présentation ici - Ligue contre la cardiomyopathie

« Thérapie cellulaire des cardiomyopathies par des
progéniteurs exprimant l’aldéhyde déhydrogénase
(ALDH) »
Deuxième Journée des Cardiomyopathies
Institut de Cardiologie – GH Pitié-Salpêtrière
Samedi 10 Octobre 2015
Jean-Thomas Vilquin, PhD
Centre de Recherche en Myologie
UMRS974 UPMC-INSERM, FRE3617 CNRS, AIM
Plan
•Contexte général de la thérapie cellulaire cardiaque
•Types cellulaires utilisés, essais cliniques
•Greffes en modèles animaux de cardiomyopathies (expérience
du laboratoire)
•Cellules exprimant l’aldéhyde déhydrogénase (ALDH)
Mise en évidence
Caractérisations phénotypiques (différentes espèces, tissus)
Caractérisations biologiques
Transplantations chez l’animal
Perspectives, modèles complémentaires
UMR S974
Physiopathologie de cardiopathies
Ao.
Ao.
O.D.
V.D.
O.G.
O.G.
O.D.
V.G.
V.D.
Source: anatomyuptodate.com
Apex V.G.
Cardiopathie post-ischémique
Cardiopathie dilatée
•Insuffisance cardiaque: besoins médicaux, sociaux, économiques.
Pathologies obstructives vasculaires ou cardiologiques, ou génétiques.
Pronostic sombre: « number one killer ».
•Infarctus du Myocarde : reparer le tissu et limiter le remodelage.
•Cardiopathie dilatée : renforcer le myocarde, limiter le remodelage.
DMC1A,1B
Les (cardio)myopathies,
une myriade de mutations
Bethlem
Ullrich
DMC1A,1B
Bethlem
Ullrich
Sarcoglycanopathie
(Hamster Syrien CHF)
*
*
LGMD2C-2F
DMC
LGMD2B
DMD, DMB
LGMD1C
Nemaline
Laing
Nemaline
LGMD2G
Desminopathie
Nemaline
LGMD2J
*
Source: AFM
LGMD2I
*
Myopathie Emery-Dreifuss
(LMNA, Laminopathie)
LGMD1A
LGMD2A
DMC1C
*
*
LGMD2H
LGMD1B
*
*
DMED
LGMD2A
Myopathies de Duchenne et
Becker (mdx, GRMD)
DMFSH
DMOP
Quelles modalités de thérapie cellulaire ?
« Médicament: réparer, restaurer, corriger, modifier
une fonction organique ».
Autologue
Donneur = Receveur
Cellules accessibles
Autologue
Modification cellulaire
Donneur = Receveur
Hétérologue
Donneur ≠ Receveur
Cellules non accessibles
Les + : Pas de rejet
Les - : Gènes malades
conservés
Réservé aux cas
extrêmes
Les +: Capacités régénératives
« Donneurs universels »
Les -: Rejet – Sécurité biologique
Types cellulaires cardiaques (minimaliste!)
Cardiomyocytes
-> Contractilité
Cellules
endothéliales
-> Perfusion
Cellules souches
cardiaques
-> Renouvellement
Tissu conjonctif
-> Elasticité
C
y
t
o
k
i
n
e
s
UMR S974
Pré-requis: disponibilité clinique des cellules
Caractérisation cellulaire
Intégration
(biologique,
immunologique)
Applicabilité
clinique
Administration (voies)
Accès (facilité)
Rendement
(extraction,
amplification)
Différenciation
UMR S974
La greffe cellulaire est-elle immunogène?
•Chez la Souris:
Syngénique: Bonne tolérance, anticorps
Allogénique: FK506 (Rapamycine, Ciclosporine)
Xénogénique: en souris SCID, Rag…
•Chez le Chien: FK506 + mycophénolate + CSA
•Chez le Primate: FK506
•Chez l’Homme: FK506
•D’autres problèmes demeurent: migration, mort cellulaire…
UMR S974
Aperçu des candidats cellulaires et de leurs origines
Sanganalmath et al., Circulation 2013
Différenciation cardiaque de cellules pluripotentes
Buikema et al., Stem Cells 2013
Les cellules ES
humaines
s’intègrent au
myocarde de
Primate.
Mais des risques
demeurent
(tératomes).
La mâturation des
cardiomyocytes dérivés des
cellules ES progresse avec le
temps in vivo.
