Peste équine

Manuel terrestre de l’OIE 2008 901
SECTION 2.5.
EQUIDAE
CHAPITRE 2.5.1.
PESTE ÉQUINE
RÉSUMÉ
La peste équine (PE) est une maladie virale infectieuse mais non contagieuse, frappant toutes les
espèces d’équidés, due à un orbivirus de la famille des Reoviridae et caractérisée par une atteinte
des fonctions respiratoire et circulatoire. La PE est transmise par au moins deux espèces de
Culicoides. Neuf sérotypes différents ont été décrits.
Tous les sérotypes de virus de la PE se rencontrent en Afrique de l’Est et du Sud. Seuls les
sérotypes 9 et 4 ont été trouvés en Afrique de l’Ouest d’où ils gagnent parfois les pays
circumméditerranéens. Les exemples d’épizooties survenues hors d’Afrique sont : Le
Moyen-Orient (1959-1963), l’Espagne (sérotype 9, 1966, sérotype 4, 1987-1990), et le Portugal
(sérotype 4, 1989).
Le diagnostic de laboratoire de la PE est fondamental. Bien que les signes cliniques et les lésions
soient très évocateurs, ils peuvent être confondus avec ceux d’autres maladies équines.
En tant que maladie virale, le diagnostic de laboratoire peut reposer sur l’identification du virus
infectieux, de son acide nucléique, des antigènes viraux ou des anticorps spécifiques. Durant ces
dernières années, une grande variété d’épreuves de laboratoire a été adaptée à la détection à la
fois du virus (AHSV, African Horse Sickness Virus) et de ses anticorps spécifiques.
Identification de l’agent pathogène : il est important d’effectuer l’isolement et le sérotypage du
virus chaque fois que des foyers apparaissent hors des régions d’enzootie.
Le virus équipestique peut être isolé du sang prélevé durant la phase fébrile initiale. Pour isoler le
virus, les autres tissus de choix sont représentés par la rate, le poumon et les nœuds lymphatiques,
prélevés lors de l’autopsie. Les préparations peuvent être inoculées en cultures de cellules, telles
que celles de rein de jeune hamster (BHK-21), de singe (MS) ou de rein de singe vert africain
(Vero), et par voie intra-cérébrale au souriceau nouveau-né. Différentes méthodes
immuno-enzymatique (ELISA) ont été mises au point pour la détection rapide d’antigènes viraux
dans la rate et le surnageant de cultures de cellules infectées. L’identification de l’ARN viral a aussi
été réalisée à l’aide de la technique de transcription inverse couplée à une réaction d’amplification
en chaîne par polymérase (RT-PCR). Les virus isolés peuvent être sérotypés par une réaction
sérologique spécifique telle qu’une séroneutralisation virale (SN), par une transcription inverse
couplée à une réaction d'amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) et par séquençage.
Épreuves sérologiques : les chevaux qui survivent à une infection naturelle développent des
anticorps vis-à-vis du sérotype viral infectant, en 8 à 12 jours après l’infection. Ceci peut être
démontré par plusieurs méthodes sérologiques telles que la réaction de fixation du complément,
l’ELISA, l’immuno-empreinte et la SN. Cette dernière est utilisée pour le sérotypage. D’autres
épreuves ont été décrites et proposées comme l’immunodiffusion en gélose et l’inhibition de
l’hémagglutination.

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Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
des vaccins vivants atténués (monovalents et polyvalents) destinés au cheval, mulet et âne, sont à
l’heure actuelle disponibles dans le commerce. Un vaccin inactivé monovalent a été commercialisé
mais n’est plus disponible. De nouveaux vaccins, y compris un vaccin sous-unités, ont été évalués
expérimentalement.
A. INTRODUCTION
La peste équine (PE) (Peste equina africana, African horse sickness [AHS]) est une maladie des équidés non
contagieuse, transmise par des arthropodes, due à un orbivirus (ARN double brin) de la famille des Reoviridae.
