24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 24 Régulation des gènes de virulence par la phase de croissance chez les bactéries à Gram négatif Thomas Lautier et William Nasser Unité de Microbiologie et Génétique composante INSA, UMR CNRS-INSA-UCB 5122 Domaine scientifique de la Doua Bâtiment A. Lwoff 10 rue R. Dubois, 69622 Villeurbanne cedex Les auteurs Thomas Lautier, 25 ans, est en première de thèse à l’INSA de Lyon. Son travail porte sur le contrôle de l’expression de gènes de virulence par la phase de croissance chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. Cette thèse est réalisée sous la direction de William Nasser au sein de l’équipe « Fonctions de virulence, le cas de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi » dirigée par Nicole Hugouvieux-Cotte-Pattat et appartenant à l’Unité de Microbiologie et Génétique composante INSA, UMR CNRS-INSA-UCB 5122 dirigée par Raymond Portalier. William Nasser, est directeur de recherche au CNRS. Après une thèse de doctorat à l’Université de Strasbourg I portant sur la caractérisation biochimique et fonctionnelle des protéines de défense du maïs, il s’est intéressé durant un stage post-doctoral à l’étude de pectinases (enzyme dégradant la paroi des cellules végétales) chez les bactéries Bacillus subtilis et Erwinia chrysanthemi. Depuis son recrutement par le CNRS en 1993, il s’intéresse à l’étude de la régulation de la synthèse des facteurs de virulence chez Erwinia chrysanthemi. Introduction Robert Koch établit en 1890 un postulat définissant les caractéristiques d’une bactérie pathogène. Elle doit pouvoir survivre dans l’hôte, s’y multiplier et y causer des dommages. Pour ce faire, elle doit être compétitive vis-à-vis des bactéries commensales, neutraliser les mécanismes de défense de l’hôte et y assurer sa propagation. Une partie de ces propriétés est conférée par les facteurs de virulence. Définir les gènes codant ces facteurs est un problème non encore totalement clarifié (figure 1) (Wassenaar and Gaastra, 2001). Dans cet article, le terme de gène de virulence sera utilisé pour les gènes codant des facteurs indispensables à la colonisation de l’hôte par le pathogène. Les pathogènes ont mis en place des systèmes de contrôles fins de la synthèse de leurs facteurs de virulence de manière à pouvoir infecter efficacement leur hôte. L’infection est un processus où le passage à l’étape suivante est globalement régi par la phase de croissance (figure 2). La première étape est l’adhésion du pathogène à l’hôte et débute durant la phase de latence, qui est un temps d’adaptation à ce nouvel environnement. 24 n° 1 - 2005 En conditions favorables, la croissance bactérienne devient exponentielle, conduisant au deuxième niveau de l’infection appelé phase de multiplication. Lorsqu’elles sont en quantité suffisamment importante pour arriver à conduire une attaque brusque et forte des cellules de l’hôte, les bactéries synthétisent massivement leurs facteurs de virulence tardifs permettant une invasion de l’hôte. Cette étape a lieu généralement lorsque le pathogène est en phase exponentielle avancée ou en phase stationnaire de croissance, durant laquelle la bactérie est plus résistante à un environnement défavorable. L’avancement dans le processus infectieux en fonction de la phase de croissance est régulé essentiellement par trois mécanismes. Le premier implique le facteur de transcription sigma S (σS) qui modifie le transcriptome lors de l’entrée en phase stationnaire de croissance. Parmi les gènes du régulon σS, se trouvent des gènes de virulence. Le deuxième mécanisme fait intervenir la perception de la densité cellulaire, appelée le « quorum sensing ». Il permet d’assujettir la synthèse des facteurs de virulence tardifs à une densité cellulaire élevée, ce qui est généralement rencontré durant les phases exponentielles avancées de croissance. Enfin, les bactéries REGARD sur la BIOCHIMIE possèdent des protéines nommées « histone-like » qui sont fixées au nucléoïde ; elles ont un rôle régulateur notamment dans l’expression de certains gènes de virulence en fonction des stimuli extérieurs et de la phase de croissance. L’objectif de cette mini-revue est de faire une présentation succincte des connaissances actuelles, chez les bactéries à Gram négatif, sur ces trois modes de contrôle de l’expression des gènes de virulence par la phase de croissance. Nous verrons que ces trois mécanismes fonctionnent de manière intégrée et tenterons d’en présenter les avantages pour le pathogène. I. Le facteur de transcription sigma S Les conditions de vie relativement stressantes de la phase stationnaire nécessitent une modification de la physiologie et de la morphologie de la bactérie. Ces changements sont effectués essentiellement par un facteur de transcription: le facteur σS. Comment l’action de ce facteur de transcription est-elle ciblée à la phase stationnaire et quels types de gènes contrôle t-il ? 