Chong et al., Nature 2014
Essais cliniques de cellules d’origine cardiaque
Administration de cellules c-kit+,
cultivées à long terme.
Nombre de cellules injectées très
faible.
Chugh et al., Circulation 2012
Controverses à propos des « cardiac c-kit+ progenitors »
Candidats cellulaires issus de la moelle osseuse
Leri et al., Nature Reviews Cardiology 2013
Les CSH ne remplacent pas le tissu cardiaque
Chien KR et al., Nature
UMR S974
Essai clinique C-Cure: induction préalable de cellules médullaires
•Patients: 47
•Cellules: 670x106
•Type d’essai: Phase
II / Placebo
Bartunek et al., JACC, 2013
Essais cliniques MO: plusieurs méta-analyses
• Martin-Rendon et al., Eur. Heart Journal 2008
– Infusion cell. médullaires, infarctus aigû, 811 patients / 13 études
– 3% augmentation FEVG, réduction VTS et lésions myocardiques
– Pas d’effet du G-CSF
• Jiang et al., Exp. Opinion. Biol. Ther. 2010.
– Infusion cell. médullaires, infarctus aigû ou chronique, 980 patients / 18 études
– Augmentation FEVG (3-18 mo), reductions VTSVG VTDVG.
– Efficacité supérieure en infarctus aigû avec cellules CD34+.
• Gho et al., J. Card. Failure 2013
– Cardiomyopathy dilatée, 15 études cliniques hétérogènes
– Infusion
– Bénéfices variables observés (3-11%), meilleures méthodologies requises
• Fisher et al., PLoSOne 2013
– Cardiopathie sans option (pathologies ischémiques); 9 études
– Infusion de cellules
– Bénéfices (FEVG, angor, qualité de vie, mortalité). Essais plus puissants
nécessaires.
UMR S974
Les résultats de certains essais sont controversés
Les articles contenant le moins de biais expérimentaux
ou rédactionnels ne rapportent pas de bénéfice.
Pré-requis: disponibilité clinique des myoblastes
Caractérisation (CD56+)
Intégration
(Néo-tissu,
autologue)
Administration (locale,
différentes voies)
Accès (biopsie muscle)
Rendement
(1 Milliard, P3,
10-12 div)
Différenciation
(myotubes)
UMR S974
Greffes de myoblastes dans l’insuffisance post-ischémique
Tissu Cardiaque
Rat
Tissu squelettique
Implantation en zone lésée
Bénéfice fonctionnel de l’implantation
Mouton
Implantation en zone lésée
Colonisation cellules Satellites
UMR S974
Biopsie musculaire
Eminçage fin
Mise en culture, expansions
1 milliard de cellules
Survie et devenir des cellules: importance de la méthodologie
En poches, les cellules ne
survivent pas de la même
façon. Le nombre importe.
Skuk et al., Transplantation.
Mise en place d’un essai de Phase 1
•Faisabilité, sécurité
•10 Patients recrutés
•Infarctus ancien
•Fraction d’éjection < 35%
•Injection des cellules en
complément d’un pontage
M. Henri Sananes,
premier patient
Phase I: des résultats encourageants
Amélioration de perfusion
Amélioration de fonction (écho)
•870x106 cellules injectées
•Bonne tolérance
•Epaississement systolique (63% segments)
•Fraction d’éjection augmente de 24% à 32%
•Score clinique amélioré de 2.7 à 1.6 (NYHA)
•Arrythmies (3/10) et pose de défibrillateurs
•Effet du pontage?
Persistance des greffons
Menasché et al. Lancet, 2001
UMR S974
L’essai MAGIC: phase II internationale
Conception de l’étude
- Multi-centrique
- Randomisée, double aveugle, contrôlée placebo
- Trois groupes parallèles (n = 97):
 faible dose Mb : 400 100 x 106 cell. (n = 33)
 Haute dose Mb : 800 100 x 106 cell. (n = 30)
 Placebo (milieu) (n = 34)
- Pontage concomitant des segments non
transplantés (excepté pour 8 patients)
UMR S974
La greffe de myoblastes améliore-t-elle la fonction?
LVEF absolute change (%)
12.5
10.0
p=0.71
7.5
p=0.64
•Absence d’effets adverses graves
•Pas d’effet sur la fonction globale
•Limitation transitoire des volumes
et du remodelage
5.0
2.5
0.0
N=26
N=27
N=30
High dose
Low dose
Placebo
mL30
•Un échec?
