revue L`entrée du virus de l`hépatite C dans ses cellules cibles

revue
Virologie 2008, 12 (2) : 105-16
L’entrée du virus de l’hépatite C
dans ses cellules cibles
F. Helle
L. Cocquerel
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 24/05/2017.
Institut de biologie de Lille, CNRSUMR8161 Laboratoire Hépatite C,
1, rue Calmette,
BP 447,
59021 Lille
<[email protected]>
Résumé. Pour initier son cycle infectieux, une particule virale doit d’abord
traverser la membrane plasmique de la cellule hôte afin d’atteindre les composants cytosoliques et nucléaires nécessaires à sa réplication. Pour un virus
enveloppé, cela implique une liaison à la membrane plasmique suivie par une
migration du virion vers un microdomaine ou une vésicule d’endocytose où les
enveloppes virale et cellulaire vont fusionner. Le mécanisme exact par lequel le
virus de l’hépatite C (HCV) entre dans ses cellules cibles, les hépatocytes, reste
à élucider. Néanmoins, les données accumulées jusqu’à ce jour indiquent que le
mécanisme d’entrée du HCV est un processus lent et complexe faisant intervenir
plusieurs facteurs d’entrée. Dans une première étape, le virion s’attacherait à la
surface cellulaire par l’intermédiaire des glycosaminoglycanes et du récepteur
des lipoprotéines de faible densité. Cet événement serait ensuite suivi par une
série d’interactions avec le récepteur scavenger de classe B et de type I, la
tétraspanine CD81 et une protéine des jonctions serrées Claudine 1, 6 ou 9. Dans
cette revue, nous avons résumé l’essentiel des connaissances accumulées sur les
étapes d’entrée du HCV dans ses cellules cibles.
Mots clés : virus de l’hépatite C, entrée virale, glycoprotéines d’enveloppe,
facteur d’entrée, processus multiséquentiel
Abstract. To replicate its genome, a virus needs to cross the plasma membrane
of a host cell and get access to cytosolic and/or nuclear components. For an
enveloped virus, this involves binding to the plasma membrane, followed by
migration of the virion to a microdomain or an endosomal vesicle where fusion
between the virion envelope and a host cell membrane occurs. Although we are
still far from understanding the details of hepatitis C virus (HCV) entry, recent
data show that this virus enters into target cells in a slow and complex multistep
process involving the presence of several entry factors. Initial attachment of the
virion may involve glycosaminoglycans and the low-density lipoprotein receptor, and it is followed by the sequential interaction with the scavenger receptor
BI, the tetraspanin CD81 and the tight junction protein Claudin-1, -6 or -9. The
current knowledge accumulated on HCV entry is summarized in this review.
doi: 10.1684/vir.2008.0163
Key words: hepatitis C virus, virus entry, envelope glycoproteins, entry factor,
virus attachment, multistep process
L’interaction sélective des virus animaux avec leur(s)
récepteur(s) spécifique(s) présent(s) à la surface des cellules est une étape essentielle à l’initiation de leur cycle
Tirés à part : L. Cocquerel
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
infectieux. Une telle interaction détermine souvent le spectre d’hôtes et le tropisme cellulaire ou tissulaire du virus et
joue un rôle essentiel dans la pathogénicité du virus. Si le
virus ne peut se lier à la surface cellulaire, l’infection ne
peut alors être initiée. Une connaissance détaillée des mécanismes impliqués dans l’entrée d’un virus permet non
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seulement de comprendre comment ce virus infecte ses
cellules hôtes mais également d’entrevoir la possibilité de
développer de nouvelles drogues antivirales. Les mécanismes régulant l’entrée du virus de l’hépatite C (HCV) dans
ses cellules cibles, les hépatocytes, sont aujourd’hui encore
mal connus.
L’hépatite C est un problème majeur de santé publique.
Cette infection touche environ 130 millions de personnes à
travers le monde [1]. En France, on estime que 600 000 à
1 million de personnes seraient atteintes par cette maladie.
L’infection par le HCV est généralement chronique (60 à
80 % des cas) et les aspects cliniques peuvent se caractériser par un portage asymptomatique, une hépatite chronique
active et une cirrhose qui est fortement associée au développement d’un carcinome hépatocellulaire. À l’heure
A
actuelle, il n’existe aucun vaccin pour lutter contre le HCV
et les thérapies antivirales utilisées actuellement ont une
efficacité relativement limitée ([1]).
Le HCV est un petit virus enveloppé appartenant au genre
Hepacivirus de la famille des Flaviviridae [1]. Ce virus à
ARN de polarité positive est constitué d’une nucléocapside
entourée d’une enveloppe lipidique dans laquelle sont ancrées deux glycoprotéines d’enveloppe, E1 et E2 (figure 1).