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 25 différentes protéines, appelées « histonelike », pour former le nucléoïde ; certaines de ces protéines, notamment H-NS (histone-like nucleoid structuring) et Fis (factor for inversion stimulation), interviennent également dans la spécificité des facteurs sigma (Arnqvist et al., 1994 ; Hengge-Aronis, 1999). En fait, l’ARN polymérase ne reconnaît pas des séquences sur un ADN linéaire mais plutôt une structure nucléoprotéique complexe dans laquelle l’accessibilité à l’ADN est modulée par les protéines « histone-like ». La sélection des promoteurs par l’ARN polymérase σ70 ou l’ARN polymérase σS serait donc liée à la relative disponibilité des deux facteurs s et à l’action de certaines protéines « histone-like ». Cet exemple met en évidence l’existence d’une connexion entre les protéines « histone-like » et σS (voir partie III). I-2) La régulation du niveau cellulaire de σS Figure 1 : Classification des gènes impliqués dans la virulence (Wassenaar, 2001). Le nombre de gènes de virulence et de gènes associés à la virulence est représenté par des cercles concentriques. La limite entre les cercles n’est pas toujours bien établie. I-1) Le facteur sigma S La transcription est réalisée par l’ARN polymérase (ou holoenzyme) qui est constituée de l’enzyme core et d’un facteur de transcription σ. L’enzyme core porte l’activité catalytique alors que le facteur σ est responsable de la spécificité de reconnaissance des séquences promotrices sur les gènes à transcrire. Il existe différents facteurs σ qui permettent à l’ARN polymérase de reconnaître différents groupes de promoteurs. Le facteur de transcription majeur, σ70, permet la transcription des gènes de ménage et est présent constitutivement dans le microorganisme (Borukhov and Nudler, 2003). Par contre la synthèse du facteur σS est fortement stimulée lors de l’entrée en phase stationnaire de croissance et par divers stress environnementaux (HenggeAronis, 2000b). Cette protéine, codée par le gène rpoS, a un poids moléculaire d’environ 38 kDa. Les facteurs σS et σ70 peuvent reconnaître un même promoteur avec la même efficacité in vitro (Ding et al., 1995 ; Jishage et al., 1996). Pourtant ils contrôlent l’expression de gènes différents puisqu’une inactivation de rpoS réduit for- tement ou élimine l’expression des gènes cibles de σS. Comment est assurée la spécificité de σS pour ses séquences promotrices ? L’augmentation de la concentration cellulaire de σS dans les conditions où il est requis pourrait favoriser la fixation de ce facteur de transcription sur les promoteurs de ses gènes cibles au détriment de σ70. Par ailleurs, il faut noter que l’ADN génomique est associé in vivo à En plus de la phase de croissance, il a été observé que la concentration cellulaire de σS est régulée par différents stimuli tels que : une forte osmolarité, une température faible, un pH acide… (Figure 3). La régulation de la synthèse de σS s’avère donc très complexe. La transcription du gène rpoS se fait via un promoteur majeur de type σ70. Durant la phase exponentielle de croissance, chez E. coli, le gène rpoS est significativement transcrit et le niveau de transcription augmente d’un facteur trois lors de l’entrée en phase stationnaire (Takayanagi et al., 1994). Ce contrôle transcriptionnel implique essentiellement des métabolites s’accumulant en phase stationnaire (le guanosine-3’ 5’bispyrophosphate (ppGpp), l’adénosine mono- Figure 2 : Etapes du processus infectieux en fonction de la phase de croissance. REGARD sur la BIOCHIMIE n° 1 - 2005 25 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 26 stress plutôt qu’un régulateur spécifique de la phase stationnaire de croissance. La régulation du niveau cellulaire de σS est donc essentiellement régie par des contrôles post-transcriptionnels chez E. coli et transcriptionnels chez les Pseudomonas. Cette différence de contrôle pourrait être lié au fait que σS a un rôle relativement limité dans la réponse générale au stress chez Pseudomonas. Notons que le contrôle post-transcriptionnel permet d’ajuster plus rapidement la concentration cellulaire de σS. I-3) Le régulon du facteur σS Figure 3 : Régulation du niveau cellulaire de σs en fonction des stimuli extérieurs chez la bactérie Escherichia coli (Hengge-Aronis, 2000). Stimulus extérieur activateur Stimulus extérieur répresseur phosphate cyclique (AMPc) et le polyphosphate). Les mécanismes d’actions de ces métabolites demeurent non élucidés. Toutefois, la régulation transcriptionnelle influe peu sur la concentration cellulaire de σS chez E. coli ; c’est par contre le niveau de régulation principal dans le genre Pseudomonas où la transcription du gène rpoS est fortement activée en phase stationnaire de croissance (Fujita et al., 1994). Chez E. coli, la quasi absence du facteur σS durant la phase exponentielle de croissance, malgré l’existence d’une transcription effective du gène rpoS, laissait présager une régulation post-transcriptionnelle. L’utilisation de différentes approches expérimentales (fusions transcriptionnelles et traductionnelles rpoS::lacZ, quantification des transcrits de rpoS et de la protéine