Ou le lancement d’une thématique?
mL0
p=0.006
p=0.62
EDV absolute change
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
N=26
-23.0
N=27
-9.0
High dose
Low dose
N=30
+9.0
Placebo
ESV absolute change
20
-10
N=26
-18.0
N=27
-12.0
N=30
-3.0
-20
p=0.008
-30
p=0.26
-40
High dose
Low dose
Placebo
Conclusions - Les essais
•Cellules: production ou récolte possibles
•Approches techniques: faisables, sûres
•Phases I: résultats enthousiastes.
•Phases II: résultats mitigés. Améliorations modestes
le cas échéant. Cohortes limitées en nombre, suivis
encore courts
--- >Thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque
•Est encore à ses débuts (balbutiements)
•Certains résultats encourageants
•Demande des stratégies améliorées
UMR S974
Greffe de Myoblastes en Hamster cardiomyopathe
Histoire naturelle:
•3 mois: dilatation sans phase d’hypertrophie
• 6 mois: nécrose, fibrose et calcifications+++
dilatation ventriculaire ++
• 9 mois: insuffisance cardiaque compensée
• 12 mois: insuffisance cardiaque congestive globale
décompensée: décès
<- Fibrose et
calcifications
myocardiques
Myoblastes
(culture) ->
Analyse histologique 4 semaines après implantation
Myotube
Cardiomyocytes
Myotubes
exprimant la
Myosine rapide ->
UMR S974
Evaluation fonctionnelle: échocardiographie
-> Stabilisation ou amélioration de la fraction de raccourcissement
Pouly et al., Circulation 2004
UMR S974
Le modèle LMNA de cardiomyopathie dilatée
H222P/H222P
WT
H222P / H222P
% fraction raccourcissement
p<0.05
p<0.05
p<0.001
p<0.001
100
p<0.001
WT(n=50)&H222P/+ (n=50)
WT
H222P/H222P
n= 7
12
12
12
male femelle
4 mo
% survival
H222P/H222P
80
WT
50
45
40
35
30
25
20
15
10
7
8
11
12
male femelle
6 mo
Arimura et al, Hum Mol Genet, 2005
11 12
femelle
8 mo
H222P/H222P
60
Femelle
40
H222P/H222P
20
n=27
0
0 4
n=23
male
5
6
7
8
9
Age en mois
10
11
12
13
UMR S974
Suivi des cellules et des Souris : comparaison ES - Myoblastes
Les souris injectées avec des
myoblastes survivent plus longtemps.
Les ES ne prolongent pas la vie.
Les myoblastes sont présents dans
le myocarde, à différents niveaux
selon l’injection.
UMR S974
Intégration différentielle des cellules au sein des myocardes
<- 30 jours après greffe, les cellules ES
ont disparu ou forment des tératomes
<- 30 et 60 jours après greffe, les
myoblastes persistent et forment des
fibres musculaires
->
60 jours après injection, présence
de petites zones de fibrose aux sites
d’injection
->
UMR S974
Intégration différentielle des cellules ES et des myoblastes
<- Quelques cellules ES expriment des
marqueurs cardiaques lorsque des
tératomes sont formés.
Les myoblastes colonisent les zones
injectées et se différencient en
structures exprimant des marqueurs
musculaires squelettiques
->
UMR S974
La fonction cardiaque est-elle modifiée par ces cellules?
ESC
Les myoblastes
stabilisent ou améliorent
la fonction.
Mais les ES sont sans
effet.
Message: les modèles (les environnements) ne sont pas équivalents
UMR S974
Pourquoi les cellules « Aldéhyde Déhydrogénase + » ?
•Marqueur de cellules souches (hématopoïétiques, neurales…)
•17 isoenzymes avec des substrats spécifiques
•Fonction: oxydation des aldéhydes en acides carboxyliques
•Rôles: détoxification (aldéhydes), métabolisme (acide rétinoïque)
Aldefluor –
LIPOPHILE
Fluorescent
DEAB
Diethylamino-benzaldehyde
Aminoacétate LIPOPHOBE
Accumulation.
Réactif pré-clinique / clinique (cellules sanguines). Marqueur de viabilité.
UMR S974
(Co) expression de nombreuses isoenzymes
Isoenzymes
Localisation
Expression
Substrat
ALDH1A1
Cytosol
SKM
Rétinaldéhyde
ALDH1A2
Cytosol
?
