6- CROPSAV_XF_Intervention_ANSES_LSV

Xylella fastidiosa :
Etat des connaissances et axes
de recherche
Philippe Reynaud (Anses Montpellier) avec l’aide de J.Y.
Rasplus et al. (INRA) et F. Poliakoff et al. (Anses Angers)
Anses - Laboratoire de la santé des végétaux
Unité
Nématologie
Rennes
Laboratoires
de référence
Siège
Unité
Mycologie
Nancy
et
Unité Bactériologie,
virologie, OGM
Angers
Unité
Quarantaine
ClermontFerrand
Unité Entomologie et
plantes invasives
Montpellier
Unité Ravageurs et
agents pathogènes
tropicaux
La Réunion
•
Etat des connaissances
•
Axes de Recherche
Xylella fastidiosa
• Bactérie du xylème
Epiderme
Cortex
Moelle
Xylème
Cambium
Phloème
Xylème
Phloème
Cambium
Xylella fastidiosa
• Produit des biofilms qui obstruent les vaisseaux
• 0,1-0,5 x 1-5 µm
Modélisation du mouvement de X. fastidiosa dans le xylème
Bactérie
Signal chimique
Karyn L. Newman et al. PNAS 2004;101:1737-1742
XXXXX:
•
-
Découverte
• “California Vine Disease”:
Première détection à Anaheim (Ca)
en 1884 (Pierce 1892)
Newton B. Pierce
Découverte
• 1949 : virus? (Hewitt et al.)
• Premier isolement sur milieu en 1978
(Davis et al.)
• Nommée en 1987 (Wells et al.)
• 1987 : Chlorose panachée des Citrus au Brésil
• Fin des années 1990 : maladie de Pierce, California
Xylella fastidiosa : distribution
Ontario
1880
Canada
USA
Mexico
Italie
Costa Rica
Venezuela
Equateur
Brésil
Brésil
Paraguay
Argentine
1987
Xylella fastidiosa : distribution
interceptions en 2012, 2014 et 2015
sur plants de caféier
Ontario
1880
2014
Canada
USA
2013
Mexico
2013
Italie
Italie
Iran
Foyers
Costa Rica
Venezuela
Equateur
Brésil
Brésil
Paraguay
Argentine
Iran
1987
Taiwan
Taxonomie et spectre d’hôte
5 sous-espèces généralistes (env 300 plantes/60
familles au total)
Lignées génétiques avec spectres d’hôte plus
réduits (à confirmer)
Xf fastidiosa
(PD, ALS) : vigne, amandier, 42
familles
Xf sandyi
(OLS) : laurier rose, caféiers
Xf morus
: muriers (fastidiosa x multiplex)
Xf multiplex
(PDD, PLS) : Prunus, Quercus, oliviers,
Polygala etc
Xf pauca
(CVC) : agrumes, oliviers, caféiers
PD = Pierce’s di sease
ALS = Almond leaf scorch di sease
PDD = Phony peach di sease
PLS = Plum leaf scorch
OLS = Oleander leaf scorch
CVC = Citrus variegated chlorosis
X. fastidiosa : distribution des sous espèces
subsp. fastidiosa
subsp. multiplex
subsp. pauca
subsp. sandyi
Ontario
Canada
USA
Italie
Mexico
Italie
Iran
Costa Rica
Venezuela
Equateur
Brésil
Paraguay
Brésil
Argentine
Iran
Identification des souches X. fastidiosa en France
2 profils différents de Xylella fastidiosa,
présents à la fois en Corse
et en région PACA:
X. fastidiosa subsp. multiplex
 profil A (ST7)
 profil B (ST6)
Distinctes de la
souche CoDiRO
X. f. subsp. pauca
présente en Italie
ST7
ST6
MLSA/MLST
(Scally et al., 2005 / Yuan et al., 2010)
11
Les insectes vecteurs
Les espèces vectrices potentielles
Cicadidae
Lyristes plebejus
4 familles d’Hémiptères (51 spp F, 119 UE)
Aphrophoridae (15 sp F, 29 sp UE)
Cercopidae (7 sp en F et UE)
Cicadellidae (9 sp en F et UE)
Cicadidae et Tibicinidae (20 sp en F et 74 en
UE)








Piqueurs-suçeurs de xylème
Mal connus
Globalement polyphages
Cercopidae
Pour la plupart communs
Populations importantes
Déplacement relativement faible
En général une génération par an
Passe l’hiver sous forme d’œufs ou de
larves (cigales)
Cicadella viridis
Graphocephala fennahi
USA => UE
Cicada orni
Aphrophoridae
Cicadellidae
Aphrophora alni
Philaenus spumarius
Cercopis larve
Cercopis intermedia
Cycle biologique type d’un Cicadellinae
