R31_Embryons_invitro_2016 - ORBi
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La production d’embryons in vitro dans l’espèce bovine Prof. Ch. Hanzen Année 2015-2016 Université de Liège Faculté de Médecine Vétérinaire Service de Thériogenologie des animaux de production Courriel : [email protected] Site : http://www.therioruminant.ulg.ac.be/index.html Publications : http://orbi.ulg.ac.be/ Facebook : https://www.facebook.com/Theriogenologie 1 Objectifs Sous une forme chronologique, ce chapitre présente les différentes étapes entre la collecte d’ovocytes et l’obtention in vitro d’embryons transférables à savoir : la ponction transvaginale échoguidée (OPU) des ovocytes (Ovum Pick Up : OPU), l’évaluation de leur qualité, leur maturation et fécondation in vitro, la préparation des spermatozoïdes puis la culture des embryons obtenus. Le chapitre se conclut par une brève présentation des conséquences possibles de cette biotechnologie de l’embryon. 2 Objectifs spécifiques de connaissance • • • • • • • • • Enoncer le matériel nécessaire à la réalisation de l'OPU Enoncer les critères de prélèvement des ovocytes d'une vache Enoncer les champs d'application potentiels de la méthode transvaginale énoncer de manière chronologique les différentes étapes conduisant au transfert de l’embryon obtenu in vitro. énumérer les divers aspects de la maturation ovocytaire énoncer les signes de la capacitation des spermatozoïdes et l'agent responsable de son induction in vitro énoncer les critères de fécondation définir la coculture et ses moyens de réalisation définir le LOS 3 Objectifs spécifiques de compréhension • • décrire la méthode dite OPU de prélèvement des ovocytes Comparer avantages et inconvénients de la FIV par rapport à la production in vivo d'embryons Ph. Geluck 4 Plan général • • • • • • • Introduction générale Le prélèvement des ovocytes L ’évaluation de la qualité des ovocytes La maturation ovocytaire La fécondation in vitro La culture des embryons Autres manipulations 5 Introduction générale 6 In vitro In Vivo 7 Définitions • Biotechnologies de l’embryon : • Techniques mises au point à partir des connaissances de base acquises sur le développement de l'embryon. • Trois générations à distinguer…et leur importance relative • MOET : Multiple Ovulation and Embryo Transfer : 1 million de veaux nés • OPU : Ovum Pick Up et FIV, MIV et CIV : 100.000 veaux nés • Clonage : 500 veaux nés 8 Biotechnologies de l’embryon : génération 1 • production d’embryons in utero après stimulation hormonale des femelles donneuses : superovulation • mise au point du transfert d'embryons • développement de la congélation • Facteurs limitants : • nombre faible d'embryons obtenus (7-8) et 5 à 6 transférables • variabilité de production entre femelles traitées • 20 à 30 % des femelles traitées ne donnent pas d'embryons transférables • 25 % produisent plus de 6 embryons • délai entre traitements de superovulation (60 j) 9 Biotechnologies de l’embryon : génération 2 • Production d'embryons en co-culture, après maturation et fécondation in vitro d'ovocytes prélevés sur l'animal vivant ou après abattage • FIVETE : Fécondation in vitro et transfert d’embryons • OPU : Ovum Pick Up • MIV : maturation in vitro (ovocyte) • FIV : Fécondation in vitro (ovocyte) • CIV : Coculture in vitro (embryon) 10 Biotechnologies de l’embryon : génération 3 • Mise à profit des connaissances relatives aux premiers stades embryonnaires • transfert nucléaire : production de clones • transgenèse : introduction d’un gène étranger dans l'embryon • sexage de l’embryon • ICSI : Intra Cytoplasmic Spermatozoa Injection • SUZI : Sub Zonal sperm Insertion 11 Chronologie • • • • • • • • • • 1951 Identification du phénomène de capacitation 