le virus d`egtved. i. - stabilité, développement et structure du

LE VIRUS D’EGTVED. I. - STABILIT´ E,
D´ EVELOPPEMENT ET STRUCTURE DU VIRUS DE
I,A SOUCHE DANOISE F1
P. De Kinkelin, R. Scherrer, Evelyne Bic, J. Cohen
To cite this version:
P. De Kinkelin, R. Scherrer, Evelyne Bic, J. Cohen. LE VIRUS D’EGTVED. I. - STABILIT´ E,
D´ EVELOPPEMENT ET STRUCTURE DU VIRUS DE I,A SOUCHE DANOISE F1. Annales
de Recherches V´et´erinaires, INRA Editions, 1970, 1 (1), pp.17-30. <hal-00900652>
HAL Id: hal-00900652
https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00900652
Submitted on 1 Jan 1970
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LE
VIRUS
D’EGTVED
1.
-
STABILITÉ,
DÉVELOPPEMENT
ET
STRUCTURE
DU
VIRUS
DE I,A
SOUCHE DANOISE
Fi
P. de KINKELIN R.
SCHERRER
d’Evelyne
BIC
J.
COHEN
Station
de
Vivologie
et
d’Immunologie,
78 -
Thivernal- Grignon
Institut national de la Recherche
agronomique
RÉSUMÉ
Cet
article définit
les
propriétés
in vitro de stabilité
et de croissance d’une souche de virus
d’Egtved
(souche
danoise
F,), agent
de la
Septicémie Hémorragique
Virale de la truite Arc-en-ciel.
Parallèlement une
étude en
microscopie électronique,
effectuée au
cours de certains
cycles
du
développement
viral,
apporte
des données
complémentaires
sur la structure du virus
et une con-
tribution à sa
classification. Le but ultérieur
de ces recherches est de relier
le
pouvoir pathogène
du virus
d’Egtved
à des
propriétés
in
vitvo,
l’expérience
ayant
démontré
que
la souche
employée
ici avait
perdu
son
pouvoir pathogène.
INTRODUCTION
Le
virus
d’Egtved, agent
de la
Septicémie Hémorragique
Virale
(S.
H.
V.)
de
la
truite
Arc-en-Ciel,
a été isolé
pour
la
première
fois
en
culture cellulaire
par
JE rrsEx
au
Danemark
(J ENS EN,
I g6 3 ).
Quand
sa
morphologie
fut établie
(Z WIUENBERG
et
al.,
19 65 ),
il
apparut que
ce
virus
avait
une étroite
ressemblance avec ceux
de la
Rage
(M AT SUMOTO , I g6 2 ),
de la
Stomatite
Vésiculeuse
(HownTSOrr
et
WHrT!oR!,
ig62),
avec le virus
Sigma
de la
Drosophile
(B>;xKnr,o>!>!
et
al,,
19 65)
et celui d’une
nécrose
de la laitue
(H ARRISSON ,
19 65)
et
plus
récemment avec le
virus
de
P-Tarburg
(K ISSLING
et
al.,
I9 68).
_
Devant
l’importance économique
croissante de la
Septicémie Hémorragique
en
salmoniculture,
les recherches effectuées ont été surtout orientées vers le dia-
gnostic
de la maladie et les méthodes
à
appliquer pour
limiter son extension. Aussi
existe-t-il une abondante
bibliographie
sur ce
sujet
(G HITTINO , I g68),
mais
on ne
trouve
que
très
peu
de
travaux
sur le virus
lui-même.

K.
Worr>!
( 19 66)
avait
publié
un début d’étude de la croissance et de la stabilité
du virus et P.
E.
V EST ERG ARD -JOR GE:’< SEN
(r 96g)
avait
commencé son
étude
sérolo-
gique
dans
le but de le différencier
du
virus
de
la Nécrose
Pancréatique,
autre virose
des salmonidés.
Plus
récemment,
la nature
de
l’acide
nucléique
du virus
(A.
R.
N.)
a été
démontrée
par
C AMPBELI ,
et
BV OI, F
(I g(¡g).
Il nous est donc
apparu
nécessaire de définir certains caractères io2
vitro
d’une
souche
de virus
d’Egtved
dans le
but ultérieur de
comprendre
la
pathogénie
de
la
maladie
et
de
préciser
les
rôles
respectifs
de l’hôte et
de son virus dans
l’apparition
de la
Septicémie Hémorragique.
Or,
pour qu’un
virus
provoque
une
maladie,
il
faut
qu’il
se
multiplie
chez
son
hôte
et
qu’il
résiste ensuite
aux facteurs d’inactivation du milieu
intérieur
de l’hôte
et
du milieu extérieur
pour
assurer
la
transmission. C’est donc vers la stabilité et la
croissance
du virus
à
différentes
températures que
nous avons
orienté
nos
recherches
en nous souvenant
que l’apparition
de la
Septicémie Hémorragique
est
étroitement
liée
à
la
température.