Ces deux protéines forment des hétérodimères non covalents qui jouent un rôle majeur dans le mécanisme d’entrée
du HCV. Ces quinze dernières années ont été marquées par
l’absence d’un système de culture cellulaire permettant de
multiplier efficacement le HCV. Différents outils ont donc
été développés afin de pouvoir étudier l’entrée du HCV
dans ses cellules cibles. L’utilisation de tels outils a permis
Glycoprotéines
d'enveloppe
E1 et E2
ARN simple brin
de polarité positive
Enveloppe virale
Nucléocapside
B
C
E1
E2
E1
P
NS2
7
NS3
NS
NS4B
4A
NS5A
NS5B
E2
Figure 1. A. Représentation schématique d’une particule du HCV. L’enveloppe virale est composée d’une bicouche lipidique (en vert) dans
laquelle sont insérées les deux glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 (en jaune). Cette enveloppe renferme une nucléocapside (en bleu)
à l’intérieur de laquelle se trouve la molécule d’ARN simple brin de polarité positive (en beige). B. Le génome du HCV code une
polyprotéine unique qui, après maturation par des protéases cellulaires et virales, va libérer une dizaine de protéines dont les deux
glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2. Ces deux protéines présentent un large ectodomaine N-terminal hautement N-glycosylé et sont
ancrées dans les membranes par leurs domaines transmembranaires C-terminaux.
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Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
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de mettre en évidence des interactions avec un certain
nombre de protéines de surface cellulaire et a permis de
caractériser le rôle des glycoprotéines E1E2 dans l’entrée
virale. Le développement récent d’un système de production du HCV en culture cellulaire permet aujourd’hui de
confirmer les données obtenues jusqu’à présent. Dans cette
revue, nous avons résumé l’essentiel des connaissances
accumulées sur les étapes précoces du cycle infectieux du
HCV.
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Cycle infectieux du HCV
Un cycle viral du HCV, essentiellement basé sur le modèle
des Flavivirus d’autres membres de la famille des Flaviviridae, est représenté dans la figure 2 [2]. La première étape
correspond à la liaison des virus à la surface des cellules,
sur le(s) récepteur(s) spécifique(s). Le virus est alors endocyté par une voie dépendante de la clathrine. Ensuite, la
membrane virale fusionne avec la membrane des endosomes précoces de la cellule, conduisant à la libération de
l’ARN viral dans le cytoplasme. Le génome sert alors à la
synthèse du brin négatif qui permet la production d’ARN
brin positif. En parallèle, les protéines virales sont synthétisées sous forme d’une polyprotéine adressée dans le réticulum endoplasmique (RE). Finalement, les protéines de
structure vont s’assembler dans un compartiment encore
inconnu pour former de nouvelles particules virales qui
suivront la voie de sécrétion jusqu’à leur export hors de la
cellule.
Le passage d’un virus de l’extérieur vers l’intérieur de la
cellule est appelé entrée virale. Pour les virus enveloppés,
ce processus peut être divisé en plusieurs étapes : l’attachement du virus à la surface des cellules, l’interaction avec
le(s) récepteur(s) spécifique(s) du virus et finalement la
fusion de l’enveloppe lipidique virale avec une membrane
cellulaire (plasmique ou endosomale) permettant l’intro-
1
7
2
3
(+) RNA
6
4
5
Figure 2. Cycle viral du HCV basé sur le modèle des Flavivirus. (1) Le virus se lie à la surface des cellules sur leur(s) récepteur(s)
spécifique(s). (2) Le virus est ensuite endocyté par une voie dépendante de la clathrine. (3) L’enveloppe virale fusionne alors avec la
membrane des endosomes précoces, permettant la libération de l’ARN viral dans le cytoplasme. (4) Le génome sert à la synthèse des
protéines virales dans le réticulum endoplasmique (RE). (5) En parallèle, le génome du HCV sert à la synthèse de brins négatifs qui
serviront de matrice pour la synthèse de nouvelles molécules d’ARN de polarité positive. (6) Les protéines structurales servent à
l’assemblage de nouvelles particules qui suivront la voie de sécrétion jusqu’à leur export hors de la cellule (7).
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
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duction du génome viral dans le cytoplasme de la cellule
infectée. Ces étapes du cycle viral mettent en jeu deux
grands acteurs : les protéines d’enveloppe à la surface du
virus et les récepteurs et co-récepteurs à la surface des
cellules.
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Les glycoprotéines d’enveloppe du HCV
Les protéines d’enveloppe jouent un rôle prépondérant
dans l’entrée virale. En effet, en plus de permettre l’interaction avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s), ces protéines permettent d’induire la fusion entre les enveloppes virale et
cellulaire. Le génome du HCV code une polyprotéine d’environ 3 000 acides aminés qui est clivée de façon co- et
post-traductionnelle, par des protéases virales et cellulaires, pour produire une dizaine de protéines [1], dont les
deux glycoprotéines d’enveloppe, E1 et E2 (figure 1). Ces
deux protéines possèdent un large ectodomaine N-terminal
et sont ancrées dans les membranes par leurs domaines
transmembranaires (TM) C-terminaux [3]. Les ectodomaines de E1 et E2 sont hautement N-glycosylés, et cette
glycosylation semble jouer un rôle important dans le repliement des protéines, l’entrée virale et la protection contre
des anticorps neutralisants [4-6]. Durant leur synthèse, les
ectodomaines de E1 et E2 sont dirigés vers la lumière du RE
et leur domaine TM est inséré dans la membrane de ce
compartiment [3]. L’extrêmité C-terminale de la forme
immature de la protéine de capside (C) contient une séquence signal responsable de la translocation de l’ectodomaine de E1 dans la lumière du RE, et les domaines TM de
E1 et E2 contiennent également un signal permettant une
réinitiation de la translocation dans la lumière du RE. Les
domaines TM de E1 et E2 sont multifonctionnels car, en
plus de leur rôle d’ancrage membranaire et de séquence
signal, ces domaines contiennent des signaux de rétention
stricte dans le RE et jouent un rôle majeur dans l’hétérodimérisation de E1 et E2 [3]. Par ailleurs, la mutation de
certains résidus des domaines TM de E1 et E2 altère la
propriété de fusion des glycoprotéines d’enveloppe, suggérant que ces domaines jouent également un rôle majeur
dans le mécanisme de fusion [7]. Une étude récente de
Lavilette et al. a également permis d’identifier trois régions
de E1 et E2 impliquées dans le mécanisme de fusion [8].