σS) a montré que la traduction des transcrits rpoS est activée par les divers stimuli qui modulent la concentration cellulaire de σS (Figure 3) (Lange and Hengge-Aronis, 1994). L’augmentation de l’efficacité de la traduction implique une interaction entre les ARNms rpoS et différentes protéines régulatrices d’ARNs (Hfq, RprA, DsrA, la protéine « histone-like » HU), rendant leurs séquences de Shine et Dalgarno plus accessibles aux ARNs ribosomaux. Les régulateurs DsrA et RprA seraient impliqués dans l’induction de la traduction de rpoS par le froid et le stress osmotique, respectivement (Majdalani et al., 2002 ; Repoila and Gottesman, 2001). En plus de ces systèmes d’activation, deux systèmes de répression impliquant la protéine « histone-like » H-NS et le régulateur OxyS 26 n° 1 - 2005 ont également été mis en évidence ; H-NS et OxyS antagonisent l’action de HU et Hfq, respectivement (Hengge-Aronis, 2000b). Le facteur σS est soumis à une forte protéolyse lors de la phase exponentielle de croissance. Cette dégradation requiert deux partenaires : la protéase ClpXP et le régulateur RssB (Muffler et al., 1996 ; Schweder et al., 1996). Un modèle du fonctionnement de la protéolyse a été proposé par Hengge-Aronis (HenggeAronis, 2000b) : sous sa forme phosphorylée, RssB se lie à σS, le complexe est reconnu par ClpXP et σS est dégradé. Les mécanismes de signalisation contrôlant la phosphorylation de RssB sont inconnus. Il apparaît donc que σS est un facteur de transcription de la réponse générale au Le fait que la synthèse de σS soit régulée par différents signaux de stress a soulevé la question d’une implication de ce facteur dans l’adaptation de la bactérie à son environnement. L’utilisation de différentes approches expérimentales a permis de définir le régulon σS. Il est composé d’une centaine de gènes dont certains confèrent une tolérance au stress, modifient la morphologie cellulaire et réorientent le métabolisme (tableau 1) (Loewen et al., 1998). Depuis peu, la régulation de gènes de virulence par σS a été mise en évidence. Dans cet article, nous nous limiterons aux gènes de résistances aux stress et aux gènes de virulence. I-3-1) Les gènes conférant une résistance au stress Un stress oxydatif, une augmentation forte de la température ou de l’osmolarité sont létaux pour un mutant rpoS d’E. coli. Ainsi les gènes katG et katE, codant deux catalases impliquées dans la résistance au stress oxydatif chez E. coli, sont sous la dépendance de Rôle Gènes ou opérons Fonction Physiologie générale ftsQ, ftsZ, ficA topA division cellulaire topoisomérase I Métabolisme galEKT lacZ glgAS catabolisme du galactose catabolisme du lactose anabolisme du glycogène Réponse générale au stress katG, katE otsBA aidB catalases tréhalase méthylation de l’ADN Virulence esp csgAbCDEF adhésion fimbrae curli Tableau 1 : Exemple de gènes ou d’opérons contrôlés positivement par le facteur σs chez Escherichia coli (Loewen et al., 1998). REGARD sur la BIOCHIMIE 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 σS (Loewen et al., 1998). Par ailleurs, σS active la transcription de l’opéron otsBA dont les produits synthétisent du tréhalose. Cet osmoprotectant assure le maintien de la pression osmotique intracellulaire à un niveau adéquat (Kaasen et al., 1992). De même, les mutants rpoS des bactéries Pseudomonas aeruginosa (pathogène opportuniste de l’homme), et Erwinia carotovora (phytopathogène) sont plus sensibles aux stress oxydatif et osmotique que les souches parentales correspondantes (Suh et al., 1999). Il apparaît donc clairement que σS joue un rôle déterminant dans l’adaptation de la bactérie à différentes conditions de stress. I-3-2) Les gènes de virulence L’environnement rencontré par la bactérie dans l’hôte est en général très hostile. Ainsi chez l’animal, les bactéries pénétrant par la voie intestinale doivent traverser l’estomac, où le pH est voisin de 2. La mise en place de la réponse générale au stress permet à la bactérie de s’adapter aux conditions rencontrées dans l’hôte. Par la suite, la bactérie va induire la synthèse des facteurs de virulence précoces qui vont lui permettre de s’établir; la synthèse de certains de ces facteurs est sous le contrôle de σS. Les facteurs de virulence exprimés au début de l’infection sont généralement les systèmes d’adhésion de la bactérie à son hôte. Ainsi chez les souches pathogènes entérohémorrhagiques (EHEC) d’E. coli, le mécanisme d’adhésion aux cellules de l’épithélium intestinal nécessite un système de sécrétion de type III, codé par les gènes du locus LEE dont l’expression est activée par σS (Beltrametti et al., 1999). L’implication de σS dans le contrôle de la virulence est encore plus marquée chez des bactéries comme Salmonella thyphimurium. En effet, des mutants rpoS de cette bactérie sont totalement avirulents sur des modèles murins (Hengge-Aronis, 2000a). Ce phénotype résulterait de l’absence de la mise en place de la réponse générale au stress ainsi que d’une régulation inappropriée des gènes de virulence. Le processus infectieux se