Cours SL partie III

3. Biotechnologie de l’ADN
3.1. Technologie de l’ADN recombinant
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN
3.1.2. Fragmentation de l’ADN
(les Endonucléases)
3.1.3. Analyse d’ADN sur d’agarose et
d’acrylamide
3.1.4. Les vecteurs de clonage
3.1.5. La ligation
3.1.6. Transformations de bactéries
3.1.7. Techniques d’hybridation d’acides
nucléiques
3.2. Le séquencage
3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase
(PCR)
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques
Propriétés importantes pour l’isolation et l’étude des acides nucléiques
Stabilité : Liaisons H = spécificité de l’appariement des bases
Interactions hydrophobes
Solubilité : insolubles dans le phénol, les solutions salines et alcalines
Précipités par l’alcool et les solutions acides fortes
En solution aqueuse, ils sont très acides
Viscosité : ADN long et mince donc solution très visqueuse
Densité : environ 1,7 g/cm3, isolation possible sur gradient de césium
Dénaturation : chimique par l’urée ou le formamide
thermique : ARN dénaturation progressive à la chaleur
ADN dénaturation à une température précise (Tm) dépendant du
contenu en G-C (propriété ayant permis la création de la PCR)
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques
Propriétés importantes pour l’isolation et l’études des acides nucléiques
Absorption UV : Les bases absorbent dans l’UV avec un maximum
à 260 nm
Quantification : concentration déterminée par l’absorption à 260 nm
solution à 1mg/ml dans une cuve de 1 cm, A260=20
Pureté de l’ADN : utilisation du rapport A260/A280
Si A260/A280 > 1,8 contamination par ARN
Si A260/A280 < 1,8 contamination par protéines
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN
-homogénéiser les cellules ou les tissus dans une solution de
Guanidinium-thiocyanate/Phénol + SDS + Proteinase K
-Ajout de chloroforme, mélanger vigoureusement
-après centrifugation, les débris cellulaires se trouvent au fond du
tube, les protéines dénaturées à l’interface, l’ADN et l’ARN dans
la phase aqueuse (supérieure) et les lipides en surface
-prélever la phase aqueuse et précipiter les acides nucléiques à
l’éthanol
Isolation d’ARN : faire une extraction à pH acide; après
centrifugation et séparation des phases seul l’ARN reste en phase
aqueuse, l’ADN est présent soit à l’interface, soit dans la phase
organique. Continuer comme décrit ci-dessus.
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
l’extraction Phénol/Chloroform
La précipitation à l’éthanol
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN :
Purification d’ARNm par chromatographie d’affinité sur oligo-dT
Colonne oligo-dT
ARNm purifié
3.1.1. Isolation d’ADN et d’ARN : Synthèse de l’ADNc
ADNc : molécule d’ADN transcrite
sur une molécule d’ARNm
+ oligonucléotide polyT
+ transcriptase inverse
+ dNTP
+ oligo (dT)
+ transcriptase inverse
+ RNase H
+ RNase H
+ ADN polymérase I
+ ADN polymérase
Copie d’ADN bicaténaire de l’ARNm original
3.1.2. Fragmentation de l’ADN :
Les nucléases de restriction de la classe III
- elles sont purifiées à partir des bactéries où leur rôle est de détruire
tout ADN étranger (d’un bactériophage ou d’un virus p.e.)
- elles reconnaissent une séquence spécifique de quatre à huit
nucléotides, appelée site de restriction
- elles hydrolysent les deux brins d’ADN
- elles sont des endonucléases, cad elles incisent dans le corps de la
molécule
- le génome de la bactérie est protégé du clivage par méthylation
- différentes souches bactériennes contiennent des systèmes de
restriction-modification différents
3.1.2. Fragmentation de l’ADN :
Séquence de reconnaissance de quatre enzymes de restriction
- une séquence palindromique :
production d’extrémités franches (HpaI)
- une coupure en zigzag cré des extrémités
cohésives
- 5’ sortant pour EcoRI ou HindIII
- 3’ sortant pour PstI
3.1.3. Analyse d’ADN : Principe de l’électrophorèse
http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/techgen/html/electro.htm
3.1.3. Analyse d’ADN :
Séparation des fragments d’ADN
Gel d’agarose
Gel d’acrylamide
_
_
Cathode
+
_
+
Séparation d’ADN bicatenaire
de 300-10 000 nt
+ Anode
Séparation d’ADN monocatenaire
de 10-500 nt
La distance parcourue dans le gel par une molécule est inversement proportionnelle au
logarithme de sa longueur.
3.1.3. Analyse d’ADN : Exemple d’électrophorèse
Expérience:
Etablissez une carte de restriction
Expérience:
Etablissez une carte de restriction
Conclusion:
3.1.4. Les vecteurs de clonage
Vecteur de clonage : élément
génétique capable d’autoréplication
site multiple de clonage, MCS
gène de
résistance à
l’antibiotique,
ampr
Vecteur
plasmidique
1,2-3,0 kb
origine de
réplication,
ORI