Systèmes d’étude de l’entrée du HCV
En 1989, le génome du HCV a été cloné par Choo et al. [9].
Cela a permis une analyse rapide de son organisation génomique ainsi qu’une caractérisation biochimique de ses protéines. Néanmoins, jusqu’en 2005, aucun système de culture cellulaire permettant de produire de manière efficace le
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virus n’a pu être développé. L’absence d’un tel système a
donc constitué pendant plus de quinze ans un véritable
obstacle à l’étude du cycle réplicatif du HCV. Des particules issues de sérum de patients infectés ont été utilisées par
certains groupes pour étudier l’entrée du HCV. Néanmoins,
du fait de leur faible taux de réplication et de leur grande
hétérogénéité, ce type de particules n’a permis qu’une
exploration partielle du cycle infectieux du HCV. C’est
pourquoi d’autres outils ont été par la suite développés. Une
forme soluble de la glycoprotéine E2 a permis d’identifier
un certain nombre de protéines de surface cellulaire potentiellement impliquées dans l’entrée du HCV [10]. D’autres
laboratoires ont également utilisé des virus-like particles
(VLP) produites en cellules d’insectes ou des pseudoparticules recombinantes du virus de la stomatite vésiculaire
(VSV) [10-12]. Néanmoins, ces systèmes n’ont pas permis
d’étudier l’étape de fusion faisant intervenir les hétérodimères E1E2. En 2003, une avancée majeure dans l’étude de
l’entrée du HCV a été le développement de particules
rétrovirales pseudotypées avec les protéines d’enveloppe
du HCV (HCVpp) [13-15]. Ces pseudoparticules sont produites après transfection de cellules humaines 293T par
trois vecteurs d’expression : le premier exprime les glycoprotéines E1 et E2 natives, le deuxième exprime les protéines codées par les gènes gag et pol du virus de la leucémie
murine (matrice, capside, nucléocapside, protéase, reversetranscriptase, intégrase) et le troisième exprime un ARN
codant un gène rapporteur, qui sera intégré dans le génome
des cellules infectées (figure 3). Les HCVpp sont sécrétées
dans le milieu de culture cellulaire et permettent une bonne
transduction des cellules qui est dépendante de la présence
des protéines E1 et E2 à la surface de ces particules. Du fait
de leur tropisme préférentiel pour les cellules d’origine
hépatique et de leur neutralisation spécifique par des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine E2 ainsi que
par des sera de patients infectés, ces pseudotypes ont représenté pendant plusieurs années l’outil le plus proche des
particules natives du HCV. Toutefois, ces HCVpp ne reflètent pas complètement le virus produit chez les patients. En
particulier, contrairement au virus natif dont la production
semble liée à l’assemblage et à la sécrétion des lipoprotéines de très faible densité (VLDL, very low density lipoproteins) [16], les HCVpp sont supposées s’assembler indépendamment des VLDL. Par ailleurs, les HCVpp ne
contiennent pas de génome capable de se répliquer. Elles ne
permettent donc d’étudier que l’étape de l’entrée virale. En
2005, un clone du HCV isolé chez un patient japonais
atteint d’une hépatite fulminante a finalement permis le
développement d’un système de culture cellulaire permettant de produire efficacement des particules infectieuses du
HCV [17]. Ce système est basé sur la transfection d’une
lignée d’hépatocarcinome humain (Huh-7) avec des ARN
de la souche JFH1 (génotype 2a). Ce système permet de
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
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Plasmide 2
CMV
gag-pol
CMV
HCV-E1E2
Plasmide 1
CMV
LTR
Plasmide 3
luciférase
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PBS
LTR
PPT
Transfection de cellules 293T
Glycoprotéines
d'enveloppe du HCV
E1 et E2
Transcriptase inverse
Intégrase
Capside du MLV
ARN codant la
luciférase
HCVpp
Infection de cellules Huh-7
Quantification
de l'activité luciférase
Figure 3. Représentation schématique de la production des HCVpp. Pour la production des HCVpp, des cellules de rein embryonnaires
humaines 293T sont transfectées avec trois vecteurs d’expression. Le premier code les glycoprotéines E1 et E2 du HCV qui sont
responsables du tropisme cellulaire. Le second vecteur exprime les protéines codées par les gènes gag et pol du virus de la leucémie
murine (matrice, capside, nucléocapside, protéase, transcriptase inverse, intégrase). Les protéines de matrice, capside et nucléocapside
permettent l’encapsidation de l’ARN grâce au signal d’encapsidation (w), l’assemblage de la particule et son bourgeonnement à la
membrane plasmique. Finalement, le troisième vecteur code l’ARN qui va être encapsidé dans les particules. Cet ARN contient des
séquences rétrovirales nécessaires à la transcription inverse et à l’intégration de l’ADN proviral dans l’ADN génomique de la cellule
infectée (LTR, long terminal repeat ; PBS, primer binding site ; PPT, polypurine track) et contient un gène rapporteur codant la luciférase.