poursuit par l’expression des facteurs de virulence tardifs qui vont généralement permettre la propagation du pathogène. σS est également impliqué dans la régulation de la synthèse de certains facteurs tardifs. Ainsi, un mutant rpoS de P. aeru- Page 27 ginosa produit moins d’exotoxine A, facteur de virulence majeur (Suh et al., 1999). σS est également impliqué dans la régulation de la virulence chez des bactéries phytopathogènes comme Erwinia carotovora. Chez cette bactérie, σS contrôle négativement la synthèse d’enzymes extracellulaires, responsables de la dégradation de la paroi des cellules végétales et considérées comme un facteur de virulence essentiel (Andersson et al., 1999). Un mutant rpoS d’E. carotovora a une capacité macératrice augmentée in planta par rapport à celle de la souche parentale mais est incapable de croître à de fortes densités et d’entrer en compétition avec la souche parentale aussi bien in vitro qu’in planta. Ce défaut de croissance in vivo du mutant rpoS serait lié à une plus grande sensibilité aux stress oxydatif et osmotique. Cet exemple suggère qu’un gène rpoS fonctionnel est requis pour la survie de la bactérie dans un environnement compétitif et dans des conditions stressantes. Ceci met en évidence l’importance du couplage du contrôle de la réponse au stress et de l’expression des gènes de virulence. Enfin, le facteur σS contrôle également d’autres systèmes de régulation des facteurs de virulence comme le régulateur SpvR, activateur spécifique d’un système d’adhésion de Salmonella typhimurium, ou les régulateurs du « quorum sensing » chez P. aeruginosa (voir partie II). II. Le « quorum sensing » II-1) La communication entre bactéries Une communication entre bactéries a été mise en évidence pour la première fois chez Vibrio fischeri, bactérie symbiote entre autre du poisson Eurprymna scolopes. Ce microorganisme peut vivre soit sous forme planctonique, c’est-à-dire libre dans les océans, soit dans un environnement confiné lors de l’association symbiotique avec E. scolopes. V. fischeri a la propriété de synthétiser un composé luminescent dans des conditions de forte densité cellulaire, rencontrées naturellement lorsque la bactérie est engagée dans une association symbiotique. L’expression des gènes responsables de la bioluminescence est donc liée à la densité cellulaire chez V. fischeri. Le phénomène est nommé «quorum sensing»; il permet de coupler le contrôle d’un mécanisme avec la densité cellulaire bactérienne en vue d’une action concertée (Fuqua et al., 1994). Ainsi, la bioluminescence n’est activée que si le nombre de bactéries dépasse un seuil. Cette production de lumière est déterminante pour le maintien de la relation symbiotique (Lupp et al., 2003). En effet, elle permet au symbiote d’être lumineux de nuit ce qui compense l’ombre créée par la lune. A la surface, il devient indétectable par ses prédateurs situés en profondeur. En contrepartie, les bactéries trouvent un environnement propice à leur développement. Le principe du « quorum sensing » repose sur la production d’une molécule signal ou autoinducteur diffusible dans le milieu extérieur (figure 4) (Kaplan and Greenberg, 1985). Chez V. fischeri, comme chez de nombreuses bactéries à Gram négatif, la molécule signal appartient à la famille des N-acyl homosérine lactone (HSL) (Eberhard et al., 1981). Chez V. fischeri, l’HSL est synthétisée par le produit du gène luxI (Engebrecht and Silverman, 1984). En raison du caractère diffusible de l’HSL, les concentrations intra et extra cellulaires sont équivalentes. De ce fait, la concentration d’HSL augmente proportionnellement à la densité cellulaire. Lorsque la concentration d’HSL atteint une valeur seuil, ces HSLs interagissent avec le régulateur de transcription LuxR qui va activer l’expression des gènes responsables de la bioluminescence. II-2) Implication du « quorum sensing » dans la régulation des gènes de virulence Des systèmes de « quorum sensing » utilisant des mécanismes proches du couple LuxI/LuxR ont été mis en évidence chez de nombreuses bactéries à Gram négatif pathogènes parmi lesquelles P. aeruginosa, E. carotovora ou E. coli. Ces bactéries utilisent le « quorum sensing » pour la régulation de la virulence. Ainsi, les facteurs de virulence sont produits massivement lorsque la densité bactérienne est suffisamment forte pour conduire une attaque efficace. Selon les espèces bactériennes, les HSLs diffèrent (tableau 2) (Miller and Bassler, 2001) ; ceci permet une communication intraspécifique tout en n’excluant pas certaines communications interspécifiques. Le cas de la bactérie pathogène opportuniste pour l’homme, P. aeruginosa, a été particulièrement étudié. Ce microorganisme possède trois systèmes REGARD sur la BIOCHIMIE n° 1 - 2005 27 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 28 Figure 4 : Mode d’action de la régulation de l’expression de gènes par le « quorum sensing ». Les gènes de l’opéron luxCDABEG codent la machinerie nécessaire pour la production de la bioluminescence. L’expression de ces gènes