Parallèlement nous avons
associé
à
certaines
de nos
expériences
sur
la croissance
virale une étude en
microscopie électronique
en vue
d’étendre
nos
connaissances
sur
la
morphogenèse
et la structure
des
particules.
MATERIEL
ET
TECHNIQUES
I. Cellules
Deux
lignées
cellulaires de
poisson
ont été
employées :
-la
lignée
l2a irz b ow Trout Gorzad
ou R.
T.
G.
2
(Won.-,
I q6 2)
et la Fat Head JB1innow oU F. H.
M.
(G R :&dquo;iELL et 31,XLSBERGER,
19 65)
La
R. T. G. 2
provient
du
I licrobiological
Associates
et la F. H. Vl. nous a été donnée
par
Iï. WoLF dc l’liastcr ll
FisTa Diseascs
labovatovy.
Les deux
lignées
sont
produites
dans du milieu de
l:agle,
tamponné
Tris à
un pH
de
7,4
et
contenant
par
millilitre : 100 unités de
pénicilline,
ioo
microgrammcs
de
streptomycine,
So
mi-
crogrammcs
de
kanamycine
et
So
unités
de
m5!costatine.
Du
sérum de veau
( 10 p. 100 )
a été
pro-
gressivement
substitué à la même
proportion
de sérum f&oelig;tal en diminuant ainsi de
façon
appré-
ciable
le
prix
de revient du milicu.
Les cellules sont
cultivées en bouteilles de Houx d’un litre
placées
à
l4oC pour
les
R.
’J’. G.
2
et à
29 0C
pour
les F. H. :B1. Ces
deux
lignées
se
congèlent
facilement
et se conservent en
ampoules
dans l’azote
liquide.
2.
Virus
_
La souche
danoise
F, (Jr.!sr.v, Iq <,_1) ,
à son
T_ 5 ..
passage
en
culture cellulaire 12.
T.
G. 2,
nous
a
été fournie
par
P. 7!:.
B,Esll,-IZ(iAAI!r)7jOlZ(-!UNSII-N.
Nous avons utilisé ce virus
pour
nos
expériences
après
ig
passages supplémentaires
sur cellules K. !1’. (!. 2 et 1’ ’. H. AI.
Les
stocks
de virus ont été
produits
sur
ces cultures
confluentes,
âgées
de
2 à
5
jours,
incu-
bées à
14 °
dans des
bouteilles de Roux contenant
40
millilitres de milieu de
hagle tamponné
Tris à,
pH 6,!,
additionné de 2
p.
ioo
de sérum de veau. Du milieu de Earle à
o, 5
p.
ioo
d’hydrolysat
de lactalbumine
et
tamponné
dans les mcmes conditions a
également
servi à titre
de
comparaison.
Le virus est récolté
par
deux
opérations
successives de
congélation (&mdash;
35« C)
et de
décongé-
lation à la
température
ordinaire,
trois
jours après
l’inoculation des
cellules
qui présentent
un
effet
cytopathogène
intense. La
suspension
est alors
centrifugée
pendant
10 minutes à
4 ooo/t
mn,
à
-)-
4 °C,
dans une
centrifugeuse
AI.
S. J.1.
(H.
S.
W ).
-
Le virus contenu dans le
surnageant peut
ensuite être concentré
par
une
centrifugation
de
deux heures à
i8 00 o
t/mn ( 40
00 o
g)
à
.1-
4!’C
dans
la même
centrifugeuse,
en
reprenant
les culots
dans du
milieu
de
I!a;!le
2
p.
100
représentant z/ro
ou moins du volume initial.

3.
Titrage
du virus
(fig. i)
Le virus
est
titré
par
la méthode des
plages
selon une
technique
décrite
par
(’AM i’ BELL et
W OLF
(io0c»
mais.
que
nous avons
légèrement
modifiée. Des boîtes
de
Pétri Falcon de
35
X
10 milli-
mètres
(surface
8
cm z ),
contenant une culture
conflucnte
de cellules F.
H.
3i. de
24
heures,
soit
3
millions de cellules dans
T , 5
ml de
milieu,
sont infectées avec
o, 2
ml
d’une
dilution de
virus à
raison de
quatre
ou
cinq
boîtes
par
dilution.
Après
une
heure
d’adsorption
à une
température
de
il
à
2 o(,(’,,
pendant laquelle
les
boîtes
sont
agitées cinq
ou
six
fois,
du milieu de
Eag)e
à
2
p.
100 de sérum et
0,5 p.