Les HCVpp sont sécrétées dans le surnageant de culture des cellules 293T et sont utilisées pour infecter des cellules d’hépatocarcinome
humain Huh-7. Les cellules infectées vont intégrer le gène codant la luciférase dans leur ADN génomique grâce à la transcriptase inverse
et à l’intégrase, et par conséquent, vont exprimer la luciférase. L’infectiosité des HCVpp pourra alors être évaluée par quantification de
l’activité luciférase dans les cellules Huh-7.
produire de manière relativement efficace du virus natif,
appelé HCVcc, capable de réinfecter des cellules naïves
[17-19]. Les cellules Huh-7 peuvent être infectées de façon
chronique, même si des événements d’adaptation du virus
et des cellules ont lieu afin de favoriser leur survie. Ces
particules permettent une infection productive chez le
chimpanzé et chez des souris transplantées avec des hépatocytes humains [20]. Depuis, des systèmes de culture
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
cellulaire permettant de produire des particules infectieuses
issues d’autres génotypes ont été décrits, mais l’efficacité
de ces systèmes de production est plus faible. Pour la
première fois depuis quinze ans, les différentes étapes du
cycle infectieux du HCV incluant l’entrée des particules
virales dans leurs cellules cibles, la réplication du génome
viral, l’assemblage et la sécrétion des particules néosynthétisées, peuvent maintenant être étudiées.
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Les protéines cellulaires impliquées
dans l’entrée du HCV
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Les glycosaminoglycanes
Les glycosaminoglycanes (GAG) présents à la surface des
cellules représentent un premier site de liaison pour de
nombreux virus, incluant les Flaviviridae. Il existe différents types de GAG : le chondroïtine sulfate, le dermatane
sulfate, le kératane sulfate, l’héparane sulfate et l’acide
hyaluronique. En utilisant différents systèmes d’étude (protéine E2 soluble, VLP, HCVpp, HCVcc, virus issu de
plasma), plusieurs auteurs ont montré que l’héparine, un
homologue des héparanes sulfates, et l’héparinase, capable
de dégrader les héparanes sulfates à la surface des cellules,
inhibaient l’adsorption du HCV [21-24]. Au contraire, les
autres GAG ne semblent pas avoir d’effet inhibiteur. Des
analyses en résonance plasmonique de surface montrent
que l’affinité de la protéine E2 soluble pour l’héparine est
très forte et qu’une région hypervariable dans E2, appelée
HVR1, joue un rôle important dans cette interaction. En
revanche, en utilisant des hétérodimères E1E2 issus de
HCVpp, aucune interaction avec les héparanes sulfates n’a
pu être mise en évidence. Par ailleurs, l’analyse de la
séquence de E2 ne permet pas de trouver de séquences
consensus impliquées dans l’interaction avec les GAG.
Ainsi, l’interaction de la protéine E2 avec les GAG n’est
pas clairement établie. La formation d’un site d’interaction
avec les GAG dans la structure tridimensionnelle des particules n’est pas exclue. Par ailleurs, il est possible que les
particules du HCV interagissent avec les GAG de façon
indirecte, par exemple, par l’intermédiaire des lipoprotéines associées aux particules du HCV. Une étude récente
suggère d’ailleurs que la lipoprotéine lipase (LPL) permet
une interaction indirecte du HCV avec les GAG [25]. Toutefois, l’attachement des particules virales via la LPL semble diriger les particules vers une voie non productive
puisque la LPL inhibe l’infection par les HCVcc.
Le récepteur des LDL
Du fait de l’association du HCV avec des lipoprotéines, le
récepteur des LDL (LDL-R) a été proposé comme un
récepteur potentiel de ce virus [26]. En effet, l’adsorption
du HCV et l’accumulation d’ARN viral dans les cellules
peuvent être inhibées par des anticorps dirigés contre le
LDL-R ainsi que par des LDL et VLDL purifiées [26-28].
De plus, Molina et al. ont montré qu’il existait une corrélation entre l’accumulation d’ARN viral dans les hépatocytes
primaires, l’expression de l’ARN messager du LDL-R et
l’entrée des LDL [28]. Finalement, l’inhibition de l’entrée
de HCVcc par des anticorps anti-apoE [29] est un autre
argument en faveur d’un rôle du LDL-R dans l’entrée du
HCV.
110
La protéine CD81
En utilisant une forme soluble de la protéine E2 pour
identifier des protéines cellulaires de surface impliquées
dans l’entrée du HCV, Pileri et al. ont identifié la protéine
CD81 [30]. C’est une protéine de 26 kDa appartenant à la
famille des tétraspanines. Les protéines de cette famille
contiennent quatre passages transmembranaires, un court
domaine intracellulaire et deux boucles extracellulaires
appelées « petite boucle extracellulaire » (SEL) et « grande
boucle extracellulaire » (LEL) (figure 4). La LEL présente
un motif particulièrement conservé constitué de trois résidus (CCG) impliqués dans la formation de ponts disulfures.
