La cellule - Les pages perso du Crans

Cours # 3 : La cellule Plan: Introduc4on : intérêt de la mécanique cellulaire I. Architecture de la cellule II. Mesure mécanique sur des cellules vivantes TD # 3: Instabilité dynamique des microtubules [email protected] Introduc4on – La cellules est un objet dynamique Pour pouvoir se défendre contre les agressions, pour pouvoir se déplacer, se contracter, se diviser, les cellules doivent exercer des forces. ⇒  la cellule est un objet dynamique Forces -‐  Migra4on -‐  Division -‐  Cicatrisa4on Introduc4on – La cellules est un objet dynamique Pour pouvoir se défendre contre les agressions, pour pouvoir se déplacer, se contracter, se diviser, les cellules doivent exercer des forces. ⇒  la cellule est un objet dynamique Forces, Contraintes Forces -‐  Migra4on -‐  Division -‐  Cicatrisa4on ⇒  Nécessité d’étudier la mécanique cellulaire + eﬀet de l’environnement mécanique 1. Comment la cellule exerce et ressent les forces ? 2. Comment mesurer les forces exercées par des cellules ? Par4e I – Architecture de la cellule La cellule eucaryote I-‐A. Le cytosqueleCe Un modèle classique de la cellule eucaryote Membrane élas4que Cytoplasme pseudo-‐liquide ou solide viscoélas4que Noyau solide … mais dépassé ! Toutes les cellules eucaryotes possèdent un cytosqueleQe Cytoplasme Noyau Le cytosqueleQe, squeleQe interne de la cellule I-‐A. Le cytosqueleCe Ensemble organisé de polymères biologiques qui confèrent l'essen4el des propriétés mécaniques de la cellule : -‐ 3 réseaux de polymères (ac4ne, ﬁlaments intermédiaires et microtubule) -‐ protéines ré4culantes -‐ moteurs moléculaires Rôles : -‐ main4en architecture de la cellule -‐ dynamique (transport intra-‐cellulaire et mobilité cellulaire) Extrêmement dynamique Les microﬁlaments I-‐A1. Microﬁlaments d’acFne Structure : •  Monomère = ac4ne G (42 kDa, 375 AA) •  Ac4ne ∼ 20 % de la masse totale des protéines •  Deux chaines enroulées en hélice •  Fibres de diamètre ~ 5-‐9 nm, 2 à 3 µm de long •  Longueur de persistance Lp ~ 10-‐15 µm noyau acFneu Marquage ﬂuorescent de l’acFne, cellule épitheliale humaine (U2OS). Barre = 10 µm Les microﬁlaments Assemblage: -‐ Spontanée in vitro -‐  Ajout de monomère aux deux extrémités -‐  Polymère polarisé : dynamique de croissance des deux extrémités diﬀérente -‐  A l’équilibre, ﬁlament de taille constante Equilibre dynamique: -‐ Les monomères d’ac4ne lient l’ATP -‐ L’ATP peut être hydrolysé de façon aléatoire, ce qui entraine une dépolymérisa4on In vivo : Cc(-‐) > [ac4ne] > Cc (+) Polymérisa4on bout (+), dépolymérisa4on bout (-‐) Les microﬁlaments Implica4on de l’ac4ne dans les processus biologiques : -‐ ﬁbres de tension -‐ contrac4on, étranglement lors de la division cellulaire -‐ migra4on, repta4on -‐ ceintures élas4ques des cellules épithéliales -‐ unité de contrac4on des muscles striés 10 µm FibronecFon F-‐acFn Cellule RPE (ReFnal pigment epithelial), Théry M et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 63, 2006 F-‐acFn Chick heart ﬁbroblasts, Mseka et Cramer, Curr Biol, 21, 2011 Les ﬁlaments intermédiaires noyau IFu I-‐A2. Filaments intermédiaires (IF) •  Filaments les plus stables du CS •  Fibres de diamètre ~ 8-‐12 nm •  Grande hétérogénéité (fonc4on du type cellulaire) •  Monomères ﬁbreux •  Non polarisés •  Longueur de persistance Lp ~ µm Marquage ﬂuorescent des IF, cellule épithéliale humaine (A431), Bar = 10 µm Quelques exemples : Fibre LocalisaFon Rôle Lamine Nucléaire, ∀types de cellule Architecture du noyau Vimen4ne Fibroblastes Ancrage des organites Kéra4ne Cellules épithéliales Résistance et imperméabilité Neuroﬁlaments Cellules nerveuses Armature axones Les microtubules I-‐A3. Les microtubules (MT) noyau MTu Structure: •  Tube creux rec4ligne d’un diamètre de ~ 25 