T oo
d’agarose,
tam-
ponné
Tris
à un
pH
de
!,6
est coulé sur
les
cellules à une
température
de
300 C
à raison de
1,
milli-
litre
par
Voîte. Au bout de deux
jours
et demi à trois
jours,
i millilitre de
rouge
neutre
à
o,0 5
p.
100
en
solution de
Garle,
a
o,s
p.
100
d’agarose,
est coulé
sur lit
première
couche de
milieu 4 heures
avant la lecture. Le troisième
jour
le diamètre
des
plages
est
de l’ordre
d’un millimètre.
Cycle
de
dévc!op p emcnt
dit virils
Des boîtes
Falcon
de
go
ml
contenant,
les
unes
1,3 .
10 &dquo; cellules R. T. G.
2,
les autres
!,9
10.
cellules F. H.
-NI.,
sont
respectivement
infectées avec 6 et
2
unités formant
des
places
(I’.
F.
P.)
de
virus 1!
par
cellule.
Après
une
heure
d’adsorption
et un
triple
lavage
avec
du
milieu
de
Kagle
contenant 2
p.
oo de sérum de
veau,
les ’boites
sont
incubées à
14&dquo;(’
en
présence
de mi
de milieu.
Des
flacons sont
prélevés
à différents moments
aprèsl’infection
et titrés
après
avoir été
congelés
et
décongelés
deux fois.
’
En
outre,
des
expériences
de
croissance
virale en
cycle unique
ont
été faites
à
différentes
températures
allant de
+
6<’
à ;
24°C
en modifiant la
multiplicité
d’infection ainsi
que
le nombre
de cellules.
5. XI icroscoPic élatroniquf
Des cultures de cellules K.
T,
(G.
2,
infectées
en
cycle unique,
sont fixées avec la
glutaraldé-
hy<le
à
1 ,6
p.
roo dans du
tampon
de S ’01 ’enscn à
p1I 7,2, pendant
3o
minutes à
-1-
4!C..!près
une
post-fixation
au
tétroxyde
d’osmium
à 2
p.
100
pendant
une
heure,
les
cellules
sont
déshy-
dratées à l’alcool et incluses dans
l’Épon.
Des
coupes
ultrafines sont effectuées à l’aide d’un
ul-
trotomc L.
K. 13.
Il
colorées
avec l’acétate
d’uranyl
et le citrate de
plomb, puis
examinées dans
un
microscope électronique l’hilips
E.
!1.
300
à 80 liv et 60 Lc.

RÉSULTATS
I. Stabilité du virus
LI .
Congélation-Décongélation.
Une
suspension
virale en milieu de
I;agle
contenant 2
p.
roo de sérum
et
exempte
de débris cellulaires est
répartie
en
quatre
tubes
qui
subissent
respectivement
de
une à
quatre
opérations
de
congélation-décongélation
en
24
heures.
Les
titrages
indiquent que
le virus
supporte
ce
traitement sans
diminution
significative
de
son
pouvoir
infectieux,
comme
le montre le tableau
ci-dessous :
1.2.
Lyophilisation.
La
suspension
virale est
lyophilisée,
à
raison de
30
ml contenant 20
p.
IOO
de
sérum de
veau,
dans des ballons de
250
ml. Des essais
d’infection,
effectués
après
une
semaine,
provoquent
un effet
cytopathogène
accentué au bout de
trois
jours
pour
un
inoculum
de io ml
par
bouteille de
Roux.
1. 3.
Thermosevcsibilité.
Des dilutions de virus
produisant
roo à
r5o
plages
par
0,2
ml à
14 0C
sont
placées
pendant 15
minutes dans des bains-marie à
14 0 C, 24 °C, 27°C, 3 o°C, 3 3°C
et
34 °C.
Les
tubes servant à la dilution finale
(0,2 - I o- 4) ont
été
préablablement
portés
aux
températures
voulues avant
l’introduction
du
virus.
Un
fin
d’expérience,
les
tubes sont
placés
dans
la
glace
fondante et l’on
procède
au
titrage
du virus.
On constate
(fig.
2) qu’après
15
minutes
à
30°, 50
p.
ioo
de
l’infectiosité ont
disparu.
1.4.
Inactivation
par
L’eau
de
pisciculture .
Une
suspension
virale titrant environ
10 ’
U. F. P.
par
0,2
ml est
préalablement
diluée à IO -1 dans
de l’eau de
pisciculture
centrifugée,
filtrée sur
membrane Milli-
pore
G.
S.
(0, 22
microns)
et V. M.
(o,o 5 microns)
et maintenue à
14 °C.
Des
prélè-
vements effectués
aux
temps
o,
4
h
30 ,
q
heures et
24
heures
sont titrés.
On voit alors
que
le
virus
perd
dans ces conditions
go p.
IOO
de son
titre
initial
en
24
heures.