est contrôlée par le système de « quorum sensing » LuxR/LuxI. Acylhomoserine lactone N-butanoyl-homoserine lactone (C4-HSL) de « quorum sensing » dont deux, LasI/LasR et RhlI/RhlR, ont été bien caractérisés (Rumbaugh et al., 1999). LasI et RhlI sont des HSL-synthases qui catalysent respectivement la production de 3-oxo-C10-HSL et C4-HSL (tableau 2). Les deux systèmes de « quorum sensing » agissent en tandem pour contrôler séquentiellement la production des facteurs de virulence. A forte densité cellulaire, le complexe LasR-(3-oxo-C10HSL) va activer l’expression des gènes codant les facteurs extracellulaires nécessaires pour initier la destruction des tissus de l’hôte infecté : l’élastase LasB, la protéase LasA, l’exotoxine A et la phosphatase alcaline AprA. Le complexe LasR-(3-oxo-C10-HSL) active également l’expression du second système de « quorum sensing » RhlI/RhlR. Le complexe RhlR-(C4-HSL) active alors la transcription des gènes codant les facteurs requis pour l’invasion de l’hôte : la cytotoxine Organismes Homologues de LuxI/LuxR Phénotypes régulés Pseudomonas aeruginosa RhlI/RhlR Aeromonas hydrophila AhyI/AhyR toxine (lecA), exoprotéases, élastase (lasB), synthèse des rhamnolipides Protéase à sérine et métalloprotéase Vibrio fischeri LuxI/LuxR Bioluminescence Erwinia chrysanthemi ExpI/ExpR Pectinases Erwinia carotovora a) ExpI/ExpR Exoenzymes b) ExpI/CarR Carbapénème CerI/CerR Facteur d’agglutination N-(3-oxohexanoyl)-homoserine lactone Rhodobacter sphaeroides N-(3-hydroxy-7-cis-tetradecenoyl)homoserine lactone N-(3-oxododécanoyl)homoserine lactone (3-oxo-C10-HSL) Pseudomonas aeruginosa LasI/LasR élastase (lasB), protéase (lasA), exotoxine A, phosphatase alcaline AprA Tableau 2 : Exemple de la diversité des autoinducteurs de type acylhomosérine lactones et des phénotypes régulés par les systèmes de « quorum sensing » de type LuxI/LuxR (Miller and Bassler, 2001). 28 n° 1 - 2005 REGARD sur la BIOCHIMIE 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 29 sensing » sont soumis à une régulation complexe. Nous nous limiterons à la description de la régulation des acteurs du « quorum sensing » chez P. aeruginosa qui est l’un des systèmes le mieux caractérisé. Figure 5 : Réseau de régulation des trois systèmes de « quorum sensing » chez Pseudomonas aeruginosa (Diggle et al., 2003). : Activation : Répression Lors de l’entrée en phase stationnaire de croissance, les systèmes LasRI et PQS activent la synthèse de RhlR. De plus, LasR induit sa propre synthèse ainsi que la production de l’autoinducteur PQS. Ces trois systèmes sont responsables de l’activation de la transcription de plusieurs gènes de virulence. Par un contrôle transcriptionnel, le régulateur Vfr active la synthèse du système LasRI alors que GacA active simultanément LasRI et RhlRI. Il est intéressant de noter que RsmA, dont la synthèse est activée par σs durant la phase stationnaire, permet d’éviter une amplification exacerbée de la réponse du « quorum sensing ». LecA et un système d’acquisition du fer. La connexion entre les deux systèmes de « quorum sensing » permet d’établir une chronologie dans la synthèse des facteurs de virulence requis aux différents stades de l’infection (Nicas and Iglewski, 1985 ; Whooley et al., 1983). Des tests d’infection murine ont montré que l’inactivation de l’un ou l’autre de ces deux systèmes de « quorum sensing » entraîne une diminution de la virulence de P. aeruginosa (Smith et al., 2002). Toutefois, les mutants ne sont pas totalement avirulents, ce qui indique que la régulation de la virulence implique d’autres mécanismes. Par ailleurs, la 3-oxo-C10-HSL pourrait désorganiser la réponse immunitaire de l’hôte, facilitant ainsi l’infection. Récemment un troisième autoinducteur, le 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone (PQS), a été mis en évidence (Pesci et al., 1999). La synthèse de cet autoinducteur est dirigée par l’opéron PQS, constitué de 8 gènes dont l’expression serait modulée par le régulateur PqsR (McGrath et al., 2004). Ce système active la production d’élastase en fin de phase stationnaire par un mécanisme non totalement élucidé, le régulateur transcriptionnel médiant l’action de PQS n’étant pas encore identifié. Les trois systèmes Las, Rhl et PQS sont donc des régulateurs de la virulence organisés sous forme d’un réseau (figure 5) dont la modélisation mathématique est en cours (Viretta and Fussenegger, 2004). Dans certains cas, le « quorum sensing » peut induire la synthèse de facteurs de virulence précoces. Par exemple, chez les souches O157H7 EHEC d’E. coli, un autoinducteur, d’un type nouveau (furanosyl borate diester), produit par la synthase LuxS, contrôle l’expression des gènes esp dont les produits sont impliqués dans l’adhésion. En effet, l’expression de fusions transcriptionnelles entre les gènes esp et le gène rapporteur lacZ est régulée par cet autoinducteur (Sperandio et al., 1999). Cependant, l’expression de ces fusions est induite même lorsque la densité cellulaire de la souche O157H7 est faible. Ce phénomène pourrait être