1951 Premier transfert d’embryon dans l’espèce bovine 1959 Naissance du premier lapereau obtenu par FIV 1970 Premiers essais de fécondation in vitro chez la vache 1970 Première réussite de fécondation in vitro d'un ovocyte bovin 1973 Naissance du 1er veau après transfert d’un embryon congelé 1981 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vivo 1986 Naissance du premier agneau obtenu par IVM/IVF 1986 Naissance du premier porcelet obtenu par IVF 1987 Naissance du premier veau obtenu par fécondation in vitro d'ovocyte maturé in vitro • 1988 Mise au point de l’OPU • 1989 Naissance du premier porcelet obtenu par IVM/IVF • 1990 Naissance du premier poulain obtenu par IVF • 1992 Naissance du premier buffle obtenu par IVM/IVF • 1993 Application de l’OPU en Belgique (Ulg) • 1993 Naissance du premier chevreau obtenu par VM/IVF • 1997 Naissance de Dolly • 2000 Application en Belgique de l’OPU en ferme 12 Le prélèvement des ovocytes in vitro 13 Etapes du prélèvement in vitro • Lavage préalable des ovaires prélevés dans du liquide physiologique à 39°C • Aspiration dans un tube de 50 ml au moyen d ’une pompe à eau et d ’une aiguille (19G à biseau court) ou d ’une seringue • Ponction de tous les follicules visibles de diamètre > 2-3 mm et d ’aspect transparent • Décantation pendant 10 minutes • Récupération des ovocytes • Lavage dans milieu 199 14 Résultats (service d ’OGA) Années Type N ov NET % --------------------------------------------------------------------------------------------• • • • 96-00 96-00 96-00 98-99 haute valeur génét abattage nécessité après engraissement vaches réformées 305 209 96 6014 50 31 19 1582 16 15 20 26 15 Le prélèvement in vivo des ovocytes : OPU (Ovum Pick Up) 16 Sonde de ponction échoguidée 1207 17 Sonde de ponction échoguidée 18 19 Méthodes de l’OPU • • • • • • • • Evacuation des matières fécales et de l’urine Désinfection région vulvaire Introduction du guide aiguille dans le vagin Positionnement transrectal de l’ovaire sur la sonde Identification du follicule Ponction et aspiration (mouvements circulaires) Une même aiguille pour les deux ovaires Temps total : 10 à 15 minutes 20 La ponction en direct 21 Etapes de la FIVETE • • • • • • • • • Prélèvement des ovocytes par ponction Recherche des ovocytes Identification de la qualité des ovocytes Maturation des ovocytes pendant 24h Fécondation des ovocytes : 18 heures Co-culture sur cellules d’oviductes des embryons Transfert au jour 7 Gestation Parturition 22 Résultats moyens de l’OPU (service d’OGA) OR : ovocytes récupérés : 60 % (/ N follicules) OMM : ovocytes mis en maturation : 80 % (/ OR) OM : ovocytes maturés : 50 % (/ OMM) MO/BL : N embryons obtenus 30 % (/ OM) 23 Résultats moyens de l’OPU par session de ponction 24 Effet d’une stimulation ovarienne • La stimulation n’est pas indispensable mais il est vrai que : • Le traitement multiplie par 2.4 le nombre de follicules ponctionnables (11 à 17 vs 5 à 7) • Le traitement de stimulation triple le nombre d ’ovocyte (8 à 12 vs 3 à 4) et le nombre d ’embryons obtenus par ponction • Le traitement de stimulation augmente le % de récupération (70 % vs 52 %) 25 Conséquences de l’OPU • A court terme • Ponction hebdomadaire : pas d’effet sur le cycle • Ponction bihebdomadaire : • • • • état d’anoestrus recrutement d’une population plus homogène Pas de lutéinisation du follicule ponctionné Pas de modification du moment d’apparition du pic de LH (après PGF) • à moyen terme (5 mois de ponction) • • • • pas d’effet sur la cyclicité Gestation toujours possible Léger épaississement de la capsule ovarienne Très rarement : hématome folliculaire (>10 mm 26 OPU : autres champs d’application potentiels • Animaux prépubères • • • • laparoscopie : veaux