Le genre Orbivirus comprend aussi le virus de la fièvre catarrhale ovine et celui de la maladie hémorragique
épizootique qui ont des aspects morphologiques et des propriétés biochimiques voisines alors qu’ils diffèrent par
leurs caractéristiques pathogènes et antigéniques ainsi que par les espèces affectées. La particule virale d’une
taille d’environ 70 nm n’est pas enveloppée. Le génome du virus de la peste équine (AHSV, African Horse
Sickness Virus) est formé de 10 segments double brin d’ARN, qui codent 7 protéines structurales (VP 1-7), la
plupart de celles-ci ayant été séquencées pour les sérotypes viraux 4, 6 et 9 (29, 36, 39), et 4 protéines non
structurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (11, 19). Les protéines VP2 et VP5 forme la partie externe de la capside du
virion, et les protéines VP3 et VP7 constituent les constituants majeurs de la couche interne de la capside. Les
protéines VP1, VP4 et VP6 sont les constituants mineurs de cette couche interne. Les protéines NS3 sont les
secondes protéines virales les plus variables (35) ; les plus variables étant la protéine majeure VP2 de la surface
de la capside. Cette protéine VP2 est aussi responsable des sérotypes viraux et, avec VP5, de l’activité de
neutralisation du virus (26). Neuf sérotypes distincts de virus de la PE ont été identifiés par neutralisation virale,
mais quelques réactions croisées ont été constatées entre les sérotypes 1 et 2, 3 et 7, 5 et 8, ainsi que 6 et 9,
mais aucune réaction croisée avec d’autres orbivirus connus n’a été observée.
La PE demeure enzootique en Afrique sub-saharienne, bien que des poussées occasionnelles aient été
enregistrées en Afrique du Nord (1965, 1989-1990), au Moyen Orient (1959-1961), et en Europe (Espagne, 1966,
1987-1990 et Portugal, 1989).
La maladie présente, à la fois une incidence saisonnière (fin de l’été, automne) et cyclique avec des pics
épizootiques en Afrique du Sud durant les accès de chaleur (1). La mortalité apparaît en rapport avec les
espèces d’équidés affectés et la souche ou le sérotype de virus en cause. Au moins deux vecteurs sont impliqués
sur le terrain : Culicoides imicola et C. bolitinos. Parmi les équidés, le cheval est le plus sensible au virus de la
PE, avec un taux de mortalité de 50 à 90 %, suivi par le mulet, avec un taux de mortalité voisin de 50 %. Dans les
régions d’enzootie africaines ; l’âne est très résistant et ne fait que des infections sub-cliniques. Cependant, en
Europe et dans les pays asiatiques, l’âne se révèle moyennement sensible et la mortalité peut atteindre 10 %.
Les zèbres sont aussi très résistants, n’extériorisent aucun signe clinique excepté de la fièvre, mais ils peuvent
présenter une virémie prolongée (jusqu’à 40 jours) (4).
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
Bien que certains signes cliniques et certaines lésions soient très évocateurs, comme par exemple l’œdème de la
fosse temporale souvent présent chez les chevaux atteints de forme subaiguë, ces signes cliniques associés à
des commémoratifs historiques et des informations épidémiologiques peuvent être suffisant pour tenter le
diagnostic. Cependant, d’autres signes et lésions sont moins spécifiques de la PE, et d’autres maladies telles que
l’encéphalose équine, l’anémie infectieuse, la pneumonie à morbilivirus, l’artérite virale équine, la babésiose et le
purpura hémorragique, peuvent être confondues avec une forme ou l’autre de la PE et doivent être écartées.
C’est pourquoi le diagnostic de laboratoire est essentiel pour confirmer le diagnostic clinique.
1. Les formes cliniques de la PE
Il existe 4 formes cliniques classiques de PE : pulmonaire, cardiaque, cardio-pulmonaire ou mixte, et fébrile pure
(7).