Adulte
Œufs
Larves vectrices
Adultes vecteurs
Les vecteurs nord-américains






Piqueurs-suçeurs de xylème
Appartiennent à des genres et des groupes différents
Bien connus, mais connaissance difficilement transposable
Plusieurs générations par an en région chaude
Certaines espèces passent l’hiver à l’état adulte
Un vecteur introduit récemment en CA a eu un impact fort
sur la propagation de la maladie (Homalodisca vitripennis)
Graphocephala sp
Draeculacephala sp
Philaenus spumarius UE => USA
Neophilaenus lineatus UE => USA
Homalodisca liturata
Cicadellidae
Draeculacephala minerva
Graphocephala atropunctata
Xylème
Cibarium / précibarium
X. fastidiosa ne passe pas d’un stade à l’autre
Plantes hôtes identifiées en Corse
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acer pseudoplatanus
Artemisia arborescens
Asparagus acutifolius
Cistus monspeliensis
Cistus salviifolius
Coronilla valentina
Cytisus racemosus
Genista ephedroides
Pelargonium graveolens
Lavandula angustifolia
Lavandula dentata
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Lavandula stoechas
Myrtus communis
Hebe sp.
Polygala myrtifolia
Prunus cerasifera
Quercus suber
Rosa x floribunda
Rosmarinus officinalis
Spartium junceum
En vert: nouvelles plantes hôtes (genre et/ou espèce),
non listées précédemment par l’EFSA (Scientific opinion 2015).
 Scientific report EFSA 2016 :
359 espèces hôtes / 75 familles botaniques
Méthode de référence MA039 version 1
Détection de X. fastidiosa sur plantes hôtes par PCR en temps réel :
Méthode évaluée et validée
 Méthode disponible sur : www.anses.fr
 Extraction d’ADN automatisée avec le kit QuickPick™ Plant DNA (BioNobile) et l’automate KingFisher™ mL
 PCR en temps réel Harper et al., 2010, Erratum 2013
Méthode de référence MA039 version 1
Xylella fastidiosa: bactérie du xylème
Analyse réalisée sur tissus fortement vascularisés de
plantes en végétation: pétioles et/ou nervures centrales
1 échantillon
0,5 à 1 g par
échantillon:
soit 5 à 100 pétioles
2 prélèvements pour
extraction d’ADN
4 amplifications géniques
•
Etat des connaissances
•
Axes de Recherche
La problématique Xylella est complexe
Cultures
?
Prunus
Olive
?
Co
Vecteurs
?
Cs
?
Réservoirs
Asymptomatique
Xfp
Xfm
Maladie
Ps
?
Axes de Recherche
Identifier les vecteurs, diagnostiquer la
bactérie et identifier la souche concernée
Travaux
d’identification des
souches de Xylella
Travaux pour la
détection de Xylella
sur les vecteurs
Surveillance des vecteurs potentiels
Evaluation des types de piégeage
Collection de référence
Création de clés d’identifications
Test de
pathogénicité
Prévision et gestion
du risque par la
modélisation
26
Anses – INRA : Travaux d’identification des souches de Xylella
 Identification des sous-espèces par
MLSA
 Phylogénie par MLST
 Séquençage partiel des gènes
CysG, gltT, holC, leuA, malF, nuoL, petC
Centre International
de Ressources
Microbiennes
Xylella fastidiosa est très difficile à isoler de plantes contaminées. L’unité BVO (Angers) a néanmoins
réussit à isoler sur milieu artificiel :
17 souches sur échantillons de Corse
3 souches sur échantillons de PACA
7 souches sur caféiers interceptés
Afin d’identifier rapidement les sous-espèces en présence sans réaliser d’isolement, l’Unité BVO a
optimisé les PCR Hernandez-Martinez et al. (2007) et Pooler et Hartung (1995) permettant de discriminer
les quatre principales sous-espèces (fastidiosa, multiplex, pauca, sandyi), confirmées par MLSA
(séquençage de 7 gènes de ménage) (collaboration avec équipe INRA (Emersys).