CD81 est une protéine impliquée dans un grand nombre de
fonctions cellulaires telles que l’adhésion, la morphologie,
l’activation ou encore la prolifération et la différentiation
[31]. De nombreuses études utilisant des HCVpp et des
HCVcc ont confirmé l’implication de CD81 dans l’entrée
du HCV [10]. En effet, des anticorps monoclonaux dirigés
contre CD81 ainsi qu’une forme soluble de la LEL de
CD81 sont capables d’inhiber l’entrée des HCVpp et des
HCVcc dans des cellules d’hépatocarcinome. Par ailleurs,
une réduction de l’expression de CD81 à l’aide d’ARN
interférents abolit l’infection par les HCVpp et les HCVcc.
Finalement, les cellules HepG2 qui n’expriment pas naturellement CD81 deviennent permissives à l’infection par
les HCVpp et les HCVcc après expression ectopique de
CD81. Plusieurs études montrent que la susceptibilité des
cellules à l’infection est étroitement liée au niveau d’expression de CD81 [32, 33]. CD81 issue de différentes
LEL
SEL
SR-BI
CD81
EL1
EL2
CLDN1
Figure 4. Représentation schématique de SR-BI, CD81 et
CLDN1. SR-BI est constitué de deux passages transmembranaires, deux domaines intracellulaires [de 11 et 45 acides aminés
(aa)] et une grande boucle extracellulaire (411 aa). SR-BI contient
neuf sites potentiels de glycosylation représentés en rouge. CD81
est constitué de quatre passages transmembranaires, deux domaines intracellulaires (chacun de 12 aa), une petite boucle intracellulaire (5 aa) et deux boucles extracellulaires SEL (« petite
boucle extracellulaire ») (30 aa) et LEL (« grande boucle extracellulaire » (89 aa). CLDN1 est constitué de quatre passages transmembranaires, un court peptide N-terminal intracellulaire (7 aa),
une boucle intracellulaire (13 aa), une queue intracellulaire
C-terminale (27 aa) et deux domaines extracellulaires, EL1 (53 aa)
et EL2 (27 aa).
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espèces et exprimée dans le contexte d’hépatocytes humains est capable de conférer de la permissivité au HCV à
des niveaux variables [34], suggérant que la tétraspanine
semble en partie responsable de la spécificité d’espèce du
HCV mais que des facteurs additionnels sont probablement
également nécessaires. Les résidus de CD81 impliqués
dans l’interaction avec la protéine d’enveloppe E2 du HCV
sont localisés dans la LEL. De même, une dizaine de
résidus de la protéine E2 semblent importants pour l’interaction E2-CD81 [35, 36]. Même si plusieurs études suggèrent que CD81 agit à une étape post-attachement [23,
37-40], le rôle exact de CD81 dans l’entrée du HCV n’est
pas encore complètement élucidé.
Le tropisme du HCV est restreint aux cellules hépatiques
humaines exprimant CD81. Toutefois, l’expression ectopique de CD81 dans des cellules non hépatiques ne rend pas
les cellules permissives à l’infection par les HCVpp, suggérant que d’autres molécules sont indispensables. De façon intéressante, les membres de la famille des tétraspanines sont capables de s’associer entre eux mais également
avec d’autres protéines appelées partenaires pour former
des complexes multimoléculaires appelés tetraspanin webs
[31]. L’interaction entre une tétraspanine et un partenaire
forme un complexe primaire. Deux partenaires majeurs de
CD81 ont été identifiés : EWI-F (aussi appelé CD9P-1,
FPRP ou CD315) et EWI-2 (aussi appelé PGRL, IgSF8 ou
CD316), tous les deux appartiennent à la famille des protéines EWI, une nouvelle famille de protéines à domaines
immunoglobuline (Ig). Les membres de cette famille
contiennent une courte queue cytoplasmique fortement
chargée, un domaine TM constitué d’un seul passage et un
ectodomaine composé de quatre domaines Ig portant un
motif EWI conservé. En étudiant si les interactions entre
CD81 et les hétérodimères E1E2 étaient similaires lorsque
CD81 est impliqué ou non dans un tetraspanin web ou dans
un complexe primaire, nous avons récemment identifié un
partenaire de CD81 capable de moduler l’entrée du HCV
[41]. Ce partenaire, appelé EWI-2wint (pour EWI-2 without its N-terminus) est un produit de clivage de EWI-2,
correspondant à EWI-2 sans son premier domaine Ig. EWI2wint est exprimé dans un grand nombre de lignées cellulaires mais est absent dans les hépatocytes. L’expression
ectopique d’EWI-2wint dans des cellules permissives à
l’infection par le HCV bloque l’entrée virale en inhibant
l’interaction des glycoprotéines d’enveloppe du HCV avec
la protéine CD81. Ainsi, ces données suggèrent que l’entrée
du HCV requiert la présence de CD81 mais aussi l’absence
de EWI-2wint. Ces résultats permettent d’émettre l’hypothèse que l’hépatotropisme du HCV ne serait pas lié uniquement à la présence de récepteurs spécifiques mais également à l’absence d’un inhibiteur spécifique au niveau des
hépatocytes [41].
