Guêpe Braconidae
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La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions hôtes-parasites chez les insectes Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique Septembre 2008 Université F. Rabelais, Tours UMR CNRS 6035 France Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta Conséquences du parasitisme X X X X Manduca sexta Arrêt du développement Immunosuppression Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) X QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. X Implication d’un troisième partenaire ? X X X Manduca sexta X Arrêt du développement Immunosuppression Cotesia congregata bracovirus Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) Le virus est indispensable à la réussite parasitaire Oeufs de guêpe lavés (sans virus) Oeufs de guêpe + Virus Oeufs de guêpe + Virus + psoralène Blocage expression virus (Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981) Le virus existe sous deux formes … 1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin MW Virus DNA 45 kb 40 kb 35 kb 30 kb 25 kb 20 kb 15 kb 10 kb 7.5 kb 5 kb Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes 2.5 kb FIGE Le virus existe sous deux formes … ADN guêpe 5 kb Sonde ADN viral « EP1 » Signal non attendu ! Sonde ADN viral « EP1 » Taille attendue 5 kb QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture. Le virus existe sous deux formes … 1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes PV10 PV4 EP1 Belle et al., 2002 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Le virus existe sous deux formes … Dans la guêpe : Transmission verticale à la descendance Réplication Peu d’expression des gènes viraux Dans la chenille : Pas d’intégration dans le génome PAS de réplication Expression forte des gènes viraux Cotesia congregata bracovirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe 5 Oviposition Réplication virale Expression des gènes viraux Dérégulation de la physiologie Production de protéines virales de l’hôte Succès parasitaire de la guêpe Injection de virus Cycle du bracovirus de Cotesia congregata Succès du parasitisme Génome intégré (chromosome 5) Protéines de capsides Alteration du developpement Alteration de l’immunité Production des cercles viraux Formation virales Expression des gènes viraux Injection des particules virales Cellules ovariennes de C. congregata Manduca sexta Symbioses : mutualisme/parasitisme Virus qui joue un rôle central Association mutualiste Avec une guêpe Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie Association parasitaire Avec une chenille Associations virus-guêpes Bracovirus Ichnovirus QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. > 17000 espèces de guêpes Braconidae QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. > 14000 espèces de guêpes Ichneumonidae Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes Ichneumonidae 35 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Campopleginae QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Banchinae 14000 espèces Ichneumonoidae Ichnovirus Braconidae 34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Complexe Microgastroïde (7 sous familles) 17000 espèces Bracovirus Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae Origine des associations guêpes braconidae-virus Virus ancêtre Meteorinae BRACONIDAE Macrocentrinae Cheloninae Miracinae >17000 espèces MICROGASTRINAE MICROGASTRINAE-Cotesia Guêpe ancêtre (70 millions d’années) Cardiochilinae Cardiochilinae Doryctinae Braconinae Aphidiinae Opiinae Alysiinae QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Les questions scientifiques Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Virus ancêtre BRACONIDAE Les stratégies utilisées Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées Séquençage de la forme libre du virus Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV) • 30 cercles d’ADN db • 567 kb • 27 % de régions codantes • 156 gènes potentiels • Organisation en familles multigéniques Espagne et al. Science 2004 Contenu du génome de CcBV Viraux 9% Hypothétiques 48% Motifs conservés 26% Cotesia spécifiques 17% Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Viraux 9% Hypothétiques 48% Motifs conservés 26% Cotesia spécifiques 17% Très peu de gènes « viraux » • 1 gène de baculovirus • 1 gène d’ascovirus • gènes de rétroéléments DIRS et Dong • gènes de polintons Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Viraux 9% Hypothétiques 48% Motifs conservés 26% Familles multigéniques à motifs conservés: • Protéines-Tyrosine-Phosphatases • Inhibiteurs NFKB : IKB • Cystatines • Protéines riches en cystéines Cotesia spécifiques 17% Potentiellement de nombreux facteurs de virulence impliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille Analyse des gènes exprimés par reverse northern. Découpage Clonage séquençage ADN viral Digestion enzymatique •Protéines Tyrosines Phosphatases • Inhibiteurs NFKB • Cystatines Sonde P32 d’ADNc chenilles non parasitées Sonde P32 