Rétinaldéhyde
ALDH1A3
Cytosol
SKM
Rétinaldéhyde
ALDH1B1
Mitochondrie
SKM, Coeur
Acétaldéhyde
ALDH1L1
Cytosol
?
Formyl-tétrahydrofolate
ALDH2
Mitochondrie
SKM, Coeur
Acétaldehyde, 4-HNE
ALDH3A1
Cytosol, noyau
?
Aldéhydes aromat. aliphat.
ALDH3A2
Microsomes
SKM, Coeur
Aldéhydes gras
ALDH3B1
Cytosol
?
?
ALDH4A1
Mitochondrie
SKM, Coeur
Semialdéhyde glutamique
ALDH5A1
Mitochondrie
SKM, Coeur
Semialdéhyde succinique
ALDH7A1
Cyt., Nucl., Mito.
Coeur
Aminoadipic semi-aldéhyde
ALDH8A1
Cytosol
?
Rétinaldéhyde
ALDH9A1
Cytosol
SKM, Coeur
Aminobutyraldéhyde
ALDH18A
Mitochondrie
?
Semi-aldéhyde glutamique
UMR S974
Détection des populations de cellules ALDH+
Cellules de tissus hématopoïétiques
Cellules de tissu musculaire squelettique humain
400
10 3
G2
10 2
0
G3
10 1
200
10 0
10 1
Neg control
3
10 2
10 =
10 4
(Aldefluor
DEAB)
ALDH
CD34 APC
600
10 4
CD34 APC
800
G1
SSC-Height
SSC-Height
1000
G3
G4
G4
ALDH
10 0
100
101
102
ALDH
103
104
 ALDH+ : 1 - 4% de la population initiale (dépend des espèces, du tissu)
 2 sous-populations : ALDH+/34- (25%) et ALDH+/34+ (75%)
Vauchez et al., Mol Ther 2009
Les populations évoluent-elles avec l’âge ou la maladie?
ALDH activity
20
2.0
* p=0,0056
15
1.0
0.5
0
0
0.0
M
ol
tr
M
on
C
C
C
on
D
ol
tr
M
D
tr
on
D
5
D
5
D
10
D
10
1.5
Cells (%)
Cells (%)
15
ol
Cells (%)
20
ALDH/CD34- cells
ALDH/CD34+ cells
* p=0,0042
Chez les patients DMD, les cellules ALDH sont augmentées
TFL 41-70 a
25
%
75%
Parav. control
TFL > 71 a
ALDH+/34-
ALDH+/34-
Parav. DMD
ALDH+/34-
ALDH+/34-
27
%
86%
73%
90%
Chez l’Homme, la proportion de cellules ALDH/CD34- tend à
diminuer avec l’âge ou la maladie
UMR S974
Phénotype des cellules ALDH en culture
ALDH+/34-SMALD/34-derived
ALDH+/34+
cells
§
Cellules dérivées des ALDH+/34-
#
100
% cellules positives
§
Non sorted derived cells
(n=9)
80
#
60
ALDH+/34- derived cells
(n=5)
ALDH+/34+ derived cells
(n=7)
40
Cellules dérivées des ALDH+/34+
Double negative derived cells
(n=6)
20
0
CD 56
Vauchez et al., Mol Ther 2009
CD15
# : P≤0,05
: P<0,01
§ : P<0,001
UMR S974
Différenciation in vitro à court terme
ALDH+/34-
ALDH+/34+
Control
UMR S974
Capacités de différenciation des ALDH+ in vitro
Différenciation
Myogénique
Différenciation
Adipogénique
Cellules
dérivées des
ALDH+/34-
Cellules
dérivées des
ALDH+/34+
Cellules dérivées des ALDH+/34- :
Cellules CD56+ cells avec capacité myogénique
Cellules dérivées des ALDH+/34+ :
Cellules CD56- hétérogènes avec capacité adipogénique
UMR S974
Vauchez et al., Mol Ther 2009
Ratio [(ALDH+/34-) / ALDH+] x100
Le Ratio ALDH+/CD34- est-il un marqueur prédictif ?
