anthocyanes
A chaque date de mesure, des tests
statistiques comparant la valeur
d’absorption UV des mélèzes sous les trois
conditions ont été réalisés. On n’observe
aucune différence significative entre les
trois types, à chaque date. De plus,
l’évolution de l’absorbance au cours du
mois de juillet a été mesuré, ce qui ne
montre aucune évolution significative de
l’absorbance UV pour aucun des mélèzes

quelque soit ses conditions. Cependant, la
moyenne sur le mois de juillet de chaque
conditions montre que les mélèzes sous
UV ont une absorption plus faible que les
autres.
Les mesures dualex et les mesures de taux
de flavonols parallèlement sur des mêmes
feuilles ont permit d’établir une relation
linéaire entre ces deux valeurs de pente
22 ,71. ( R²=0,65)
Les mélèzes ont des taux d’anthocyanes
très faibles voire nulle, mais le taux de
flavonols varie selon les conditions. Les
mélèzes sous filtre UV ont un taux moyen
de flavonols plus faibles que ceux sous
filtre plastique ou sans filtre.
Mesures enzymatiques et antioxydants
Les mesures enzymatiques ne montrent
pas de différence nette entre les conditions.
Il semblerait que l’activité catalase soit
plus faible pour les mélèzes sous filtre UV,
mais pour les autres enzymes, on n’a pu
mesurer correctement les activités ou bien
on n’observe pas de différence
significative.
De plus, les mesures de taux
d’antioxydants ne montrent pas non plus
de grande différence. Le taux d’ascorbate
n’est pas significativement différent.
Cependant, le taux de glutathion quasi nul
pour les mélèzes sous filtre UV, ne l’est
pas pour les mélèzes sans filtre.
Etude de la sortie de la neige de S.Alpina
et G. Montanum
Absorption UV
Les mesures d’absorption UV des feuilles
de S. alpina, Geum Montanum montrent
des valeurs globalement élévées par
rapport à des feuilles de le plantes de la
mêmes famille poussant en plaine ou à plus
faible altitude. Pour S. Alpina, les feuilles
sous la neige ont une absorption UV
moyenne plus faible que les feuilles qui
sont sorties de la neige (p-value=0,004).Ce
changement se fait de manière progressive
puisque l’absorption UV des feuilles en
limite de neige ( 1 ou 2 jours après la neige
au maximum) présente une différence que
faible avec les feuilles sorties de la neige
depuis plus d’une semaine ( pvalue= 0,10).
Les mesures réalisées sur Geum
Montanum montrent tout comme la
soldanelle que les feuilles présentent une
absorbance UV plus faible que les feuilles
sorties de la neige depuis une semaine ( p
value = 0, 04). Le changement se fait de
manière plus rapide que les feuilles de
soldanelle puisque la différence
d’absorption entre les feuilles en limite de
neige et celles sorties de neige depuis une
semaine est faible ( p value= 0,93).
Echanges gazeux et photosynthèse
Sur le graphique, on observe que
globalement la capacité photosynthétique
de la soldanelle sous la neige est inférieure
de presque moitié à celle d’une jeune
feuille de soldanelle quelque soit la
température. La température optimum pour
une feuille sous la neige ou jeune feuille,
est d’environ 25°C quelque soit l’intensité
lumineuse.
Par ailleurs, le rendement
photosynthétique maximal mesuré par
fluorescence est plus faible pour les
feuilles de soldanelle sous la neige que
celle sorties de la neige depuis plus d’une
semaine.
Les feuilles de Geum Montanum semblent
elles aussi avoir leur rendement
photosynthétique qui augmente avec la
sortie de la neige car les feuilles en bordure
de névé, donc sortie de la neige depuis
moins de 2 jours, n’ont pas un rendement
photosynthétique maximal comme celles
sorties depuis plus d’une semaine.