La forme suraiguë ou pulmonaire, qui a une incubation courte (3 à 5 jours), est caractérisée par une dyspnée
sévère et une atteinte respiratoire progressive. Une poussée aiguë fébrile, durant 1 à 2 jours et pouvant atteindre
40 à 41 °C, peut être le seul signe. Le plus souvent elle est suivie par divers degrés de détresse respiratoire – la
fréquence respiratoire peut augmenter à 60 ou même 75 respirations/min. Le sujet se tient immobile, les
antérieurs écartés, la tête tendue sur l’encolure, les naseaux dilatés. Un jetage abondant est fréquent et une toux
spasmodique peut être notée en phase terminale avec un jetage mousseux obstruant les naseaux. La mort
survient en général quelques heures après le début des manifestations cliniques, l’animal se noyant littéralement

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dans son propre fluide séreux. La forme pulmonaire est habituellement observée chez les animaux très sensibles,
infectés par une souche hautement virulente, ou sur des animaux qui ont été soumis à un effort physique durant
la phase fébrile. La guérison de cette forme est exceptionnelle, survenant dans moins de 5 % des cas. Cette
forme est aussi celle qui est observée en général chez les chiens.
L’incubation de la forme subaiguë, œdémateuse ou cardiaque, varie de 7 à 14 jours, et l’apparition des signes
cliniques est marquée par une réaction fébrile (39 à 41 °C) qui dure 3 à 6 jours. Peu après le déclin de la fièvre,
des tuméfactions œdémateuses peuvent apparaître. Elles débutent dans la fosse temporale ou supra-orbitaire et
sur les paupières, puis, plus tard atteignent les lèvres, les joues, la langue, l’espace inter-mandibulaire et la
région laryngée. Les œdèmes sous-cutanés peuvent s’étendre à distance du cou vers la poitrine et, dans les cas
sévères, peuvent envahir la cage thoracique et les épaules, mais en général pas les membres postérieurs. En
phase terminale, des pétéchies peuvent être constatées dans la conjonctive et sous la face ventrale de la langue.
Finalement, l’animal devient agité et peut montrer des signes de coliques avant de mourir d’un arrêt cardiaque.
Une difficulté de déglutition en rapport avec une paralysie de l’œsophage est aussi rencontrée. Le taux de
mortalité est d’environ 50 % et la mort survient généralement en 4 à 8 jours après l’apparition de la réaction
fébrile. Lors de guérison, les œdèmes se résorbent progressivement en 3 à 8 jours. Cette forme clinique est
habituellement associée à une infection par une souche virale de basse virulence ou se rencontre sur des sujets
immunisés par des souches virales hétérologues, ou apparaît en rapport avec des variations biologiques chez
l’animal infecté.
La forme aiguë ou mixte associe à la fois la forme pulmonaire et la forme cardiaque et elle est souvent la forme la
plus fréquente chez le cheval et le mulet. La mort survient en 3 à 6 jours après le début de l’hyperthermie, et le
taux de mortalité est d’environ 70 %. La maladie peut se manifester de la façon suivante :
! Des signes pulmonaires initiaux relativement modérés sont suivis par l’apparition de tuméfactions
œdémateuses importantes de la tête et de l’encolure, la mort résultant d’un arrêt cardiaque.
! Des tuméfactions œdémateuses, typiques de la forme subaiguë, sont suivies par l’apparition soudaine d’une
dyspnée et des autres signes cliniques caractéristiques de la forme suraiguë pulmonaire.
La forme fébrile pure est la forme la plus discrète et passe souvent inaperçue dans les foyers. L’incubation varie
de 5 à 14 jours débouchant sur une réaction fébrile (39 à 40 °C) de type rémittent, avec une rémission le matin et
une exacerbation le soir, durant 5 à 8 jours. Mis à part la réaction fébrile, les autres manifestations sont rares. Les
conjonctives peuvent être légèrement congestionnées, le pouls accéléré, et un certain degré d’anorexie et
d’abattement peut être noté ainsi qu’un œdème des fosses supra-orbitales. Il n’y a pas de mortalité. Cette forme
de maladie est habituellement observée chez les animaux bénéficiant déjà d’une immunité partielle et sur les
espèces résistantes, telles que les ânes et les zèbres.