de 3 à 9 semaines échographie : veaux de 6 à 16 semaines ou de 6 à 9 mois Avantage : raccourcissement de l’intervalle entre générations A réserver aux animaux > 6 mois (problème de maturation ovocytaire) • Animaux gestants : • pas d’interférence avec l’intervalle de vêlage • pas de risque d’avortement • à réserver aux 3 premiers mois : accès aux ovaires 27 OPU : autres champs d’application potentiels • Applications cliniques • prélèvements répétés de liquides allantoïdien ou amniotique (> J30) : sexage ? • Suppression de l’effet négatif du follicule dominant (infertiles) • Synchronisation de l’ovulation si ponction des follicules > 5 mm 4 jours avant l ’injection d ’une PGF • Production d’animaux transgéniques : meilleur contrôle du statut sanitaire et génétique des animaux prélevés in vivo • Application à d’autres espèces animales : jument (cfr S Deleuze), chèvre 28 Avantages de l’OPU • Augmentation du nombre d ’embryons produits par unité de temps / superovulation • Réduction de la consanguinité par l ’utilisation de taureaux différents lors de chaque séance de FIV (Rem : 1.8 taureau en moyenne utilisé pour 3.4 ponctions) • Reproduction des animaux qui ne répondent plus à la superovulation • Prélèvement des donneuses sans interférence avec l ’intervalle entre vêlages • Réalisation possible en ferme 29 L ’évaluation de la qualité des ovocytes du COC (Cumulus Oocyte Complex) 30 Evaluation de la qualité : 4 classes Classe 1 Aspect transparent du COC Cumulus compact Ooplasme homogène Classe 2 COC et cumulus idem Ooplasme plus irrégulier Classe 4 Cumulus expansé voire absent (naked oocytes) Classe 3 cumulus moins compact ooplasme sombre et plus irrégulier 31 La maturation des ovocytes 32 Année 2010-2011 Prof. Ch. Hanzen –La production d’embryons in vitro chez la vache 33 Rappels • Naissance : blocage des ovocytes en prophase 1 • Maturation ovocytaire = reprise du développement • Finalité de la maturation • reconnaissance et pénétration par le spz • assurer les premiers stades du développement de l ’embryon • Population concernée : 1 % des ovocytes 34 Les trois types de maturation • maturation membranaire • reconnaissance de la ZP3 par le spz • fixation du spz par la ZP2 • stabilisation de la pellucide par ZP1 • maturation cytoplasmique • Migration des granules vers la périphérie • synthèse de l ’ovoperoxydase pour empêcher polypsermie • protéosynthèses • maturation nucléaire : • perte de la membrane nucléaire (GVMB : Germinal Vesicule Membrane Breakdown) • émission du 1er globule polaire 35 Principes généraux • Mise en maturation dans des micropuits (une vingtaine d ’ovocytes par 50 à 100 microlitres) renfermant un milieu • Température de 39°C • Durée de la maturation : vache : 18 à 24 heures • Critères de maturation • expulsion le plus souvent du 1er globule polaire • dispersion des cellules du cumulus (COC expansé) sous l ’effet de l ’acide hyaluronique induit par la LH • développement d ’un blastocyste 36 Ovocyte et cellules folliculaires (= COC) Ovocytes avec globule polaire expulsé 37 GP Ovocyte maturé Espace périvitellin Goutelettes lipidiques Année 2010-2011 Prof. Ch. Hanzen –La production d’embryons in vitro chez la vache 38 La maturation en direct (avec l’aimable autorisation de l’UCL) 39 La fécondation in vitro proprement dite 40 Milieux • Lavage des ovocytes prélevés : M199 • Maturation des ovocytes : M199 + LH + FSH • Milieu de lavage en postmaturation : HTL cad Tampon Hepes et TALP cad milieu de Tyrode modifié par addition d ’Albumine, Lactate et Pyruvate • Milieu de préparation des spermatozoïdes : SPTL cad Sperm TALP • Milieu de fécondation : IVFTL (In Vitro Fécondation TALP) • Remarque : toujours addition d ’Ab 41 Migration des spermatozoïdes • Migration