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
La protéine SR-BI
En utilisant une forme soluble de la protéine E2 pour
identifier des protéines de surface impliquées dans l’entrée
du HCV, Scarselli et al. ont identifié le récepteur scavenger
de classe B et de type I (SR-BI, encore appelé Cla-I chez
l’homme) comme un autre récepteur potentiel du HCV
[42]. SR-BI est une protéine de surface de 509 acides
aminés, contenant deux courts domaines cytoplasmiques,
deux passages TMs et une large boucle extracellulaire
(figure 4). L’utilisation de HCVpp et de HCVcc a permis de
montrer que SR-BI est impliqué dans l’entrée du HCV [43].
En effet, la préincubation de cellules Huh-7 avec des anticorps anti-SR-BI réduit de manière significative l’infectiosité des particules. La réduction de l’expression de SR-BI
par des ARN interférents semble aussi diminuer l’infectiosité des HCVpp et des HCVcc. SR-BI est exprimé dans une
grande variété de cellules de mammifères, mais son expression est particulièrement importante dans le foie. SR-BI est
un récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDL)
acétylées et oxydées mais aussi des lipoprotéines de haute
densité (HDL) [44]. Il a été montré que les LDL oxydées
étaient capables d’inhiber l’infection par les HCVpp et les
HCVcc [45]. Au contraire, et de façon surprenante, les
HDL facilitent l’entrée des HCVpp de façon dépendante de
la capacité de transfert lipidique de SR-BI [43]. La région
HVR1 de la glycoprotéine E2 semble moduler l’interaction
de E2 avec SR-BI puisque la délétion de celle-ci abolit
l’interaction de E2s avec SR-BI ainsi que l’effet facilitateur
des HDL sur l’entrée du HCV [42, 46-48]. Récemment, il a
été mis en évidence que SR-BI pouvait interagir avec l’apolipoprotéine sérum amyloïde A (SAA) et l’internaliser.
SAA est une protéine produite principalement par le foie
après une infection, un dommage tissulaire ou une inflammation, ce qui suggère un rôle bénéfique de cette protéine
dans la protection de l’hôte. De façon intéressante SAA
inhibe l’entrée des HCVpp et des HCVcc [49, 50]. De façon
surprenante, l’analyse en système HCVpp a indiqué que
l’inhibition par SAA était due à une interaction avec les
particules virales et non à une compétition pour le récepteur
SR-BI. Par ailleurs, il a été montré que les HDL modulent
l’activité antivirale de SAA, probablement par une association des deux protéines, suggérant une action interconnectée de SAA et des HDL dans la modulation de l’infection
par le HCV.
En conclusion, le rôle exact de SR-BI dans l’entrée du HCV
reste à élucider. SR-BI est une protéine capable de modifier
la composition lipidique de la membrane plasmique. Ainsi,
il est possible que l’effet accélérateur sur l’entrée du HCV
soit la conséquence d’une modification de la membrane
plasmique facilitant ainsi une des étapes de l’entrée (par
exemple, la fusion). Alternativement, une étude récente
propose que le HCV pourrait interagir avec SR-BI par
l’intermédiaire des lipoprotéines [51], permettant ainsi un
111
revue
mécanisme d’entrée de substitution en présence d’anticorps neutralisants. Toutefois, une autre étude montre que
l’infection en l’absence de lipoprotéines peut être inhibée
par des anticorps monoclonaux anti-SR-BI [40], suggérant
une interaction directe entre les particules virales et SR-BI.
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Les protéines claudines
Très récemment, Evans et al. ont identifié une nouvelle
protéine impliquée dans l’entrée du HCV : claudine-1
(CLDN1) [39]. Cette protéine appartient à la famille des
claudines composée de 24 membres impliqués dans la formation des jonctions serrées [52]. Ces protéines sont constituées de deux boucles extracellulaires, trois domaines
intracellulaires et quatre passages transmembranaires (figure 4). Les claudines sont des protéines de petite taille
(entre 20 et 27 kDa) caractérisées par la présence d’un
motif W-GLWC-C hautement conservé dans la grande boucle extracellulaire. CLDN1 est exprimée principalement
dans le foie. En criblant une banque d’ADN complémentaire produite à partir de cellules permissives au HCV,
Evans et al. ont montré que l’expression de CLDN1 rend
des cellules non hépatiques 293T permissives à l’infection
par des HCVpp et des HCVcc [39]. Ainsi, CLDN1 est la
première protéine décrite qui permette de rendre des cellules non hépatiques permissives à l’infection par le HCV. La
réduction de l’expression de CLDN1 à l’aide d’ARN interférents entraîne une diminution de l’infection par les
HCVpp et les HCVcc, mais la surexpression de CLDN1,
dans des cellules exprimant cette protéine de façon endogène, n’augmente pas l’infectiosité. Des anticorps dirigés
contre un épitope inséré dans la première boucle extracellulaire de CLDN1 bloquent l’infection par le HCV de façon
dose-dépendante, suggérant que cette boucle est impliquée
dans l’entrée du HCV. De plus, des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de montrer que les résidus I32 et
E48 présents dans cette boucle sont essentiels à l’entrée du
HCV. Aucune interaction directe entre CLDN1 et le HCV
n’a été décrite, mais il n’est pas exclu que cette interaction
ait lieu après un changement conformationnel des protéines
d’enveloppe. Très récemment, il a été montré que deux
autres membres de la famille des claudines, CLDN6 et
CLDN9, sont également capables de rendre des cellules
non hépatiques permissives à l’infection par le HCV [53,
54]. Il est intéressant de noter que, contrairement à CLDN1,
CLDN6 et CLDN9 sont exprimées au niveau du foie mais
également au niveau des PBMC (peripheral blood mononuclear cells), suggérant que ces deux molécules pourraient être impliquées dans le mécanisme d’infection extrahépatique du HCV [54].
