Cours SL partie III

3. Biotechnologie de l’ADN
3.1. Technologie de l’ADN recombinant
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN
3.1.2. Fragmentation de l’ADN
(les Endonucléases)
3.1.3. Analyse d’ADN sur d’agarose et
d’acrylamide
3.1.4. Les vecteurs de clonage
3.1.5. La ligation
3.1.6. Transformations de bactéries
3.1.7. Techniques d’hybridation d’acides
nucléiques
3.2. Le séquencage
3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase
(PCR)

3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques
Propriétés importantes pour l’isolation et l’étude des acides nucléiques
Stabilité : Liaisons H = spécificité de l’appariement des bases
Interactions hydrophobes
Solubilité : insolubles dans le phénol, les solutions salines et alcalines
Précipités par l’alcool et les solutions acides fortes
En solution aqueuse, ils sont très acides
Viscosité : ADN long et mince donc solution très visqueuse
Densité : environ 1,7 g/cm
3
, isolation possible sur gradient de césium
Dénaturation : chimique par l’urée ou le formamide
thermique : ARN dénaturation progressive à la chaleur
ADN dénaturation à une température précise (Tm) dépendant du
contenu en G-C (propriété ayant permis la création de la PCR)

Propriétés importantes pour l’isolation et l’études des acides nucléiques
Absorption UV : Les bases absorbent dans l’UV avec un maximum
à 260 nm
Quantification : concentration déterminée par l’absorption à 260 nm
solution à 1mg/ml dans une cuve de 1 cm, A
260
=20
Pureté de l’ADN : utilisation du rapport A
260
/A
280
Si A
260
/A
280
> 1,8 contamination par ARN
Si A
260
/A
280
< 1,8 contamination par protéines
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques

-homogénéiser les cellules ou les tissus dans une solution de
Guanidinium-thiocyanate/Phénol + SDS + Proteinase K
-Ajout de chloroforme, mélanger vigoureusement
-après centrifugation, les débris cellulaires se trouvent au fond du
tube, les protéines dénaturées à l’interface, l’ADN et l’ARN dans
la phase aqueuse (supérieure) et les lipides en surface
-prélever la phase aqueuse et précipiter les acides nucléiques à
l’éthanol
Isolation d’ARN : faire une extraction à pH acide; après
centrifugation et séparation des phases seul l’ARN reste en phase
aqueuse, l’ADN est présent soit à l’interface, soit dans la phase
organique. Continuer comme décrit ci-dessus.
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN

La précipitation à l’éthanol
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
l’extraction Phénol/Chloroform