d’ADNc chenilles parasitées Gènes de la famille des IκB • Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll) • Interaction avec le facteur de transcription NF- κB • Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus 9 gènes IkB chez CcBV Voie Toll chez la Drosophile QuickTime™ et un décompresseur TIFF (non compressé) sont requis pour visionner cette image. Champignons Bacteries Gram+ Toll Tube IkB (Cactus) Pelle NFkB (Dorsal) noyau Activation de peptides antimicrobiens Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB NFkB noyau Activation de la réponse antiparasitaires Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB viraux Injection de CcBV IkB NFkB noyau X Pas d’activation de gènes de l’immunité Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ? Viraux 9% Hypothétiques 48% Motifs conservés 26% Cotesia spécifiques 17% Familles multigéniques à motifs conservés: • Protéines-Tyrosine-Phosphatases • Inhibiteurs NFKB : IKB • Cystatines • Protéines riches en cystéines Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ? 3 Cercle 19 1 2 3 Cystatines Cystatines ? • Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine • Cystatines de type 2 • Première description de cystatines virales • Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence QxVxG G PW • Cibles des cystatines : protéases à cystéine de la famille C1 Ex : papaine et cathepsine Cystéine protéases ciblées chez les insectes ? Protéases à cystéine (type C1) des insectes : • Digestion • Développement (métamorphose et mue) • Immunité ? Sarcophaga 26/29 kDa C1 cysteine protease Libération De protéase Mouche tsetse Drosophile CathepsinB Cathepsin L Cathepsin L Surexpression (ARNm) Surexpression (ARNm) Quel est le rôle des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ? • Evolution moléculaire des cystatines virales • Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ? • Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices fonctionnelles ? •Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite Analyse par Northern Corps gras Malpighia n tubules Midgut Hémocytes Nerve Haemocytes Chain a c tin a c ti n cy st a ti n c y sta t in NP 40min 2h 12h 24h 48h 3d 5d 8d NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h ARNm actine ARNm cystatines Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite Analyse par Western KDa Hemolymphe P NP 32,5 25 16,5 Cystatines (13 kDa) Anticorps Anti-Cystatine1 Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1 flowthrough Culture supernatant • Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5 wash • Purification sur colonne de papaïne eluate Fractions fractions élution MW (kDa) 47,5 32,5 25 16,5 6,5 Cystatine 1 CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif 100 Papain Relative Relative Activity (%) Activity Papain (%) 80 60 40 20 0 0 1 10 Cystatin1(nM) Cystatine (nM) 100 Relativ e Activity (%) RelativeCathepsin Activity B (%) Cathepsin B L Cathepsin S.peregrina Cathepsin L 29 kDa cysteine 29 protease S. peregrina kDa cysteine protease 100 80 60 40 20 0 0 Espagne et al. Journal of Virology 2005 16 Cystatin (nM) Cystatine 1 (nM) 83 Modèle de travail _ Perspectives Parasitisme Œufs de guêpe + bracovirus Inhibition par les cystatines de CcBV ? Production de protéases à Cystéine Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ? Les questions scientifiques Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées ? Nature du virus ancêtre ? Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes Chromosome 5 guêpe Pas de réplication dans la chenille hôte Les gènes viraux n’ont pas besoin d’être codés par les cercles Les gènes viraux sont exprimés massivement dans les ovaires Les gènes viraux sont dans le génome de la guêpe ? Nature du virus ancêtre ? Nouvelle stratégie Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes 1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes) Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires -banque EST d’ovaires de guêpes -analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires 2. Analyse de la forme intégrée du virus Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus: 6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata Comparaison dans les banques de données Identification des protéines de structure des virions: Séquençage des protéines constitutives des particules purifiées Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST 44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte) Gènes impliqués dans • la transcription • La constitution des nucléocapsides • La constitution des enveloppes des particules Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes : mutualisme/parasitisme 1. Intégration du virus ancêtre 2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe 3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus Encore beaucoup de questions Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Mécanismes ? Comment s’effectue la réplication ? Virus comme vecteur de transfert de gènes ? Capture des gènes et évolution ?