Le rôle exact des CLDN n’a pas encore été élucidé mais,
puisque ces protéines sont strictement localisées au niveau
des jonctions serrées dans les hépatocytes polarisés, les
112
CLDN pourraient agir après une migration latérale des
complexes virus-récepteurs au niveau des jonctions serrées.
L’endocytose
Les virus enveloppés entrent dans leurs cellules cibles selon
deux stratégies. Certains, comme de nombreux rétrovirus,
pénètrent dans le cytoplasme de la cellule hôte en fusionnant directement leur enveloppe avec la membrane plasmique. Ce processus est indépendant du pH et les changements de conformation des protéines d’enveloppe
nécessaires à la fusion sont induits par une interaction
directe des protéines d’enveloppe virales avec leurs récepteurs. D’autres virus enveloppés, comme le virus influenza
ou le virus de la stomatite vésiculaire, entrent dans leurs
cellules cibles par endocytose. Dans ce cas, le pH acide des
endosomes conduit à un changement conformationnel des
protéines d’enveloppe qui est nécessaire à la fusion. La
libération du génome viral dans le cytoplasme se fait alors
par fusion de l’enveloppe virale avec la membrane endosomale. L’utilisation d’inhibiteurs d’acidification des endosomes tels que la bafilomycine A1, la concanamycine A, le
chlorure d’ammonium ou encore la chloroquine, a permis
de montrer que l’entrée des HCVpp était dépendante du pH
[15, 55, 56]. Par la suite, en utilisant ces mêmes inhibiteurs,
il a été montré que l’entrée des HCVcc était également
dépendante du pH [23, 57, 58]. L’ensemble de ces résultats
suggère que le HCV entre dans ses cellules cibles par
endocytose. Par ailleurs, l’utilisation de molécules ou
d’ARN interférents ciblant la clathrine a permis de montrer
que le HCV entre dans ses cellules hôtes par endocytose
dépendante de la clathrine [56, 57]. Finalement, l’utilisation de mutants dominants négatifs de protéines impliquées
dans l’endocytose suggère que le virus fusionne avec les
endosomes précoces et non les endosomes tardifs [56].
La fusion
L’utilisation des différents systèmes d’infection (HCVpp et
HCVcc) a permis de montrer que le mécanisme de fusion
du HCV est dépendant du pH, suggérant que le pH acide
des endosomes entraîne un changement de conformation de
la protéine de fusion vers une conformation active [59]. La
fusion entre les HCVpp et des liposomes est aussi dépendante du pH, avec un seuil à 6,3 et un optimum à 5,5 [8].
Pour de nombreux virus enveloppés, un pH acide active un
changement conformationnel irréversible nécessaire à
l’événement de fusion entre les membranes virale et endosomale. De tels virus sont généralement inactivés par un
traitement physique à pH acide. Dans le cas du HCV, un tel
traitement n’a pas d’effet sur l’infectiosité des particules
[56, 58]. Le HCV adopte donc probablement une conforVirologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
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revue
mation sensible au pH acide après une (des) interaction(s)
avec son (ses) récepteur(s) ou co-récepteur(s) présent(s) à
la surface des cellules cibles. Le système de fusion entre les
HCVpp et des liposomes développé par Pécheur et al. a
également permis de montrer que la fusion est dépendante
de la température et ne nécessite pas la présence de protéines à la surface des liposomes, mais qu’elle peut être
facilitée par la présence de cholestérol. Finalement, ce
modèle de fusion du HCV a permis l’identification d’une
molécule capable d’inhiber cette étape de l’entrée du
HCV : l’arbidol [60]. Par ailleurs, le développement des
HCVpp a permis d’observer que la surexpression de E1E2
dans des cellules 293T conduisait à l’export d’une fraction
de ces protéines à la surface des cellules. Sur la base de ces
observations, Kobayashi et al. ont développé un test de
fusion cellule-cellule entre des cellules 293T surexprimant
E1E2 et des cellules Huh-7 qui sont permissives à l’infection. Ce système a permis de confirmer certains résultats
décrits ci-dessus [61].