dû au fait que les souches pathogènes pourraient utiliser l’autoinducteur des souches commensales d’E. coli pour induire les gènes esp. Ainsi, la machinerie permettant l’adhésion des bactéries à l’hôte serait mise en place même à faible densité cellulaire de la souche pathogène. II-3) La régulation du « quorum sensing » Des études relativement récentes ont montré que les systèmes de « quorum Les trois systèmes, Las, Rhl et PQS forment un réseau hiérarchisé (figure 5) (Diggle et al., 2003). LasR active l’expression de RhlR et la synthèse de l’autoinducteur PQS. De même, ce dernier active la production de RhlR. Les trois systèmes sont par ailleurs soumis à de multiples contrôles transcriptionnels (GacA, Vfr, σS) (Medina et al., 2003; Reimmann et al., 1997) et post-transcriptionnels (RsmA) (Pessi et al., 2001) (figure 5). Il est intéressant de noter le lien existant entre le facteur σS et les trois systèmes de « quorum sensing ». Ainsi il est envisageable que l’induction de la synthèse du répresseur RsmA par σS, après l’enclenchement des systèmes du « quorum sensing », permettrait d’éviter une amplification continuelle de ce système de contrôle. III. Les protéines « histone-like » Les bactéries possèdent des protéines fonctionnellement similaires aux histones des eucaryotes. Cette similarité n’est pas basée sur la séquence en acides aminés. Elle est due à leur capacité à se lier à l’ADN, leur forte concentration cellulaire, leur faible poids moléculaire et leur charge électrostatique. De plus, ces protéines bactériennes semblent contribuer à l’organisation du nucléoïde, comme le font les histones pour la chromatine. Ces protéines, nommées « histone-like », sont également impliquées dans des mécanismes plus spécifiques tels que la recombinaison spécifique de site de phages, la réplication de l’ADN, et aussi la régulation de l’expression de certains gènes. Les protéines « histonelike » les mieux caractérisées sont Fis, H-NS et IHF. Mis à part H-NS, la concentration cellulaire de ces protéines varie au cours de la phase de croissance (figure 6). Ainsi Fis est fortement produite en début de phase exponentielle et sa concentration cellulaire diminue rapidement au fur et à mesure de la croissance bactérienne. IHF, au contraire, devient plus abondante lors de l’entrée en phase stationnaire de croissance (Ali Azam et al., 1999). REGARD sur la BIOCHIMIE n° 1 - 2005 29 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 Page 30 Figure 6 : Concentrations cellulaires des protéines « histone like » H-NS, Fis et IHF au cours des différentes phases de la croissance bactérienne. III-1) H-NS Le rôle de H-NS a été abondamment décrit chez E. coli et les bactéries voisines comme Shigella flexneri ou Salmonella typhimurium. L’analyse du transcriptome, en utilisant des puces à ADN, a montré que H-NS est impliqué dans l’expression de plus de 5% des gènes chez E. coli. H-NS est donc un régulateur global qui contrôle entre autres la régulation de l’expression de gènes de virulence (Hommais et al., 2001). H-NS agit essentiellement comme répresseur et son mécanisme d’action a été récemment caractérisé (Dame et al., 2002). H-NS ne se fixe pas à l’ADN via une séquence consensus mais par le biais de régions d’ADN présentant une structure courbe localisée en amont des promoteurs à réprimer. La liaison de plusieurs protéines H-NS conduit à la formation d’une boucle dans laquelle est piégée l’ARN polymérase. En général, H-NS régule indirectement l’expression des gènes de virulence. Par exemple chez les souches EIEC d’E. coli, l’expression des gènes permettant l’adhésion, la pénétration et la dissémination intra et inter cellulaire est activée par deux régulateurs transcriptionnels : VirF et VirB (Adler et al., 1989). En réponse à différents stimuli (température, pression osmotique, pH) il y a une augmentation de la synthèse de VirF qui va activer l’expression de VirB, régulateur spécifique des gènes codant les protéines IPA nécessaires à l’invasion de la barrière intestinale (Sasakawa et al., 1993). A température inférieure à 32°C, H-NS réprime l’expression de virF en se liant spécifiquement à une région présen- 30 n° 1 - 2005 tant une structure courbée et localisée dans la région promotrice de ce gène (figure 7) (Falconi et al., 1998). A des températures voisines de celle de l’hôte (37°C), une modification topologique de cette région s’oppose à la fixation de HNS, permettant une dérépression de l’expression de virF qui va conduire à une forte production des protéines IPA et de l’appareil de sécrétion. La courbure de l’ADN, permettant la fixation de H-NS, pourrait agir comme un senseur de la température et disparaîtrait à plus de 32°C. Cet exemple met en évidence la connexion entre la levée de la répression exercée par H-NS et les conditions environnementales. Un mécanisme similaire serait mis en œuvre en réponse à un stress osmotique ou thermique. En effet, ces différents stress modifient la topologie* de l’ADN (Dorman and Deighan, 2003). Dans certains cas, H-NS peut avoir un rôle activateur