Il n’existe aucune donnée plaidant pour la possibilité d’infection de l’homme par une souche de terrain de virus de
la PE, soit à la suite d’un contact avec des animaux infectés naturellement ou expérimentalement, soit au cours
de manipulation du virus au laboratoire. Cependant certaines souches vaccinales neurotropes peuvent entraîner
des encéphalites et des rétinites chez l’homme, suite à une contamination trans-nasale (28). La transmission
expérimentale et naturelle du virus au chien a été rapportée, suite à l’ingestion de viande de cheval infecté (3).
Néanmoins, on ne dispose que de peu d’éléments quant à la possibilité d’infection du chien par piqûre
d’insecte (34).
2. Isolement et identification de l’agent pathogène
Plusieurs techniques sont déjà disponibles pour l’identification du virus de la PE, allant de l’épreuve
immuno-enzymatique de capture (ELISA sandwich indirect) qui est une technique rapide et utilisant des anticorps
soit polyclonaux (AcP) soit monoclonaux (AcM), à la réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui
inclue une nouvelle technique de transcription inverse couplée à une PCR (RT-PCR) pour discriminer les
9 sérotypes du virus (31) et en passant par la culture sur cellule et l’inoculation à un souriceau nouveau-né. Si
possible, plus d’une épreuve doit être réalisée pour diagnostiquer un foyer de PE, spécialement pour préciser le
taux d’atteinte. L’épreuve initiale peut être une épreuve rapide telle que l’ELISA ou la PCR, complétée par
l’isolement du virus en culture de cellules. La séroneutralisation virale (SN) permettant l’identification du sérotype,
doit être effectuée aussitôt que possible lors d’épizootie afin de pouvoir choisir le vaccin adapté. Par la suite,
l’ELISA sera très utile pour le diagnostic de laboratoire.
Aujourd’hui, il n’existe aucune souche virale de référence au niveau international, ni de réactifs de diagnostic de
référence, et ni aucune méthodologie normalisée pour l’identification du virus de la PE. Néanmoins un panel de
virus a été évalué et des études comparatives entre différentes tests ELISA pour l’identification antigénique ont
été conduites dans différents laboratoires. Les résultats ont démontré un haut niveau de corrélation, pour la
détection antigénique (30) lorsque l’on utilise la méthode ELISA sandwich indirecte (13, 18).

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Un élément très important du diagnostic est le choix des prélèvements et les conditions de leur transport au
laboratoire.
a) Prélèvements pour isolement du virus
Du sang récolté sur anti-coagulant durant le début de la phase fébrile de la maladie, ainsi que des fragments
(2 à 4 g) de rate, poumon et nœuds lymphatiques prélevés sur un animal venant de mourir, constituent les
prélèvements de choix du diagnostic. Ils doivent être placés à 4 °C durant le transport et au laboratoire.
b) Culture de cellules
L’isolement direct du virus a été réalisé avec succès sur lignées de cellules de mammifères : cellules de rein
de jeunes hamsters (BHK-21), de singe (MS), de rein de singe vert africain (Vero), ainsi que sur des lignées
de cellules de moustiques et de Culicoides. Les prélèvements de sang recueillis sur un anticoagulant
approprié peuvent être utilisés non dilués comme inoculum. Après 15 à 60 min d’adsorption à température
ambiante ou à 37 °C, les cellules en culture sont lavées et le milieu d’entretien est ajouté. Il est aussi
possible et plus courant de laver le sang, de le lyser et le diluer au 1/10. Cette modalité élimine les anticorps
indésirables qui peuvent neutraliser le virus et favorise la libération des virus associés aux membranes
cellulaires des globules rouges. Quand des prélèvements tissulaires (rate, poumon, etc.) sont utilisés, une
suspension tissulaire à 10 % est préparée dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)
ou dans du milieu de culture de cellules, contenant des antibiotiques.
