Bases théoriques

Biologie Moléculaire des
Hépatites Virales
Bases Théoriques
QCM 1
GENOME HEPATITE B
 ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside
 ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
 ADN circulaire partiellement double brin
 il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
 il existe un seul cadre de lecture ouverte
 code pour 6 protéines
QCM 2
STRUCTURE DE L’ARN
 Structure en double hélice
 Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de
phosphate est le desoxyribose
 Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à
celles de l’ADN
 Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine
avec thymine et cytosine avec guanine
 L’uracile est une base contenue dans l’ARN
QCM 3
PCR ET RT-PCR
 Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque
cycle
 La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR
 La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de l’ARN
 Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la
réalisation de la technique
 Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on
décontamine le matériel à la javel
QCM 4
Tm ET SONDE
 La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée
 La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu
dans l’ADN
 La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement
dénaturé
 Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel
ADN
 Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et
de celle des amorces
QCM 5
SEQUENCAGE ET SYNTHESE
PROTEIQUE
 Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
 Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée
différent
 Un codon est constitué de trois nucléotides
 Le code génétique est dit dégénéré
 La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour
entraîner la modification d’un acide aminée
 Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR
GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE C
•ARN linéaire simple brin de polarité positive de 9.6 kb
•3 régions distinctes: région 5’ non codante, un cadre de
lecture ouverte unique, et la région 3’ non codante
GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B
ADN circulaire,
double brin sur 2/3
de sa longueur
Code pour 4 gènes:
gène S (AgHBs)
gène C (AgHBc,
AgHBe)
gène P (ADN
polymérase)
gène X (protéine
HBX)
STRUCTURE ARN/ADN
REPLICATION DE L’ADN
REPRESENTATION SCHEMATIQUE
Reproduction du génome (ADNpolymérase…)
Possibilité d’erreur dans la reproduction: apparition de mutations
APPLICATION AU LABORATOIRE:
LA PCR – LA RT-PCR
PCR: Virus à ADN (HBV)
95°C
50°C-60°C
72°C
ADN
Dénaturation
Hybridation
des amorces
Elongation
UN CYCLE DE
PCR
Réactifs: Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques
RT-PCR: Virus à ARN (HCV)
Reverse
Transcription
ARN
Hybridation
de l’amorce
Elongation
Dénaturation
Hybridation
des amorces
et élongation
ADNc
Réactifs: Reverse transcriptase, Taq Polymerase, dNTPs, amorces spécifiques
PRECAUTIONS A PRENDRE POUR LA
MANIPULATION DE L’ARN
INSTABILITE DE L’ARN / L’ADN
⇒ plus facilement dégradable
Préparation de l’ARN : étape délicate (Rnases, présence
éventuelle d’ADN)
Attention aux contaminations:
• différenciation des pièces de travail (pièce
« tampon », pièce « pré-ampli », pièce « post-ampli »
• décontamination du plan de travail et de tout le
matériel utilisé pour manipuler à la javel
DETECTION DES PRODUITS PCR:
HYBRIDATION DE SONDE - PRINCIPE
La température de fusion Tm est la température à laquelle
50% de l’ADN est dénaturé (simple brin)
CALCUL DE LA TEMPERATURE DE
FUSION (Tm)
Oligonucléotide inférieur à 20 nt
Tm (en °C) = (A+T)x2 + (G+C)x4
Oligonucléotide supérieur à 20 nt
Tm (en °C) = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1 + [(N-20)/20])
La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée
Pour la réalisation d’une PCR, le choix des amorces et de
la (ou les) sonde(s) se fait Tm dépendant
SONDE HYBRIDEE
A chaque cycle, la fluorescence augmente proportionnellement
à la quantité d’ADN produit.
EXPRESSION DU GENOME:
SYNTHESE DES PROTEINES
TRADUCTION
• Chaque triplet de bases ADN code pour un triplet de bases ARN (codon).
Un codon code pour un acide aminé.
