Cours 4 D1 2009
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Epidermolyses bulleuses: physiopathologie génotype/phénotype Diagnostic anténatal Structure/fonction réversion phénotypique thérapie génique ABERDAM Daniel INSERM U634 [email protected] kératinocyte Cytokératines BP280 Plectine Collagène VII kératinocyte Hémidesmosomes Cytokératines BP280 Plectine Collagène VII Anticorps monoclonal GB3 Immunisation de souris par des antigènes Collecte du sérum (lymphocytes B) Fusion des lymphocytes B avec une lignée lymphoma: hybridome Sélection clonale d’un hybridome EPIDERMOLYSIS BULLOSA Epidermolyse Bulleuse Simplex (EB) Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Epidermolyse Bulleuse Dystrophique Cytokeratines BP280 Plectine EBS (R) Peau EB Epiderme EBJ (R) EBD (D et R) Collagène VII Derme Anticorps monoclonal GB3 Anticorps monoclonal GB3 Cytokeratines K5/K14 BP280 Plectine EBS Intégrine 64 EBJ EBD Collagène VII •Epidermolyse bulleuse jonctionnelle(EBJ) * * contrôle EBJ * Cellules du patient ADN génomique ARNm Protéines Southern blot Northern blot Western blot PCR RT-PCR IP Banque génomique Banque d’ADNc Anticorps ChIP Banque d’expression Molécule trimérique, sécrétée dans la MEC Protéine sécrétée IF IP Colonne d’affinité GB3 Criblage de banque d’expression Anticorps polyclonaux Clonage et séquençage RT-PCR et clonage Sequençage de peptides Oligonucléotides dégénérés kératinocyte 1q25-q31 18p11.3 1q32 Cytokératines BP280 Plectine NH2 - 2 Intégrine 64 Laminine-5 Collagène XVII (BP180) Collagène VII Laminine-5 Immunofluorescence sur biopsies cutanées 3 Contrôle Patient 3 2 Liaison génétique entre le gène LAMC2 et l’EBJ-H Difficultés: trois gènes. caractère récessif et léthal 3 familles consanguines Recherche de microsatellites CA/GT proches (ou dans le locus LAMC2) 3 marqueurs AFM + un microsatellite lié à LAMC2 (variabilité de 13 allèles # dans la population caucasienne) CACA….CACA gène ADNc C 5’ P 3’ C Hétéroduplex Homoduplex P Famille consanguine. Patient homozygote contrôle T C G A Mutant TC G A 3’ Arg A G C 5’ Stop A G T 3 N M 3 2 N M N M Exon 3 Northern blot Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) Example d’une famille non consanguine Mutation portée par la mère Mutation portée par le père Formes non léthales d’EBJ • Expression réduite de laminine-5 mutée • Etat traumatique, sans soins efficaces THERAPIE GENIQUE CUTANEE Ex vivo Diagnostic génotypag e biopsie cutané e culture in vitro de kératinocytes transduction rétrovirale greffe feuillets épithéliaux Thérapie génique des EB Phénotype/génotype: - diagnostic (immunohistologie, moléculaire) - recherche de mutation Transfert de gène: - primo culture - choix du vecteur (lentivirus, intégrases,…) - réversion phénotypique Transplantation: - modèles animaux - prise de greffe - évaluation de la réponse immunitaire - expression du transgène in vivo sur du long terme - évaluation des risques de mutation insertionnelle du transgène PRODUCTION D ’UN VIRUS « CURATIF » Laminine 5 Vecteur viral Production de particules virales Culture in vitro de kératinocytes EB Réversion ph énotypique de ératinocytes k EBJ Chaîne ß3 - mutationsR42X / E210K EBJ EBJ-R WT EBJ EBJ-R (%) 100 80 reverted 100 80 60 60 40 40 20 20 0 10 20 30 EBJ DC 0 reverted EBJ 10 20 min 30 min Vinculine 100 detached cells (%) detached cells EBJ MC 80 60 wt 40 EBJ-R reverté K EBJ 20 0 5 minutes 10 15 Applications potentielles de la thérapie génique cutané correction de défauts géniques catabolisme de toxines circulantes sécretion de médicaments diffusibles Correction du phénotype d’obésité par transplantation d’une peau transgénique Larcher et al.(2001) . FASEB J 15: 1529-38 Promoteur K5-leptin-LacZ Day 9 1 Day 32 Souris ob/ob Greffe d’épiderme human exprimant la leptine serum leptin (ng/ml) 2 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Leptin HK control 0 5 10 days 15