Un effet cytopathogène (ECP) peut apparaître entre 2 et 10 jours en post-infection avec les cellules de
mammifère. Trois passages aveugles doivent être réalisés avant de considérer les prélèvements comme
négatifs. Sur cellules d’insecte, aucun ECP n’est observé, mais la présence du virus peut être détectée 7 à
10 jours après que les cellules d’insecte infectées soient passées sur cellules de mammifère.
c) Souriceau nouveau-né
Cette méthode d’isolement de l’AHSV nécessite une inoculation intra-cérébrale de deux familles de
souriceaux âgés de 1 à 3 jours. Lors de résultats positifs, les animaux présentent des signes nerveux entre
3 et 15 jours après l’inoculation. Les cerveaux des animaux malades peuvent être récoltés, homogénéisés
et ré-inoculés par voie intra-cérébrale à au moins 6 souriceaux de 1 à 3 jours. Le second passage doit
induire une réduction de la période d’incubation (2 à 5 jours) et 100 % d’infectiosité. Le typage du virus peut
être réalisé directement à partir des cerveaux de souris soit par la technique conventionnelle de séro-
neutralisation, soit par extraction et séquençage de l’ARN.
d) Méthode immuno-enzymatique sandwich
Au moins deux techniques ELISA sandwich spécifiques de groupe ont été mises au point et appliquées à la
détection de l’antigène de l’AHSV à la fois sur des prélèvements de terrain et sur des cultures de cellules
infectées au laboratoire (13, 18).
L’une (13), utilise des AcPs et l’autre (18), des AcMs vis-à-vis de l’une des protéines majeures la mieux
conservée parmi les sérotypes – la protéine VP7. Les deux méthodes se sont révélées convenables pour le
diagnostic de la PE, en raison de leur grande sensibilité et spécificité ainsi que de l’obtention des résultats
en seulement 2 à 4 h (30). L’utilisation de l’immunoglobuline IgY dans un ELISA en double sandwich
d’anticorps pour la détection de tous les sérotypes de l’AHSV, a aussi été décrite (6).
Les réactifs nécessaires à l’ELISA peuvent être obtenus auprès des Laboratoires de référence de l’OIE pour
la peste équine (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre).
! Ce qui suit est un exemple d’ELISA utilisant des anticorps monoclonaux
i) Phase solide : adsorber sur les plaques ELISA (par exemple Nunc Maxisorb à haute capacité
d’adsorption) un mélange de AcM 5G5 et 3D2 dilué en PBS, pH 7,2 (10 µg/ml). Incuber une nuit à
4 °C ;
ii) Laver les plaques 5 fois avec de l’eau distillée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (solution de
lavage). Tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante pour éliminer le liquide
résiduel ;
iii) Saturer les plaques avec du PBS + 1 % de sérum-albumine bovine (SAB), pH 7,2, 200 µl par puits,
pendant 1 h à 37 °C ;
iv) Éliminer la solution de blocage et tapoter délicatement les plaques sur une substance absorbante ;

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v) Prélèvements à tester : ajouter les prélèvements à tester (dilutions de 2 en 2 en commençant par les
homogénats ou les surnageant de cultures de cellules non dilués) dilués en PBS + 1 % SAB, pH 7,2,
100 µl par puits. Incuber pendant 1 h à 37 °C. (homogénat de rate : homogénéiser environ 2 cm3 [1 g]
de rate dans 3 ml de milieu de culture MEM [milieu essentiel minimum]. Centrifuger à 600 g pendant
10 min et récupérer le surnageant) ;
vi) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
vii) Conjugué : répartir 100 µl par puits de 5G5 AcM marqué à la biotine, dilué au 1/500 en PBS + 1 % de
SAB, pH 7,2. Incuber 1 h à 37 °C. Laver les plaques comme décrit à l’étape ii). Ajouter 100 µl par puits
d’avidine/peroxidase à la dilution optimale en PBS + 1 % de SAB. Incuber 45 min à la température
ambiante ;
viii) Laver les plaques comme décrit à l’étape ii) ;
ix) Substrat : ajouter 200 µl par puits de solution de substrat (10 ml de DMAB 80,6 mM [diméthyl amino
benzaldéhyde] + 10 ml de MBTH 1,56 mM [3-méthyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone hydrochlorure]
+ 5 µl de H2O2). Le développement de la couleur est stoppé par addition de 50 µl de H2SO4 3 N, après
environ 5 à 10 min (avant que les témoins négatifs commencent à se colorer) ;
x) Lire les plaques à 600 nm (ou 620 nm) ;
xi) Interprétation des résultats : calculer le seuil critique de la façon suivante : C + ou – 0,06 = Seuil (où C
est la valeur de densité optique [DO] obtenue avec le témoin négatif). Les prélèvements donnant des
DO inférieures au seuil sont considérés négatifs. Les prélèvements donnant des DO supérieures
de + 0,20 sont considérés positifs. Les échantillons donnant des DO intermédiaires sont douteux et
doivent faire l’objet d’une autre technique afin de confirmer les résultats.