de la synthèse des gènes de virulence. Par exemple, chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, l’expression des gènes pel, codant des enzymes extracellulaires, facteurs de virulence majeurs, est fortement diminuée dans un mutant hns. Ce phénotype d’activateur est le résultat d’un contrôle indirect mettant en jeu un répresseur des gènes pel : PecT (Nasser and Reverchon, 2002). Dans le mutant hns, l’augmentation de la synthèse de PecT conduit à une répression de l’expression des gènes pel. Le signal auquel répond PecT n’est pas encore identifié. Par ailleurs, H-NS est impliqué dans la régulation par la phase de croissance via le contrôle qu’il exerce sur la synthèse de σS (paragraphe I-2-1). III-2) Fis Un des rôles essentiels de Fis est d’activer la transcription de gènes codant les ARN stables (ARN de transfert et ribosomaux) en début de phase exponentielle de croissance. Fis est également impliqué dans divers processus biologiques tel que l’intégration dans le chromosome du phage Mu. Fis se lie à l’ADN via un consensus assez dégénéré et peut jouer soit un rôle d’activateur soit de répresseur. La répression par Fis s’effectue via une compétition avec l’ARN polymérase ou des activateurs pour l’occupation d’une même région d’ADN. Dans le cas d’une activation, la fixation de Fis à l’ADN induit une modification locale de la topologie de l’ADN, facilitant la fixation de l’ARN polymérase sur les promoteurs (Muskhelishvili and Travers, 2003). Ainsi, Fis active le gène virF Figure 7 : Mode d’action du répresseur H-NS et de l’activateur Fis en fonction de la température sur l’expression du gène virF chez les souches d’Escherichia coli entéroinvasives. REGARD sur la BIOCHIMIE 24-33-REGARD BIO 1-2005 Phase de latence 17/03/05 11:45 Phase exponentielle Page 31 Phase stationnaire Figure 8 : Régulation des gènes de virulence en fonction de la croissance par le facteur σs, le « quorum sensing » et les protéines « histone-like » H-NS, Fis et IHF. L’existence d’interactions entre les protéines « histone-like » leur permet d’intervenir dans le contrôle de la virulence tout au long de la croissance. d’E. coli une fois la répression par H-NS levée (figure 7) (Falconi et al., 2001). Fis permet donc l’expression des gènes d’adhésion et de colonisation de la bactérie. De même, Fis active l’expression des gènes de l’îlot de pathogénie SPI-1 chez S. typhimurium. Les produits de ces gènes permettent le franchissement de la barrière intestinale de l’hôte (Wilson et al., 2001). Récemment, l’analyse du transcriptome de S. typhimurium a montré un rôle central de Fis dans la coordination de l’expression des gènes de ménage et des gènes de virulence nécessaire à la survie de la bactérie dans les poumons ou au cours d’une infection systémique (Kelly et al., 2004). L’adhésion aux cellules épithéliales des souches enteropathogéniques d’E. coli est médiée par les bundle-forming pili (BFP). Ce processus est activé par Fis (Goldberg et al., 2001). Ainsi, Fis active la synthèse des facteurs de virulence précoces (adhésion). Il existerait donc une bonne adéquation entre la forte concentration cellulaire de Fis en début de phase exponentielle de croissance et la fonction des gènes de virulence dont il active l’expression. Fis contrôle par ailleurs l’expression de H-NS (Falconi et al., 1996). III-3) IHF Contrairement à H-NS et Fis, IHF reconnaît un consensus bien défini pour sa fixation à l’ADN (Ali et al., 2001). Chez S. flexneri, cette protéine permet de maintenir l’expression du gène virB pendant la phase stationnaire de croissance lorsque la quantité de protéines Fis est minimale (Porter and Dorman, 1997). Ainsi le processus infectieux est maintenu au cours du développement bactérien. Dans la bactérie pathogène S. typhimurirum, le facteur σS et le régulateur SpvR activent conjointement l’expression des gènes de virulence spv à l’entrée de la phase stationnaire. L’expression de spvR est également activée par IHF à forte densité cellulaire (Marshall et al., 1999). Afin d’exprimer les gènes spv au moment opportun, la bactérie possède un double contrôle dans l’expression de ces gènes impliquant σS et IHF qui sont présents durant la phase stationnaire. IHF active par ailleurs l’expression de Fis en début de phase exponentielle de croissance (Pratt et al., 1997). Conclusion Pour développer une infection efficace, le pathogène doit coordonner l’expression de ses gènes de virulence de manière à échapper aux réactions de défense de l’hôte. La régulation par la phase de croissance joue un rôle prépondérant dans la coordination de la synthèse des facteurs de virulence. Chez les bactéries à Gram négatif, elle s’exerce essentiellement par le biais de trois mécanismes : le facteur σS, le « quorum sensing » et certaines protéines « histone-like ». Ces trois systèmes semblent fonctionner de manière hiérarchisée (figure 8). En raison de leur rôle architectural dans le nucléoïde et de leur fonction de régulateurs globaux, les protéines « histone-like » pourraient établir un lien fort entre le réseau de