« Thérapie cellulaire des cardiomyopathies par des progéniteurs exprimant l’aldéhyde déhydrogénase (ALDH) » Deuxième Journée des Cardiomyopathies Institut de Cardiologie – GH Pitié-Salpêtrière Samedi 10 Octobre 2015 Jean-Thomas Vilquin, PhD Centre de Recherche en Myologie UMRS974 UPMC-INSERM, FRE3617 CNRS, AIM Plan •Contexte général de la thérapie cellulaire cardiaque •Types cellulaires utilisés, essais cliniques •Greffes en modèles animaux de cardiomyopathies (expérience du laboratoire) •Cellules exprimant l’aldéhyde déhydrogénase (ALDH) Mise en évidence Caractérisations phénotypiques (différentes espèces, tissus) Caractérisations biologiques Transplantations chez l’animal Perspectives, modèles complémentaires UMR S974 Physiopathologie de cardiopathies Ao. Ao. O.D. V.D. O.G. O.G. O.D. V.G. V.D. Source: anatomyuptodate.com Apex V.G. Cardiopathie post-ischémique Cardiopathie dilatée •Insuffisance cardiaque: besoins médicaux, sociaux, économiques. Pathologies obstructives vasculaires ou cardiologiques, ou génétiques. Pronostic sombre: « number one killer ». •Infarctus du Myocarde : reparer le tissu et limiter le remodelage. •Cardiopathie dilatée : renforcer le myocarde, limiter le remodelage. DMC1A,1B Les (cardio)myopathies, une myriade de mutations Bethlem Ullrich DMC1A,1B Bethlem Ullrich Sarcoglycanopathie (Hamster Syrien CHF) * * LGMD2C-2F DMC LGMD2B DMD, DMB LGMD1C Nemaline Laing Nemaline LGMD2G Desminopathie Nemaline LGMD2J * Source: AFM LGMD2I * Myopathie Emery-Dreifuss (LMNA, Laminopathie) LGMD1A LGMD2A DMC1C * * LGMD2H LGMD1B * * DMED LGMD2A Myopathies de Duchenne et Becker (mdx, GRMD) DMFSH DMOP Quelles modalités de thérapie cellulaire ? « Médicament: réparer, restaurer, corriger, modifier une fonction organique ». Autologue Donneur = Receveur Cellules accessibles Autologue Modification cellulaire Donneur = Receveur Hétérologue Donneur ≠ Receveur Cellules non accessibles Les + : Pas de rejet Les - : Gènes malades conservés Réservé aux cas extrêmes Les +: Capacités régénératives « Donneurs universels » Les -: Rejet – Sécurité biologique Types cellulaires cardiaques (minimaliste!) Cardiomyocytes -> Contractilité Cellules endothéliales -> Perfusion Cellules souches cardiaques -> Renouvellement Tissu conjonctif -> Elasticité C y t o k i n e s UMR S974 Pré-requis: disponibilité clinique des cellules Caractérisation cellulaire Intégration (biologique, immunologique) Applicabilité clinique Administration (voies) Accès (facilité) Rendement (extraction, amplification) Différenciation UMR S974 La greffe cellulaire est-elle immunogène? •Chez la Souris: Syngénique: Bonne tolérance, anticorps Allogénique: FK506 (Rapamycine, Ciclosporine) Xénogénique: en souris SCID, Rag… •Chez le Chien: FK506 + mycophénolate + CSA •Chez le Primate: FK506 •Chez l’Homme: FK506 •D’autres problèmes demeurent: migration, mort cellulaire… UMR S974 Aperçu des candidats cellulaires et de leurs origines Sanganalmath et al., Circulation 2013 Différenciation cardiaque de cellules pluripotentes Buikema et al., Stem Cells 2013 Les cellules ES humaines s’intègrent au myocarde de Primate. Mais des risques demeurent (tératomes). La mâturation des cardiomyocytes dérivés des cellules ES progresse avec le temps in vivo. Chong et al., Nature 2014 Essais cliniques de cellules d’origine cardiaque Administration de