Le code génétique
Le code génétique
est dit dégénéré:
Un codon START
(AUG) donne le signal
du début de séquence.
Trois codons STOP
(UAA, UAG, UGA)
stoppe la synthèse
protéique
APPLICATION AU LABORATOIRE
Séquençage - Principe
Réalisation d’une PCR avec un mélange
de dNTPs et de ddNTPs (blocage de la
synthèse d’ADN).
CCAGGAAGATGG
CCAGGAAGATG
CCAGGAAGAT
Chaque ddNTP est marqué avec un
fluorochrome spécifique.
CCAGGAAGA
CCAGGAAG
CCAGGAA
Après la PCR, migration sur gel pour
séparer les brins en fonction de leur taille
et lecture de la séquence en fonction des
couleurs de la fluorescence émise
CCAGGA
CCAGG
CCAG
CCA
CC
C
+
APPLICATION AU LABORATOIRE
Séquençage – exemple de l’hépatite B
Les mutants précore : Absence d’AgHBe
TRP
Souche sauvage :
1892- T-T-T-G-G-G-G-C-1901
STOP
Mutant M1 :
1892-
GLY
T-T-T-A-G-G-G-C-1901
STOP
Mutant M2 :
GLY
ASP
1892- T-T-T-A-G-G-A-C-1901
APPLICATION AU LABORATOIRE
Séquençage – exemple de l’hépatite B
La mutation YMDD sur la polymérase (position
204): résistance au traitement à la lamivudine
Souche sauvage :
Mutant YIDD:
Mutant YVDD:
Y
M
D
D
-T-T-A-T-A-T-G-G-A-T-G-A-T-GY
I
D
D
-T-T-A-T-A-T-A-G-A-T-G-A-T-GY
V
D
D
-T-T-A-T-G-T-G-G-A-T-G-A-T-G-
QCM 1
GENOME HEPATITE B
 ADN linéaire bicaténaire contenu dans une nucléocapside
 ARN linéaire monocaténaire de polarité positive
√ ADN circulaire partiellement double brin
√ il existe plusieurs cadres de lecture ouverte
 il existe un seul cadre de lecture ouverte
 code pour 6 protéines
QCM 2
STRUCTURE DE L’ARN
 Structure en double hélice
 Dans l’ARN, les bases azotées s’apparient 2 à 2, adénine
avec thymine et cytosine avec guanine
 Le sucre contenu dans le squelette de pentoses et de
phosphate est le desoxyribose
 Les bases azotées contenues dans l’ARN sont identiques à
celles de l’ADN
L’uracile est une base contenue dans l’ARN
√
QCM 3
PCR ET RT-PCR
√
 Technique qui permet de doubler la quantité d’ADN à chaque
cycle
 La RT-PCR est une technique plus sensible que la PCR
 La préparation de l’ADN est plus délicate que celle de l’ARN
√
 Pour l’ARN, une étape supplémentaire est nécessaire à la
réalisation de la technique
 Possibilité de travailler dans une seule et unique pièce si on
décontamine le matériel à la javel
QCM 4
Tm ET SONDE
√
 La Tm est caractéristique d’une molécule d’ADN donnée
 La Tm ne dépend que du pourcentage en guanine contenu
dans l’ADN
 La Tm est la température à laquelle l’ADN est complètement
dénaturé
 Une sonde d’hybridation permet de détecter n’importe quel
ADN
√
 Le choix de la sonde doit se faire en fonction de sa Tm et
de celle des amorces
QCM 5
SEQUENCAGE ET SYNTHESE
PROTEIQUE
 Chaque nucléotide correspond à un acide aminée
 Chaque triplet de nucléotide correspond à un acide aminée
différent
 Un codon est constitué de trois nucléotides
√

√ Le code génétique est dit dégénéré
 La mutation de trois nucléotides est nécessaire pour
entraîner la modification d’un acide aminée
√
 Le séquençage d’un ADN nécessite de faire une PCR