Transgenèse par modification des spermatozoïdes

CREATION D’ANIMAUX
TRANSGENIQUES PAR
MODIFICATION DES
SPERMATOZOIDES
Yves Demulière
Lise Grout
Ludovic Simon
Création d’animaux transgéniques par
modification des spermatozoïdes
I.
Transgenèse par modification des spermatozoïdes :
1.
2.
3.
4.
II.
Avantages par rapport aux autres méthodes
Incubation avec de l’ADN
Electroporation
Décondensation du noyau
Transgenèse par modification des précurseurs :
1.
2.
III.
Transfection et recombinaison homologue
Infection virale
Application au génie génétique :
1.
2.
Espoirs
Problèmes éthiques
I.
Transgenèse par modification
des spermatozoïdes
1. Avantages par rapport aux
autres méthodes:
a. Présentation des autres méthodes
 Microinjection d’ADN :
- introduction d'un gène ou plus d'un autre animal, d'espèce identique ou différente,
dans le pronucléus d'un ovocyte fécondé
- forte probabilité de ne pas s'intégrer dans un site de l'ADN hôte favorisant son
expression
 Transfert de gènes à l'aide de cellules souches
embryonnaires :
- recombinaison homologue dans une culture in vitro de cellules ES, intégrées à un
embryon au stade blastocyte
- animal chimérique
- méthode knock-out
 Transfert de gènes à l'aide de rétrovirus :
- vecteurs (en général un plasmide ou un virus), les rétrovirus présentant une facilité
à infecter les cellules hôtes
- chimères, l’ADN modifié devant être intégré aux cellules germinales pour que le
transgène puisse être transmis
b. Problèmes avec ces méthodes
 Problème d’individus
chimères
 Aucun individu
mosaïque
 seul 1à 20% des individus
obtenus en F1 transgéniques
Taux d’individu transgénique plus
faible en F1
Nécessite donc des centaines
de poissons et deux générations
pour avoir une lignée
transgénique
Pas de F2 nécessaire et screening
réalisé a moins grande échelle
2. Incubation avec de l’ADN
 Souris
 Association facile et stable
ADN/membrane externe
Etendue à d’autres espèces => ECHEC
A grande échelle -> faible taux


 Gène non intègre, réarrangé et non
fonctionnel
 (mouton : spz lavés)
3. Electroporation
 Poisson zèbre
 Choc électrique perméabilisant la membrane
 Fonctionnel mais pas transmis aux générations
suivantes (pas intégré ?)
 Etendu à d’autres poissons -> pas de lignées
transgéniques stables
 Spz matures ne sont pas de bons véhicules
4. Décondensation du noyau :
 Xénope
 Isolation , décondensation, enzymes de
restriction, ADN linéarisé
 Injection dans cytoplasme d’un ovocyte
Nb élevé de xénopes transgéniques
 Multiples copies de séquences
 Pas de mosaïques


Fonctionnalité et transmission à la descendance
II. Transgenèse par modification
des précurseurs :
Culture et maturation des spz difficiles
1. Transfection et recombinaison
homologue:
Spermatogonies qqs heures en culture
Réimplantation dans testicule d’une autre souris
Marquage par LacZ

ADN intégré, fonctionnel, transmis ?
2. Infection virale :
a. In vivo
Injection de lentivirus dans les tubes
séminifères
 Obtention de cellules de Sertoli infecté mais pas de souris
transgéniques obtenues après fécondation
Injection intracytoplasmique de spermatozoïde
préalablement sélectionné par fluorescence

Seul succès obtenu jusqu’à présent avec des méthodes
non virales
b. In vitro :
Poisson zèbre
Méthode :
Transfection avec plasmide codant une protéine d’enveloppe
Dissociation des testicules
Centrifugation -> récupération de précurseurs
Mise en culture sur cellules nourricières
Résultat :
Intégration des gènes avant différentiation (LacZ)
Bon résultats ≈ 5,6% de PS transgéniques hétérozygotes
Facteurs influençant les taux d’intégration ?
Sensibilité Cellules germinales/cell. Somatiques
III. Application au génie génétique :
1. Espoirs :
A propos des souris de labo?
Production d’organe humanisé ex porc
Aspect économique
Ex des saumons ayant reçu le gène d’une hormone de
croissance sont vendables deux fois plus tôt en mangeant
moins
 Production de protéine d’intérêt pharmaceutique par
certains mammifères

Résistance à certaines bactéries
 Succès chez la souris ( en cours de réalisation pour la
vache)
2. Les problèmes associés
Production d’individus-médicament
Production d’animaux super-résistants
Problèmes écologiques associés
 Problème des résistances bactériennes

Problème de l’innocuité pour l’Homme
Problème de la conquête de la confiance
du consommateur
Bibliographie
• J-M Houdebine Les animaux trangéniques
• PNAS, 3 février 2004, Kurita et al
Transgenis Zebrafish produced by
retroviral infection of in vitro-cultured
sperm
• Vincent Thizeau, Transgenèse animale, les
transfert de gènes chez les animaux