cellules c-kit+, cultivées à long terme. Nombre de cellules injectées très faible. Chugh et al., Circulation 2012 Controverses à propos des « cardiac c-kit+ progenitors » Candidats cellulaires issus de la moelle osseuse Leri et al., Nature Reviews Cardiology 2013 Les CSH ne remplacent pas le tissu cardiaque Chien KR et al., Nature UMR S974 Essai clinique C-Cure: induction préalable de cellules médullaires •Patients: 47 •Cellules: 670x106 •Type d’essai: Phase II / Placebo Bartunek et al., JACC, 2013 Essais cliniques MO: plusieurs méta-analyses • Martin-Rendon et al., Eur. Heart Journal 2008 – Infusion cell. médullaires, infarctus aigû, 811 patients / 13 études – 3% augmentation FEVG, réduction VTS et lésions myocardiques – Pas d’effet du G-CSF • Jiang et al., Exp. Opinion. Biol. Ther. 2010. – Infusion cell. médullaires, infarctus aigû ou chronique, 980 patients / 18 études – Augmentation FEVG (3-18 mo), reductions VTSVG VTDVG. – Efficacité supérieure en infarctus aigû avec cellules CD34+. • Gho et al., J. Card. Failure 2013 – Cardiomyopathy dilatée, 15 études cliniques hétérogènes – Infusion – Bénéfices variables observés (3-11%), meilleures méthodologies requises • Fisher et al., PLoSOne 2013 – Cardiopathie sans option (pathologies ischémiques); 9 études – Infusion de cellules – Bénéfices (FEVG, angor, qualité de vie, mortalité). Essais plus puissants nécessaires. UMR S974 Les résultats de certains essais sont controversés Les articles contenant le moins de biais expérimentaux ou rédactionnels ne rapportent pas de bénéfice. Pré-requis: disponibilité clinique des myoblastes Caractérisation (CD56+) Intégration (Néo-tissu, autologue) Administration (locale, différentes voies) Accès (biopsie muscle) Rendement (1 Milliard, P3, 10-12 div) Différenciation (myotubes) UMR S974 Greffes de myoblastes dans l’insuffisance post-ischémique Tissu Cardiaque Rat Tissu squelettique Implantation en zone lésée Bénéfice fonctionnel de l’implantation Mouton Implantation en zone lésée Colonisation cellules Satellites UMR S974 Biopsie musculaire Eminçage fin Mise en culture, expansions 1 milliard de cellules Survie et devenir des cellules: importance de la méthodologie En poches, les cellules ne survivent pas de la même façon. Le nombre importe. Skuk et al., Transplantation. Mise en place d’un essai de Phase 1 •Faisabilité, sécurité •10 Patients recrutés •Infarctus ancien •Fraction d’éjection < 35% •Injection des cellules en complément d’un pontage M. Henri Sananes, premier patient Phase I: des résultats encourageants Amélioration de perfusion Amélioration de fonction (écho) •870x106 cellules injectées •Bonne tolérance •Epaississement systolique (63% segments) •Fraction d’éjection augmente de 24% à 32% •Score clinique amélioré de 2.7 à 1.6 (NYHA) •Arrythmies (3/10) et pose de défibrillateurs •Effet du pontage? Persistance des greffons Menasché et al. Lancet, 2001 UMR S974 L’essai MAGIC: phase II internationale Conception de l’étude - Multi-centrique - Randomisée, double aveugle, contrôlée placebo - Trois groupes parallèles (n = 97): faible dose Mb : 400 100 x 106 cell. (n = 33) Haute dose Mb : 800 100 x 106 cell. (n = 30) Placebo (milieu) (n = 34) - Pontage concomitant des segments non transplantés (excepté pour 8 patients) UMR S974 La greffe de myoblastes améliore-t-elle la fonction? LVEF absolute change (%) 12.5 10.0 p=0.71 7.5 p=0.64 •Absence d’effets adverses graves •Pas d’effet sur la fonction globale •Limitation transitoire des volumes et du remodelage 5.0 2.5 0.0 N=26 N=27 N=30 High dose Low dose Placebo mL30 •Un échec? Ou le lancement d’une thématique? mL0 p=0.006 p=0.62 EDV absolute change 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 N=26 -23.0 N=27 -9.0 High dose Low dose N=30 +9.0 Placebo ESV absolute change 20 -10 N=26 -18.0 N=27 -12.0 N=30 -3.0 -20 p=0.008 -30 p=0.26 -40 High dose Low dose Placebo Conclusions - Les essais •Cellules: production ou récolte possibles •Approches techniques: faisables, sûres •Phases I: résultats enthousiastes. •Phases II: résultats mitigés. Améliorations modestes le cas échéant. Cohortes limitées en nombre, suivis encore courts --- >Thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque •Est encore à ses débuts (balbutiements) •Certains résultats encourageants •Demande des stratégies améliorées UMR S974 Greffe de Myoblastes en Hamster cardiomyopathe Histoire naturelle: •3 mois: dilatation sans phase d’hypertrophie • 6 mois: nécrose, fibrose et calcifications+++ dilatation ventriculaire ++ • 9 mois: insuffisance cardiaque compensée • 12 mois: insuffisance cardiaque congestive globale décompensée: décès <- Fibrose et calcifications myocardiques Myoblastes (culture) -> Analyse histologique 4 semaines après implantation Myotube Cardiomyocytes Myotubes exprimant la Myosine rapide -> UMR S974 Evaluation fonctionnelle: échocardiographie -> Stabilisation ou amélioration de la fraction de raccourcissement Pouly et al., Circulation 2004 UMR S974 Le modèle LMNA de cardiomyopathie dilatée H222P/H222P WT H222P / H222P % fraction raccourcissement p<0.05 p<0.05 p<0.001 p<0.001 100 p<0.001 WT(n=50)&H222P/+ (n=50) WT H222P/H222P n= 7 12 12 12 male femelle 4 mo % survival H222P/H222P 80 WT 50 45 40 35 30 25 20 15 10 7 8 11 12 male femelle 6 mo Arimura et al, Hum Mol Genet, 2005 11 12 femelle 8 mo H222P/H222P 60 Femelle 40 H222P/H222P 20 n=27 0 0 4 n=23 male 5 6 7 8 9 Age en mois 10 11 12 13 UMR S974 Suivi des cellules et des Souris : comparaison ES - Myoblastes Les souris injectées avec des myoblastes survivent plus longtemps. Les ES ne prolongent pas la vie. Les myoblastes sont présents dans le myocarde, à différents niveaux selon l’injection. UMR S974 Intégration différentielle des cellules au sein des myocardes <- 30 jours après greffe, les cellules ES ont disparu ou forment des tératomes <- 30 et 60 jours après greffe, les myoblastes persistent et forment des fibres musculaires -> 60 jours après injection, présence de petites zones de fibrose aux sites d’injection -> UMR S974 Intégration différentielle des cellules ES et des myoblastes <- Quelques cellules ES expriment des marqueurs cardiaques lorsque des tératomes sont formés. Les myoblastes colonisent les zones injectées et se différencient en structures exprimant des marqueurs musculaires squelettiques -> UMR S974 La fonction cardiaque est-elle modifiée par ces cellules? ESC Les myoblastes stabilisent ou améliorent la fonction. Mais les ES sont sans effet. Message: les modèles (les environnements) ne sont pas équivalents UMR S974 Pourquoi les cellules « Aldéhyde Déhydrogénase + » ? •Marqueur de cellules souches (hématopoïétiques, neurales…) •17 isoenzymes avec des substrats