nm Marquage ﬂuorescent de la tubuline, cellule épithéliale humaine (U2OS), Bar = 10 µm •  Monomères = tubuline α et β (protéine globulaire, 55 kDa) •  Formés de 13 proto-‐ﬁlaments disposés en couronne •  Longueur de persistance Lp ~ 1 mm : les plus rigides Les microtubules Propriétés dynamiques des microtubules (cf TD #3) -‐ Polymère polarisé : extrémité (+) pointe vers la membrane, l’extrémité (-‐) vers le centrosome -‐ Dynamique de polymérisa4on diﬀérente en fonc4on de l’extrémité. -‐ Hydrolyse rapide du GTP associé à la tubuline en GDP après polymérisa4on ⇒ instabilité dynamique: les microtubules alternent entre élonga4on et raccourcissement rapides Les microtubules acFn MTu Implica4on des microtubules dans les processus biologiques : -‐  organisa4on intracellulaire -‐  transport vésiculaire intracellulaire -‐  ségréga4on chromosomique -‐  ﬂexion des cils Marquage ﬂuorescent de l’α-‐tubulin (vert) et de l’acFn (rouge) d’un neurone de Xénope, Henley and Poo, Trends in Cell Biology, 2004 Marquage ﬂuorescent de l’α-‐tubuline au cours de la division d’une cellule épithéliale de rat-‐kangourou, Fmer en min. Rieder and Khodjakov, Science, 300, 2003. Rq: les MTs sont les principales cibles de la thérapie an4-‐cancéreuse MT 10 µm Biﬂagellated alga Chlamydomonas Reinhard=i Les protéines du cytosqueleQe I-‐A4. Les protéines associées au cytosqueleCe -‐ protéines ré4culantes associant les ﬁlaments en réseau structuré et interconnecté -‐  protéines nécessaires à la polymérisa4on / dépolymérisa4on -‐  confère les propriétés mécaniques du cytosqueleQe -‐  exemples: Ac4ne : Arp2/3, ﬁlamine, …. MT: Microtubule Assocaited Protein (MAP) I-‐A5. Les protéines motrices Energie Chimique Hydrolyse de l’ATP ∼ 20 kT Moteurs Moléculaires Force Motrice Déplacement cellulaire Transport intracellulaire Réplica4on Transcrip4on … -‐ moteur sur les acides nucléiques : enzymes (polymérase, hélicase,…) -‐ moteur moléculaires sur les ﬁlaments du cytosqueleQe -‐ moteur dans les membranes : pompe ionique, moteur rota4onnel Les moteurs moléculaires Moteur du cytosqueleQes: linéaires -‐  Une tête qui interagit avec le ﬁlament et ﬁxe ATP/GTP -‐  Une queue qui s’associe à l’objet à transporter -‐  La polarité des ﬁlaments donne la direc4on -‐  Ac4on concertée ou individuelle -‐  Vitesse: nm/s à µm/s -‐ Processivité: 160 pas -‐  Se déplace par une marche aléatoire sur la surface d’énergie libre, l’agita4on thermique les faisant passer d’une vallée à l’autre, emmagasine énergie poten4elle -‐  Ac4ne : myosine pour le mouvement contrac4le / Microtubule: dynéine, kinésine pour le transport Le cytosqueleQe au centre de la fonc4on cellulaire I-‐B. Rôle du cytosqueleCe Mobilité cellulaire Forme cellulaire Structurel PolarisaFon Dynamique CytosqueleCe Métabolique Transport Intracellulaire Biologique RégulaFon cycle et division cellulaire Mécano-‐ transducFon Le cytosqueleQe au centre de la fonc4on cellulaire I-‐C1. Mécano-‐transducFon au niveau de la cellule Interac4ons CSQ – microenvironnement cellulaire au niveau des sites d’adhésion Cellule focal adhesion acFn acto-‐myosin Adhésion Focale Adhésion Focale Adhésion Focale Integrin Integrin Integrin Sedwick C. JCB 2012;196:4-‐5 Contraintes mécaniques Contraintes mécaniques Forces développées par moteur moléculaires: 1,5 pN Force de poussée de la polymérisa4on : 10 pN Le cytosqueleQe au centre de la fonc4on cellulaire I-‐C2. L’exemple de la migraFon sur un support 2D 1.  FormaFon de ﬁlopodes au niveau du bord avant, dus à la polymérisa4on de l’ac4ne. 2.  Adhésion : forma4on de nouveau contacts focaux (liens substrat – ﬁlaments d’ac4ne) 3.  TranslocaFon: mises en jeu de la contrac4on acto-‐myosine 4.  RétracFon avec dispari4on des points d’adhésion à l’arrière. Par4e II – Mesures mécaniques sur des cellules vivantes No4on de mécanique des milieux con4nus II-‐A. NoFon de mécanique des milieux conFnus Rhéologie : Par4e de la mécanique qui étudie la plas4cité / l’élas4cité / la viscosité des matériaux déformables dF