régulation global de la cellule et les systèmes de régulation des gènes de virulence. En dessous des protéines « histone-like », le facteur σS établit une connexion entre le système de réponse générale aux stress et les mécanismes de « quorum sensing ». Ce mode de fonctionnement intégré pourrait permettre à la bactérie d’adapter rapidement et finement l’expression de ses gènes de virulence en fonction des conditions environnementales. Il est toutefois regrettable que des études approfondies sur les trois systèmes de régulation par la phase de croissance n’aient pas été réalisées sur un même organisme : σS et les protéines « histone-like » ont été étudiés chez des souches d’E. coli alors que le « quorum sensing » est mieux caractérisé chez P. aeruginosa. La compréhension de la régulation des gènes de virulence par la phase de croissance devrait permettre à terme l’identification de nouvelles cibles pour la conception d’agents antimicrobiens. De nombreux travaux sont actuellement entrepris pour tenter d’identifier des composés susceptibles de perturber de manière efficace les systèmes de « quorum sensing ». Cependant, la diversité des autoinducteurs complique considérablement cette démarche (Hentzer and Givskov, 2003). La recherche de nouvelles cibles pour le contrôle de la virulence paraît donc nécessaire. Résumé L’un des moyens couramment utilisé par les pathogènes pour échapper aux réactions de défense de l’hôte est de n’induire une synthèse massive de leurs facteurs de virulence susceptibles d’éveiller les réactions de défense de l’hôte que lorsqu’ils sont en quantité suffisamment importante pour conduire une attaque brusque et forte de l’hôte. Ce type de contrôle communément appelé régulation par la phase de croissance s’exerce sur les gènes de virulence chez les bactéries Gram négatif essentiellement via trois mécanismes : – Lors de conditions environnementales défavorables, le transcriptome est modifié par un facteur global de transcription : le facteur Sigma S. Il met en place la réponse générale au stress et contrôle également des gènes de virulence. Sigma S permet de coupler le déclenchement de la virulence avec la réponse générale au stress. – La plupart des bactéries à Gram négatif synthétisent un type de molécule diffusible, appelé autoinducteur dont la concentration est le reflet de la densité cellulaire ; la perception de la densité cellulaire via les autoinducteurs est REGARD sur la BIOCHIMIE n° 1 - 2005 31 24-33-REGARD BIO 1-2005 17/03/05 11:45 appelée « quorum sensing ». Ce système initie une réponse concertée de la population bactérienne. Le « quorum sensing » permet d’assujettir la synthèse des facteurs de virulence à la densité cellulaire. – Enfin, les bactéries possèdent des protéines « histone-like » impliquées dans la structuration de l’ADN génomique. La plupart de ces protéines ont une fonction de régulateur en plus de leur rôle architectural dans le nucléoïde. L’expression de certains gènes de virulence est également modulée par les protéines « histone-like ». Par ailleurs, il existe des connexions entre les trois systèmes de régulation de la virulence par la phase de croissance. Ce mode d’organisation intégrée permet au pathogène d’assurer une synthèse des facteurs de virulence appropriée aux différentes phases du processus infectieux. Page 32 Descriptif des activités du laboratoire Les travaux de l’Unité de Microbiologie et Génétique, dirigée par le professeur Raymond Portalier, portent d’une manière générale sur les stratégies adaptatives mises en œuvre par les microorganismes en réponse aux variations de l’environnement. Le groupe « Erwinia », auquel sont rattachés les auteurs, s’intéresse plus particulièrement à la caractérisation génétique et biochimique des facteurs de virulence de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, ainsi qu’à la régulation de la synthèse de ces facteurs. Ce groupe est dirigé par le docteur Nicole Hugouvieux-Cotte-Pattat. Coordonnées du laboratoire Domaine scientifique de la Doua Bâtiment A. Lwoff 10 rue R. Dubois 69622 Villeurbanne cedex tel : 04.72.43.15.53 fax : 04.72.43.15.84 e-mails : [email protected], [email protected] Liste des abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique EHEC : Escherichia coli entérohémorragique EIEC : Escherichia coli entéroinvasive Fis : Factor for inversion stimulation H-NS : Histone-like nucleoid structuring HSL : Homosérine lactone IHF : Integration host factor IPA : Invasion plasmid antigens LEE : Locus of enterocyte effacement Unité de Microbiologie et Génétique composante INSA, UMR CNRS-INSAUCBL 5122 Références bibliographiques Adler, B., Sasakawa, C., Tobe, T., Makino, S., Komatsu, K., and Yoshikawa, M. (1989) A dual transcriptional activation system for the 230 kb plasmid genes coding for virulence-associated antigens of Shigella flexneri. Mol Microbiol 3: 627-635. Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., and Ishihama, A. (1999) Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. 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