Mesures enzymatiques et antioxydants
L’activité des deux enzymes de
détoxification directe de H2O2, c'est-à-dire
Catalase et glutathion réductase ont une

activité plus forte chez les Soldanelles
après la neige que sous la neige. L’activité
de Ascorbate peroxydase et glycolate
réductase ne change pas significativement
avant et après la neige. Quant au taux
d’antioxydant, il est plus fort dans les
feuilles après la neige que sous la neige. Le
taux de glutathion dans les feuilles après la
neige est environ 3 fois plus fort que celui
des feuilles sous la neige. La différence est
moins marquée avec l’ascorbate mais on
observe une augmentation du taux avec le
temps où la feuille est sortie de la neige.
Discussion
Mélèzes sous filtre UV
L’ensemble des mesures effectuées sur les
mélèzes montrent que le fait de placer les
mélèzes sous filtre UV ne change pas de
manière importante leur physiologie, seule
une différence très légères peut être notée.
Oter un possible stress à ces arbres ne
semble pas leur permettre de mieux utiliser
leur capacité photosynthétique. D’un point
de vue protection au stress, les arbres ne
présentent pas de grandes différences entre
conditions. Cependant, on trouve un peu
plus de glutathion et d’activité catalase, et
un plus fort taux de flavonols absorbant
l’UV chez les arbres soumis aux UV
ambiants, ainsi qu’une absorption à l’UV
globalement supérieure même si la
différence n’est que faible. Les flavonols
semblent corrélés avec l’abosrbance UV.
Or les flavonols sont des polyphénols, qui
eux-mêmes sont connues pour former un
écran dans l’épiderme filtrant les UV. L
mélèzes soumis à l’UV ambiant sont donc
un peu plus protégés contre le stress
oxydatif et aux UV. Il est probable aussi
que les mesures soit faussées pour
différentes raisons, la première étant que
les mélèzes ont été placés sous filtre à la
fin juin alors que ses feuilles étaient déjà
sorties depuis presque un mois, et donc
toutes soumises aux mêmes conditions. La
seconde raison pourrait être que justement
les mesures n’ont pas été réalisées toutes
sur les nouvelles pousses sorties sous les
filtres à cause de leur taille trop petites et
leur trop faible nombre, mais plus souvent
sur les pousses sorties avant la mise en
place des filtres. Il possible aussi que
l’adaptation à un nouvel environement plus
favorable nécessite plus d’un mois.
Par ailleurs, la différence entre filtre
plastique et UV est souvent beaucoup
moins forte qu’entre Mélèzes sous filtre
UV et sans filtre. On peut penser que le fait
d’avoir un filtre au dessus des mélèzes les
protège du vent, et permet d’avoir une
température moyenne plus élevée par un
effet de serre crée par le filtre. Les
conditions extérieures sont donc
certainement moins contrastées. Et des
mesures montrent que les filtres UV
absorbent environ 200µE de lumière et les
filtres Plastiques, environ 100µE.
Plantes alpines
A la sortie de la neige, les plantes alpines
sont soumises aux contraintes du milieu
extérieur, en particulier au stress causé par
les fortes lumières et UV précédemment
filtrés par la neige. Les études réalisées cet
été, montre que les feuilles de Soldanella
Alpina et Geum Montanum sous la neige
n’ont pas les mêmes propriétés que les
feuilles sorties de la neige. Hors les feuilles
qui sortent de la neige au printemps étaient
quelques mois avant la neige adaptées aux
lumières de l’étage alpin. Ces feuilles ont
donc perdues une partie des composés
protecteurs durant l’hiver. Cette perte est
certainement due à une oxydation des
molécules, malgré le ralentissement des
réactions à des températures autour de 0°C.
Les plantes sous la neige ont une capacité
photosynthétique inférieure. Ceci peut être
dû d’une part à un nombre moins important
de composés, enzymes intervenant dans la
photosynthèse telle que la rubisco qui sont
des facteurs limitant. On peut penser aussi
à une utilisation de l’énergie lumineuse