Par homologie aux protéines de fusion de classe II, auxquelles la protéine de fusion du HCV est susceptible d’appartenir, il est probable que les hétérodimères E1E2 métastables se réorganisent pour former des trimères de protéines
de fusion thermodynamiquement très stables. En effet,
l’hétérodimère E1E2 des Alphavirus et les homodimères
EE des Flavivirus se dissocient pour former des trimères de
E1 et de E respectivement [62, 63]. Le réarrangement
oligomérique conduit alors à l’exposition du peptide de
fusion qui va s’insérer dans la membrane cellulaire. Cette
étape est nécessaire à la poursuite du changement conformationnel permettant le rapprochement entre le domaine
transmembranaire de la protéine de fusion et le peptide de
fusion. De façon intéressante, une étude récente montre que
la mutation de certains résidus des domaines transmembranaires de E1 et E2 altère la propriété de fusion de ces
glycoprotéines d’enveloppe [7]. Il est probable que ces
mutations empêchent les changements d’oligomérisation.
La fusion s’achève lorsque les lipides des membranes virale
et cellulaire se mélangent et forment un pore. À ce stade, les
protéines de fusion ont atteint leur conformation la plus
stable et la nucléocapside ou l’ARN est libéré(e) dans le
cytosol des cellules.
Conclusions
Le développement récent de différents modèles d’étude du
HCV a permis l’identification de plusieurs protéines cellulaires de surface impliquées dans l’entrée du HCV. Les
données actuelles mettent en évidence que l’entrée du HCV
est un processus complexe composé de plusieurs étapes
séquentielles. Par ailleurs, il semble que ce processus soit
assez long puisque des cinétiques d’inhibition suggèrent
que CLDN1 intervienne plus d’une heure après la fixation
Virologie, Vol. 12, n° 2, mars-avril 2008
du virus. La contribution exacte de chaque molécule impliquée dans l’entrée du HCV reste à déterminer, mais l’état
actuel des connaissances nous permet de proposer un modèle (figure 5). Les GAG et le LDL-R pourraient faciliter
l’attachement initial des particules virales sur les cellules,
par une interaction directe avec les protéines E1E2 ou par
l’intermédiaire des lipoprotéines (représentées par une
sphère jaune) associées aux particules virales. Après cette
étape initiale de liaison, la particule interagit probablement
avec SR-BI et CD81. Bien que la cinétique d’interaction
avec ces deux facteurs d’entrée n’ait pas encore été déterminée de manière univoque, les données actuelles suggèrent qu’un premier contact avec SR-BI soit un prérequis à
l’interaction de la particule avec CD81. L’interaction avec
SR-BI peut être directe ou indirecte par l’intermédiaire des
lipoprotéines associées. Il est à noter que ces étapes précoces de l’entrée du HCV peuvent être modulées par différentes molécules présentes dans le sérum des patients, qui
peuvent faciliter (HDL) ou inhiber (LDL oxydées, LPL et
SAA) l’entrée du HCV dans ses cellules cibles. CLDN1
agit à une étape tardive du processus d’entrée, après l’attachement, l’interaction avec CD81 et probablement après
une migration latérale des complexes virus-récepteurs
jusqu’aux jonctions serrées. Le HCV entre alors dans les
cellules par endocytose dépendante de la clathrine
jusqu’aux endosomes précoces où la fusion des membranes
se produit.
Il est important de noter que le processus d’entrée du HCV
est peut-être encore plus complexe qu’on ne le pense. En
effet, certaines cellules exprimant à la fois CD81, SR-BI et
CLDN restent résistantes à l’infection par le HCV, suggérant qu’un ou plusieurs facteurs d’entrée restent à identifier.
Dans le sens de cette observation, l’identification d’EWI2wint comme un nouveau partenaire de CD81 capable de
bloquer l’interaction E2-CD81 fournit une preuve supplémentaire de la complexité du processus d’entrée du HCV.
La découverte récente de CLDN comme facteur d’entrée
suggère que la polarisation cellulaire pourrait jouer également un rôle dans l’entrée virale. En effet, il a été récemment montré que les particules virales interagissent de
manière préférentielle avec la surface apicale de cellules
Caco-2 polarisées [64]. De plus, les jonctions serrées semblent bloquer physiquement l’accès des particules virales
aux facteurs cellulaires présents aux pôles latéral et basolatéral. Finalement, la possibilité d’une transmission de cellule à cellule a été évoquée ouvrant ainsi une voie supplémentaire à la propagation virale [65]. Néanmoins, le
mécanisme de transmission de cellule à cellule n’a pas
encore été caractérisé et l’importance de ce mode de transmission dans le foie n’a pas encore été déterminée.
En conclusion, bien qu’une progression rapide ait été récemment réalisée sur l’identification des facteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du HCV, le rôle précis de
113
revue
?
SAA
LPL/LDLox
SR-BI
CD8I
CLDN1
H+
Fusion
H+
Vé
ne
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LDL-R GAG
EWI-2wint
sic
th
ri
+ HDL
ule
recouverte de
cla
Endosome
précoce
Libération
du génome
Figure 5. Modèle de l’entrée du HCV dans ses cellules cibles. Les détails de ce modèle sont décrits dans le paragraphe conclusions.
chacune de ces molécules dans les étapes précoces du cycle
infectieux du HCV reste à déterminer.
Remerciements. Nous présentons nos excuses aux auteurs dont
le travail n’a pu être cité suite à des restrictions de taille de
document. Nous remercions Sophana Ung pour la réalisation des
différentes illustrations.
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