passive et active • Zones de stockage et de relarguage • Perte de protéines de surface présentes dans l ’épididyme et le plasma séminal et de la spermine un agent de décapacitation • Réduction du nombre • Capacitation 42 Etapes de la fécondation 43 La sélection des spermatozoïdes • Décongélation d ’une paillette • Séparation des spz du milieu séminal et des agents cryoprotecteurs par lavage dans un milieu ou par passage sur un double de gradient de percoll ou par swim-up • Remise en suspension pour enlever le glycérol • Détermination de la concentration • Ajustement de la concentration à 2.000.000 /ml 44 L’induction de la capacitation • Incubation pendant 15 minutes de la solution de spz avec de l ’héparine • Capacitation = Processus qui rend le spz apte à assurer la fécondation • Durée (vache) de 4 à 6 heures • Faits • Augmentation de la mobilité • Déclenchement de la réaction acrosomique 45 La fécondation proprement dite • goutte de 50 à 100 microl de milieu sous paraffine (pour éviter l ’évaporation) • / goutte : 10 ovocytes et 100.000 spermatozoïdes (2 millions / ml) • incubation de 18 heures à 39°C à 5% de CO2 et atmosphère saturée en humidité 46 Critères de fécondation • apparition des deux globules polaires ou de deux pronoyaux (visualisation chez la vache après centrifugation ou coloration à la fuschine : différence avec la souris ou la femme) • Identification de spermatozoïdes accessoires sur la pellucide • Taux de clivage : nombre de blastomères identifiés à 48 heures • 4 : 13 % de développement blastocytaire • > 4 : 40 % de développement blastocytaire 47 Ovocytes (COC) en fécondation Ovocytes et expulsion des deux globules polaires 48 La fécondation en direct … 49 La culture des embryons 50 Indication et méthodes • Impératif • levée du blocage de développement observé in vitro avec les embryons animaux (différence avec l ’espèce humaine) • Stade du blocage variable • souris : 2 cellules • porc : 4 cellules • bovin : 4 - 8 cellules • brebis : 8 - 16 cellules • Méthodes : in vivo ou in vitro 51 La culture in vivo des embryons • Oviductes de lapine ou de brebis (intérêt surtout historique) • transfert de plusieurs dizaines (20 à 50) d ’embryons par oviducte (ligaturé) 1 à 2 jours après l ’ovulation de brebis synchronisées • A J7 récupération de 57 % des embryons • Stade morula - blasto : 24 % • Cultures de cellules trophoblastiques tubaires, granuleuse ou somatiques (foie, rein) • Milieux définis renfermant les secrétions des cellules tubaires • SOF : Synthetic oviductal fluid • CR1 = milieu de Rosenkrans • BMOC-3 milieu de Brinster 52 Morula en coculture de cellules d ’oviducte 53 Le développement des embryons en direct (avec l’aimable autorisation de l’UCL) 54 Conséquences de la FIVETE 55 Embryons in vitro et in vivo 56 Caractéristiques comparées des gestations obtenues par IA et par FIV IA FIV (n = 2787) (n = 944) -------------------------------------------------------------------------------Poids naissance mâle 44 48 femelle 41 47 Durée de gestation 281 284 Mortalité périnatale (%) 6.2 8.6 % de veaux mâles 49 55 % de malformations 0.7 3.2 (30 cas) -----------------------------------------------------------------------------------Résultats: Holland genetics (De Ruigh L. AI Vets Bruges 1998) 57 Nature des anomalies observées après FIV 3.2 % sur 944 gestations (30 cas) --------------------------------------------------------------------------N % --------------------------------------------------------------------------Hydropisie des membranes fœtales 17 57 Anomalies des membres 8 27 Veau bull-dog 1 3 Autres 4 13 --------------------------------------------------------------------------Résultats: Holland genetics (De Ruigh L. AI Vets Bruges oct.1998) 58