spécifiques •Fonction: oxydation des aldéhydes en acides carboxyliques •Rôles: détoxification (aldéhydes), métabolisme (acide rétinoïque) Aldefluor – LIPOPHILE Fluorescent DEAB Diethylamino-benzaldehyde Aminoacétate LIPOPHOBE Accumulation. Réactif pré-clinique / clinique (cellules sanguines). Marqueur de viabilité. UMR S974 (Co) expression de nombreuses isoenzymes Isoenzymes Localisation Expression Substrat ALDH1A1 Cytosol SKM Rétinaldéhyde ALDH1A2 Cytosol ? Rétinaldéhyde ALDH1A3 Cytosol SKM Rétinaldéhyde ALDH1B1 Mitochondrie SKM, Coeur Acétaldéhyde ALDH1L1 Cytosol ? Formyl-tétrahydrofolate ALDH2 Mitochondrie SKM, Coeur Acétaldehyde, 4-HNE ALDH3A1 Cytosol, noyau ? Aldéhydes aromat. aliphat. ALDH3A2 Microsomes SKM, Coeur Aldéhydes gras ALDH3B1 Cytosol ? ? ALDH4A1 Mitochondrie SKM, Coeur Semialdéhyde glutamique ALDH5A1 Mitochondrie SKM, Coeur Semialdéhyde succinique ALDH7A1 Cyt., Nucl., Mito. Coeur Aminoadipic semi-aldéhyde ALDH8A1 Cytosol ? Rétinaldéhyde ALDH9A1 Cytosol SKM, Coeur Aminobutyraldéhyde ALDH18A Mitochondrie ? Semi-aldéhyde glutamique UMR S974 Détection des populations de cellules ALDH+ Cellules de tissus hématopoïétiques Cellules de tissu musculaire squelettique humain 400 10 3 G2 10 2 0 G3 10 1 200 10 0 10 1 Neg control 3 10 2 10 = 10 4 (Aldefluor DEAB) ALDH CD34 APC 600 10 4 CD34 APC 800 G1 SSC-Height SSC-Height 1000 G3 G4 G4 ALDH 10 0 100 101 102 ALDH 103 104 ALDH+ : 1 - 4% de la population initiale (dépend des espèces, du tissu) 2 sous-populations : ALDH+/34- (25%) et ALDH+/34+ (75%) Vauchez et al., Mol Ther 2009 Les populations évoluent-elles avec l’âge ou la maladie? ALDH activity 20 2.0 * p=0,0056 15 1.0 0.5 0 0 0.0 M ol tr M on C C C on D ol tr M D tr on D 5 D 5 D 10 D 10 1.5 Cells (%) Cells (%) 15 ol Cells (%) 20 ALDH/CD34- cells ALDH/CD34+ cells * p=0,0042 Chez les patients DMD, les cellules ALDH sont augmentées TFL 41-70 a 25 % 75% Parav. control TFL > 71 a ALDH+/34- ALDH+/34- Parav. DMD ALDH+/34- ALDH+/34- 27 % 86% 73% 90% Chez l’Homme, la proportion de cellules ALDH/CD34- tend à diminuer avec l’âge ou la maladie UMR S974 Phénotype des cellules ALDH en culture ALDH+/34-SMALD/34-derived ALDH+/34+ cells § Cellules dérivées des ALDH+/34- # 100 % cellules positives § Non sorted derived cells (n=9) 80 # 60 ALDH+/34- derived cells (n=5) ALDH+/34+ derived cells (n=7) 40 Cellules dérivées des ALDH+/34+ Double negative derived cells (n=6) 20 0 CD 56 Vauchez et al., Mol Ther 2009 CD15 # : P≤0,05 : P<0,01 § : P<0,001 UMR S974 Différenciation in vitro à court terme ALDH+/34- ALDH+/34+ Control UMR S974 Capacités de différenciation des ALDH+ in vitro Différenciation Myogénique Différenciation Adipogénique Cellules dérivées des ALDH+/34- Cellules dérivées des ALDH+/34+ Cellules dérivées des ALDH+/34- : Cellules CD56+ cells avec capacité myogénique Cellules dérivées des ALDH+/34+ : Cellules CD56- hétérogènes avec capacité adipogénique UMR S974 Vauchez et al., Mol Ther 2009 Ratio [(ALDH+/34-) / ALDH+] x100 Le Ratio ALDH+/CD34- est-il un marqueur prédictif ? Ratio (%) Surtout 56+ Surtout 56- 10 15% 85% 20 26% 74% 25.5 50% 50% 30 72% 28% 40 99% 1% >40 100% 0% Des proportions élevées du ratio ALDH+/34- favorisent des rendements myogéniques plus élevés UMR S974 Potentiel In vivo: injection intramusculaire de cellules triées ALDH+/34+ en souris SCID Cox 2 Lamin A/C Laminin