σ
=
On déﬁnit la contrainte (Pascal) et la déformaFon ε
dS
⎛ σ xx σ xy σ xz ⎞
⎜
⎟
Généralement, il s’agit de tenseurs de dimension 3: σ = ⎜ σ yx σ yy σ yz ⎟
⎜ σ
⎟
σ
σ
zx
zy
zz
⎝
⎠
Ce que l’on cherche à mesurer, c’est la rela4on contrainte / déforma4on Solide Liquide σ
Visco-‐élasFque σ
t
σ (t ) = ∫ G * (t − t ' )ε (t ' )dt '
Plas-c Fracture Elas-que −∞
Visqueux ε
ε
G * = G '+iG ' '
Elas-que Visqueux Mesures des propriétés mécaniques II-‐B. Méthodes de mesures des propriétés mécaniques •  A l’échelle de la cellule: é-rement uniaxial et aspira-on par micropipe8e •  Sonde extracellulaire: AFM, billes magné-ques ou diélectriques Méthodes ac4ves •  Sonde intracellulaire: par-cules magné-ques ou traceurs Méthodes passives En plus de la réponse mécanique, on peut aussi étudier: -‐ la réponse structurale (cytosqueleQe) -‐ la réponse biochimique (protéines, gènes) Bao & Suresh, Nat Materials, 2, 2003 Mesures des propriétés mécaniques II-‐B1. EFrement uniaxial Levier ﬂexible (“ressort” de raideur k) Cellule Microplaque rigide Thoumine et OC, J Cell Sci 110, 1997 Desprat et al, Rev Sci Instrum 77, 2006 5 mm
Plaque é4rée Capillaire rigide Mesures des propriétés mécaniques II-‐B1. EFrement uniaxial Levier ﬂexible (“ressort” de raideur k) Déﬂexion δ L(t) Déplacement D Force F (t ) = kδ
Thoumine et OC, J Cell Sci 110, 1997 Desprat et al, Rev Sci Instrum 77, 2006 Contrainte σ (t ) =
F (t )
S
Déforma4on ε (t ) =
L(t) − L(0)
L(0)
Expériences de ﬂuage contrainte imposée constante ⇒ mesure de la déforma4on Contrainte oscillante ⇒ mesure du module visco-‐élas4que Mesures des propriétés mécaniques II-‐B2. AspiraFon par micropipeCe Contrôle de la tension, donc de la force de déforma4on Relaxa4on donne une mesure de la viscoélas4cité Mesure des forces d’adhésion possible Aspira4on ΔP 2RP Variante : Biomembrane Force Probe Mesure des forces de rupture de liaison unique On u4lise un globule rouge comme dynamomètre pour mesurer ceQe force f = k RBC Δx
Evans, 1998 Mesures des propriétés mécaniques II-‐B3. Sondes locales extracellulaires AFM 10 pN < F Laser Photodétecteur Can4lever Pinces magné4ques Génère un couple sur une bille magné4que ⇒ mesure de la viscoélas4cité F=10 pN Pinces Op4ques (cf. Cours # 1) δF = 0.5 pN → 100 pN Cellule Tip Mesures des propriétés mécaniques Fluorecent beads II-‐C. Mesure des forces exercées par les cellules •  Trac4on force microscopy ( TFM) cellule sur substrat déformable: billes dans un gel ⇒  carte des déforma4ons puis carte des contraintes •  Micro-‐pilliers plots de PDMS, élas4que, déformable ⇒ carte des déforma4ons puis carte des forces f = k Δx
•  Abla4on laser k=
3EI
L3
I cyl =
πr 4
4
TracFon stress 20 µm Displacement ﬁeld Munevar et al., Biophys J, 80, 2001 Stress Manipes de rhéologie cellulaire en région parisienne !!! Liste non exhaus4ve É4rement uni axial: A. Asnacios (MSC, Paris 7) MicropipeQes et BFP: -‐ Adhésion et fusion : F. Pincet, C. Gourrier (LPS, ENS Paris) -‐ Interac4ons cellules immunitaires et endothélium: J. Husson (LADHYX, Polytechnique) -‐ Membranes et fonc4ons cellulaires: P. Bassereau (PCC Ins4tut Curie) Micro-‐pilliers : -‐ Mouvements collec4fs dans des monocouches de cellules: A. Buguin & P. Silberzan ( PCC Ins4tut Curie) -‐ Adhésion cellulaire : B. Ladoux (IJM, Paris 7) Cours # 3 ♦ Rob Phillips, Jane Kondev, Julie Theriot. The Physical Biology of the Cell Garland Science, 2009 ♦ Alberts et al. Molecular biology of the cell Garland Science, 2002 (4th Edi4on) ♦ Jonathan Howard Mechanics of Motor proteins and Cytoskeleton Sinauer, 2001 BIBLIOGRAPHIE