Ratio (%)
Surtout 56+
Surtout 56-
10
15%
85%
20
26%
74%
25.5
50%
50%
30
72%
28%
40
99%
1%
>40
100%
0%
Des proportions élevées du ratio ALDH+/34- favorisent des
rendements myogéniques plus élevés
UMR S974
Potentiel In vivo: injection
intramusculaire de cellules
triées ALDH+/34+ en
souris SCID
Cox 2
Lamin A/C
Laminin
Irradiation
1 - Notexine
2 - Cellules
Vauchez et al., Mol Ther 2009
Potentiel In vivo: injection
intramusculaire de cellules
triées ALDH+/34- en souris
SCID
Cox 2
Lamin A/C
Laminin
Potentiel In vivo: injection
intramusculaire de cellules
triées ALDH+/34- en souris
SCID
Dystrophin
Lamin A/C
Laminin
Des cellules ALDH+/CD34- stimulées par des cytokines
survivent et se différencient au sein du tissu cardiaque
Connexin-43
Lamin A/C
-Actinin
Des ilôts de cellules exprimant les
antigènes du donneur sont identifiés
UMR S974
Des cellules ALDH+/CD34- stimulées par des cytokines
survivent et se différencient au sein du tissu cardiaque
Des cellules du
donneur sont
associées à des
structures
exprimant des
marqueurs
cardiaques
UMR S974
Des projets multi-thématiques concernant les cellules ALDH+...
CD34 APC
Phénotypages
Cytométrie, cytologie
Différentes espèces
Histologie
Tissuthèques contrôles
et pathologiques
ALDH
Développement in vitro
Expansions
Différenciations, inductions
Agents pharmacologiques
Comparaisons moléculaires
ALDH+
CD133, CD146, péricytes,
satellites, moelle, cordon…
Transcriptome
Différenciations musculaires squelettiques ou cardiaques in vivo
Preuves de concept
Modèles pathologiques
Voies d’administrations directes ou systémiques
UMR S974
Voies d’améliorations
• Améliorer les voies d’administration
– Nouveaux cathéters
– Suivi des cellules (Imagerie, RMN…)
• Améliorer la survie, la rétention, la distribution, la migration
des cellules
– Améliorer l’angiogénèse, réduire l’apoptose, réduire l’aneukoisis
– Utiliser des matrices
• Bio-ingéniérie
– Préparer des « prothèses » tissulaires ex vivo
• Les perspectives sont dans la progression actuelle…
– La thérapie cellulaire à visée clinique a décuplé les recherches…
UMR S974
Ingéniérie tissulaire cardiaque (réparation localisée)
Limitations, problèmes:
Fibrose cardiaque, inflammation
Survie cellulaire, hypoxie, vascularisation, perfusion
Vunjak-Novakovic et al., 2013
Le concept de feuillets cellulaires pour réparation locale
Limitations: survie des cellules, intégration
dans le myocarde, vascularisation.
Hamdi et al., Cardiovasc. Res 2013
UMR S974
Association de cellules ES et d’un patch: essai clinique
Quel type cellulaire, quelle manipulation idéale ?
• Cellules: exigences
• Manipulations génétiques
–
–
–
–
Se multiplient in vitro
– Chirurgie génique (Nucléases)
Immuno-privilégiées
– Réparation ARN (exon skipping)
Délivrance systémique
– Expression protéine (non mutées)
Survivent, migrent,
– Environnement (Fibrose…)
prolifèrent sur site
• Manipulations pharmacologiques
– Se différencient en tissu
– Chocs thermiques
cardiaque
– Facteurs de croissance (VEGF,
– Reconstituent un pool de
IGFs, bFGF…)
cardiomyocytes
– Anti-oxidants, losartan…
– …?
UMR S974
Karine Vauchez - Cyril Catelain - Stéphanie
Riveron – Jessy Etienne - Erica Yada - AnneSophie Pellen – François Treuil - Ludovic Arandel –
Yves Fromes – Bruno Pouzet – Julia Pouly - Marc
Fiszman – Gisèle Bonne - Vincent Mouly - Gillian
Butler-Browne
Stéphane Vasseur - Maud Chapart
Elodie Laffrat – Serban Morosan – Marjorie
Lagrevol
UMR S974
Myobank
Jean-Pierre Marolleau, Jérôme Larghero & le
laboratoire de thérapie cellulaire de Saint Louis
Michel Schmid – Catherine Blanc - Alain Chapel
Onnik Agbulut – Pierre Joanne – Solenne Boitard
Philippe Menasché – Alain Hagège – Michel
Desnos