Irradiation 1 - Notexine 2 - Cellules Vauchez et al., Mol Ther 2009 Potentiel In vivo: injection intramusculaire de cellules triées ALDH+/34- en souris SCID Cox 2 Lamin A/C Laminin Potentiel In vivo: injection intramusculaire de cellules triées ALDH+/34- en souris SCID Dystrophin Lamin A/C Laminin Des cellules ALDH+/CD34- stimulées par des cytokines survivent et se différencient au sein du tissu cardiaque Connexin-43 Lamin A/C -Actinin Des ilôts de cellules exprimant les antigènes du donneur sont identifiés UMR S974 Des cellules ALDH+/CD34- stimulées par des cytokines survivent et se différencient au sein du tissu cardiaque Des cellules du donneur sont associées à des structures exprimant des marqueurs cardiaques UMR S974 Des projets multi-thématiques concernant les cellules ALDH+... CD34 APC Phénotypages Cytométrie, cytologie Différentes espèces Histologie Tissuthèques contrôles et pathologiques ALDH Développement in vitro Expansions Différenciations, inductions Agents pharmacologiques Comparaisons moléculaires ALDH+ CD133, CD146, péricytes, satellites, moelle, cordon… Transcriptome Différenciations musculaires squelettiques ou cardiaques in vivo Preuves de concept Modèles pathologiques Voies d’administrations directes ou systémiques UMR S974 Voies d’améliorations • Améliorer les voies d’administration – Nouveaux cathéters – Suivi des cellules (Imagerie, RMN…) • Améliorer la survie, la rétention, la distribution, la migration des cellules – Améliorer l’angiogénèse, réduire l’apoptose, réduire l’aneukoisis – Utiliser des matrices • Bio-ingéniérie – Préparer des « prothèses » tissulaires ex vivo • Les perspectives sont dans la progression actuelle… – La thérapie cellulaire à visée clinique a décuplé les recherches… UMR S974 Ingéniérie tissulaire cardiaque (réparation localisée) Limitations, problèmes: Fibrose cardiaque, inflammation Survie cellulaire, hypoxie, vascularisation, perfusion Vunjak-Novakovic et al., 2013 Le concept de feuillets cellulaires pour réparation locale Limitations: survie des cellules, intégration dans le myocarde, vascularisation. Hamdi et al., Cardiovasc. Res 2013 UMR S974 Association de cellules ES et d’un patch: essai clinique Quel type cellulaire, quelle manipulation idéale ? • Cellules: exigences • Manipulations génétiques – – – – Se multiplient in vitro – Chirurgie génique (Nucléases) Immuno-privilégiées – Réparation ARN (exon skipping) Délivrance systémique – Expression protéine (non mutées) Survivent, migrent, – Environnement (Fibrose…) prolifèrent sur site • Manipulations pharmacologiques – Se différencient en tissu – Chocs thermiques cardiaque – Facteurs de croissance (VEGF, – Reconstituent un pool de IGFs, bFGF…) cardiomyocytes – Anti-oxidants, losartan… – …? UMR S974 Karine Vauchez - Cyril Catelain - Stéphanie Riveron – Jessy Etienne - Erica Yada - AnneSophie Pellen – François Treuil - Ludovic Arandel – Yves Fromes – Bruno Pouzet – Julia Pouly - Marc Fiszman – Gisèle Bonne - Vincent Mouly - Gillian Butler-Browne Stéphane Vasseur - Maud Chapart Elodie Laffrat – Serban Morosan – Marjorie Lagrevol UMR S974 Myobank Jean-Pierre Marolleau, Jérôme Larghero & le laboratoire de thérapie cellulaire de Saint Louis Michel Schmid – Catherine Blanc - Alain Chapel Onnik Agbulut – Pierre Joanne – Solenne Boitard Philippe Menasché – Alain Hagège – Michel Desnos