4
INRA/Anses : Test de pathogénicité : Projet régional SapAlien
Test de pathogénicité en cours
Plantes hôtes potentielles
• Olea europaea
• Vitis vinifera
• Nerium oleander
• Coffea arabica
• Malus domestica
• Polygala myrtifolia
(programme sur deux ans 2015- 2017)
Souches de X. fastidiosa
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
X. f. subsp. multiplex ST6 (Corsica)
X. f. subsp. multiplex ST7 (Corsica)
X. f. subsp. pauca (CoDiRO)
X. f. subsp. pauca (from intercepted
Coffee tree)
X. f. subsp. fastidiosa/sandyi (from
intercepted Coffee tree)
X. f. subsp. fastidiosa (USA)
X. f. subsp. multiplex (USA)
Medicago sativa
Nocotania tabacum
Catharanthus roseus
9
Anses : Travaux pour la détection de Xylella sur les vecteurs
Optimisation, évaluation et validation de méthodes moléculaires pour la
détection sur insectes (ex: Philaenus spumarius)
Janvier - mars 2016: Démarrage de l’optimisation de la méthode
 Comparaison de méthodes d’extraction d’ADN
 Utilisation de la PCR en temps réel (Harper et al., 2010)
 Premiers résultats: bonne sensibilité avec le kit d’extraction ADN QuickPick
Plant DNA
 Besoin d’insectes contaminés (d’Italie) pour valider la méthode (collecte
possible en avril)
 Evaluation de méthode sur autres insectes vecteurs potentiels (cicadelles)
Second semestre 2016: test de la méthode NGS proposée par l’UMR CBGP (JY.
Rasplus)
 Comparaison de méthodes d’analyses sur échantillons artificiellement
contaminés: NGS et PCR en temps réel (Harper et al., 2010), optimisation.
 Test sur échantillons naturellement contaminés
 Préparation d’un projet CASDAR pour application de ces méthodes à l’étude
comportementale des vecteurs potentiels sur cultures d’intérêt (novembre
2016)
INRA : Identifier les vecteurs de Xylella, diagnostiquer la présence de la
bactérie et identifier la souche concernée par méthode NGS
Utilisation d’approches haut-débit
1 run de séquençage => 20 M de séquences
•
•
•
•
1 marqueur pour l’identification du vecteur
1 marqueur pour détecter toutes les
bactéries portées par le vecteur
1 ou 2 marqueurs pour identifier la plante
d’alimentation
Les 7-9 marqueurs diagnostiques de Xylella
Jusqu’à 1500 individus sur une douzaine de marqueurs.
On peut savoir qui est qui, qui porte quoi, qui a mangé quoi
(applicable sur les plantes)
Recherche du/des vecteurs potentiels de Xylella fastidiosa :
Faible prévalence, vecteurs inconnus => nécessité du volumique
•
•
•
•
Identifier qui porte quoi dans une communauté de vecteurs ?
Assurer la biosurveillance du vecteur et du vecté à haut-débit
Mesurer la prévalence du vecté dans des populations de vecteurs
Identifier des liens entre microbiome et phénotype ou vecté
INRA : Prévision et gestion du risque par la modélisation
Comprendre la diffusion Xylella (dispersion, climat, paysage).
Cartographie des zones à risque potentiel.
Informations
écologiques
Cicadelle
Homalodisca
vitripennis
sud USA, puis
Californie
vecteur de Xylella
fastidiosa
Maladie de Pierce
Informations
climatiques
Modèle
statistique
défavorable
Estimation
favorable
Anses : projet H2020 POnTE (Pest Organisms Threatening Europe)
Collection de souches,
pathogénicité sur Citrus –
Caféier – Pervenche, Luzerne et
plantes ornementales, étude de la
colonisation des plantes hôtes
Ateliers pour
améliorer la capacité
des partenaires à la
détection précoce
d’émergence de
Xylella fastidiosa
Génétique de Xylella
Validation d’anticorps
pour l’IF, technique
d’extraction d’ADN
par automate sur
plantes et insectes,
validation de PCR
pour identification
des souches (RT
PCR, HRM)
Projet H2020 : Novembre 2015-Novembre 2019
Identification des
vecteurs effectifs et
proposition de
méthodes
d’échantillonnage
Anses : projet Euphresco VECTACROP
WP 2 : Surveillance des
vecteurs potentiels dans et
autour des cultures cibles
Evaluation des types de piégeage
Collection de référence des
vecteurs potentiels
Création de clés d’identifications
VECTACROP : Tracking vectors of
bacteria and phytoplasmas threatening
Europe’s major crops
WP 3 : Recherche de Xylella
dans les insectes (avec l’aide de
l’Anses Angers)
Projet : Mars 2016 - Mars 2018
Merci