e) Réaction d’amplification en chaîne par polymérase
Une technique RT-PCR a été mise au point pour la mise en évidence spécifique du génome viral. Cette
épreuve (méthode 1) peut être utilisée pour détecter l’ARN viral dans le sang collecté sur éthylène diamine
tétra-acétique (EDTA), ou dans des tissus équins ou de souris ou dans des cultures cellulaires. Les amorces
correspondent aux extrémités 5’ (nucléotides 1-21) et 3’ (nucléotides 1160-1179) du segment 7 de l’ARN
(4, 22, 33, 40) et amplifient le segment 7 en entier. Plus récemment, une nouvelle technique conventionnelle
(méthode 2) et une RT-PCR en temps réel (méthode 3) utilisant des amorces d’une région très conservée
du même segment 7 de l’ARN viral ont été mises au point afin d’améliorer la sensibilité et la rapidité du
diagnostic de la PE (10). Les 3 techniques de RT-PCR peuvent détecter les 9 sérotypes ; elles sont décrites
ci-dessous.
! Protocole de la méthode 1 (4)
L’extraction des acides nucléiques à partir de prélèvements de rate, est effectuée de la façon suivante :
1 g du prélèvement tissulaire est homogénéisé dans 1 ml de solution dénaturante (thiocyanate de guanidium
4 M, citrate de sodium 25 mM, 2-mercaptoéthanol 0,1 M, sarcosyl 0,5 %). Après centrifugation, 1 µg d’ARN
de levure, 0,1 ml d’acétate de sodium 2 M pH 4, 1 ml de phénol et 0,2 ml d’un mélange (49/1) de
chloroforme/alcool isoamylique, sont ajoutés au surnageant. La suspension est agitée vigoureusement et
placée sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, l’ARN présent dans la phase aqueuse est extrait au
phénol, précipité à l’éthanol et repris en eau stérile. Les méthodes de synthèse de l’ADNc et d’amplification
en PCR sont appliquées, dans tous les cas, à une température de régénération de 37 °C. Les séquences
d’amorces PCR utilisées sont : 5’-GTT-AAA-ATT-CGG-TTA-GGA-TG-3’, qui correspond à la polarité de
l’ARN messager et 5’-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3’, qui est complémentaire de la polarité de l’ARN
messager. Le protocole PCR proprement dit comprend 40 cycles (94 °C pendant 1 min, 55 °C durant
1,5 min, 72 °C pendant 2,5 min et 70 °C durant 7 min) puis les tubes PCR sont conservés à 4 °C. L’analyse
des produits PCR est conduite par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1,2 % (poids/volume) contenant
du bromure d’éthidium. Les prélèvements positifs donneront des bandes de 1179 paires de base.
! Protocole de la méthode 2 (10)
L’extraction de l’ARN double brin peut être réalisée en utilisant le kit commercialisé High Pure Viral Nucleic
Acid (Roche Diagnostics), décrit ci-dessous. D’autres kits d’extraction de l’ARN sont disponibles dans le
commerce pour la préparation de matrices convenant à la RT-PCR selon l’échantillon à analyser et peuvent
être utilisées. Différents échantillons peuvent être soumis à analyse selon cette procédure comme des
surnageants de cultures cellulaires, du sang récolté sur EDTA, du sérum ou des tissus homogénéisés.
Le kit High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Diagnostics) comprend les réactifs suivants : un tampon de
liaison, de l’ARN porteur de Poly (A), la protéinase K, un tampon qui élmine les inhibiteurs, un tampon de
lavage et des tubes filtres (high pure filter tubes) et des tubes de collecte.