Green Fluorescent Protein
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« En quoi la protéine fluorescente GFP peut-elle servir pour la recherche et le traitement du cancer chez l’Homme ? » Plan de la présentation I- Présentation de la protéine GFP………………..............Vincent Lemains II- Le mode de fluorescence de la GFP…………...............Louis Bonnaire III- Comment visualiser cette fluorescence ? ……..............Arnaud Lemains IV- Utilisations de la GFP dans la lutte contre le cancer ….Maeva Faure Green Fluorescent Protein - 238 acides aminés - 28 kDa - naturellement présente dans la méduse Aequorea Victoria La “couronne” de la méduse Aequorea Victoria La méduse Aequorea Victoria cellule de Aequorea Victoria exprimant la GFP Mode de fluorescence de la protéine GFP en milieu naturel Ions calcium Ca ²+ oxygène Aequorine Transfert d’énergie (lumière bleue) Green Fluorescent Protein émission de lumière verte La structure de la GFP en vert les feuillets beta formant une “cage” en beige le chromophore ( hélice alpha ) responsable de la fluorescence Structure cristallographique en tonneau, chromophore au milieu -11 feuillets beta - 1 hélice alpha Techniques de transformation Marquage d’une protéine Protéine à marquer GFP Protéine à marquer Exemple de cellules vivantes synthétisant une protéine marquée grâce à la GFP Marquage d’une cellule, avant, pendant et après électrolyse Cellule à marquer Cellule à marquer Noyau ADN ADN ADN ADN chocs électriques Noyau Cellule à marquer Noyau ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN Schéma illustrant la technique de bombardement des cellules “canon à gènes” cellule marquée particules d’or chargées des fragments d’ADN apareil de transformation biolistique permettant la transformation de cellules par bombardement Autres protéines fluorescentes boites de Pétri réalisées par le laboratoire de Roger Tsien montrant différentes couleurs possibles des protéines fluorescentes. spectres d’émission d’autres protéines fluorescentes Comment visualiser la fluorescence de cette protéine, en action dans une cellule? Visualisation des cellules fluorescentes: • Microscope optique classique (épifluorescent) • Microscope confocal à balayage laser • Cytométrie de flux Principe de fonctionnement du microscope en épifluorescence microscope optique + excitation de la fluorescence Principe de fonctionnement du microscope confocal à balayage laser Exemple d’image obtenue avec un microscope confocal. Comparaison d’images obtenues avec deux types de microscopes différents : -un microscope épifluorescent non confocal -un microscope épifluorescent confocal Les problèmes liés à l’utilisation de cette technique. Principe de fonctionnement de la cytométrie de flux. Exemple de résultats obtenus après une analyse. Utilisation des protéines fluorescentes dans la détection et le traitement du cancer Comparaison entre une métastase pulmonaire vue Sous lumière blanche, puis grâce à la fluorescence a)Vaisseau sanguin sanguin contenant des cellules de fibrosarcome dont l'une s'apprête à se développer dans la peau b)Cellule de fibrosarcome (tumeur cutanée) déformée pour entrer dans un capillaire dans le but de métastaser Observation de la dissémination métastatique du cancer humain du pancréas chez la souris Aperçu in vivo d'une tumeur du cancer du colon chez une souris Comparaison entre l'estimation de la tumeur effectuée in vivo grâce à la GFP, et le volume réel
