Chapitre 2.3.5.
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CHAPITRE 2.3.5. RHINOTRACHÉITE INFECTIEUSE/ VULVOVAGINITE INFECTIEUSE PUSTULEUSE RÉSUMÉ La vulvovaginite infectieuse pustuleuse (IPV)/rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR), provoquée par l’herpèsvirus bovin 1 (BoHV1), est une maladie des bovins domestiques et sauvages. Le virus est réparti dans le monde entier, mais a été éradiqué en Autriche, au Danemark, en Finlande, en Suède et en Suisse. D’autre part des programmes de contrôle ont été mis en place dans d’autres pays. La maladie est caractérisée par des signes cliniques localisés au niveau du tractus respiratoire supérieur, tels qu’un jetage nasal (muco)purulent et de la conjonctivite. Les signes généraux de la maladie sont de la fièvre, de l’abattement, de l’inappétence, des avortements et une diminution de la production laitière. Le virus peut également infecter la région génitale et causer une vulvovaginite/balanoposthite pustuleuse. Les examens post mortem révèlent des lésions de rhinite, laryngite et trachéite. Le taux de mortalité est faible. Beaucoup d'infections se déroulent de manière subclinique. Des infections bactériennes secondaires peuvent mener à une maladie respiratoire plus grave. Identification de l'agent pathogène : le virus peut être isolé à partir d’écouvillons nasaux prélevés pendant la phase aiguë de l'infection ainsi que dans divers organes prélevés post mortem. Différents types de cultures cellulaires d’origine bovine sont utilisés pour réaliser l’isolement viral, par exemple des cellules secondaires de poumon ou de rein ou encore la lignée cellulaire rénale bovine Madin-Darby. Le virus est responsable d’un effet cytopathogène (ECP) 2 à 4 jours après l’infection. Le virus est identifié par des techniques de séroneutralisation (SN) ou de détection d’antigène utilisant des antisérums monospécifiques ou des anticorps monoclonaux (AcM). Les isolats de BoHV1 peuvent être sous-typés en réalisant un profil de restriction de l’ADN viral. Des méthodes de détection de l’ADN viral ont été développées, et la technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) est à ce titre particulièrement utilisée pour tester les échantillons de sperme. Épreuves sérologiques : la méthode de séroneutralisation virale et les diverses méthodes d’analyses par réaction immuno-enzymatique (ELISA) sont les techniques les plus largement répandues pour la détection d'anticorps. Les anticorps peuvent être détectés dans le lait par la méthode ELISA. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : des vaccins atténués et inactivés sont disponibles. Les vaccins doivent protéger les bovins contre les signes cliniques en cas d’infection, mais également réduire la circulation virale au sein de l’exploitation. Les vaccins ne doivent induire ni maladie, ni avortement, ni aucune réaction locale ou générale, et doivent être génétiquement stables. En 1995, des vaccins marqués délétés sont devenus disponibles. L'utilisation d’une méthode ELISA mettant en évidence la glycoprotéine E (gE) permet de distinguer les animaux infectés des animaux vaccinés à l’aide de vaccins marqués. A. INTRODUCTION La vulvovaginite infectieuse pustuleuse (IPV)/rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR), provoquée par l’herpèsvirus bovin 1 (BoHV1), est une maladie des bovins domestiques et sauvages. Le BoHV1 est un virus de la famille des Herpesviridae, de la sous-famille des Alphaherpesvirinae et du genre Varicellovirus. Le génome viral se compose d’ADN bicaténaire qui code environ 70 protéines parmi lesquelles 33 sont des protéines structurales et jusqu'à 15 protéines sont non-structurales. Les glycoprotéines situées sur l'enveloppe virale jouent un rôle important dans 528 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse les processus de pathogénie et d’immunité. Sur la base d’analyse de restriction de l’ADN viral, le BoHV1 peut être différencié en différents sous-types : 1.1 (infections respiratoires), 1.2 (infections respiratoires et génitales) et 1.3 (infections neurologiques ; BoHV5), et 2b (17). Le virus du sous-type 2 peut être moins virulent que le virus du sous-type 1 (7). Il n’y a néanmoins qu’un seul type antigénique de BoHV1. Le nom de la maladie renferme ses principaux signes cliniques. Après une période d'incubation de 2 à 4 jours, les signes cliniques deviennent évidents : jetage nasal séreux, ptyalisme, fièvre, inappétence, et abattement. En quelques jours, le larmoiement et le jetage deviennent mucopurulentes. Les lésions nécrotiques dans le nez peuvent se transformer en pustules et ulcères recouverts par des pseudomembranes qui vont obstruer les voies aériennes supérieures en induisant chez l’animal une respiration orale. L'infection par le BoHV1 peut également induire des avortements et une diminution de la production laitière (10). Dans les exploitations où la monte naturelle est utilisée, l'infection génitale peut mener à la vulvovaginite ou balanoposthite pustuleuse. Ces deux affections sont caractérisées par des lésions nécrotiques moyennes à sévères au niveau des muqueuses vaginale et préputiale. Après insémination artificielle avec du sperme infecté, une endométrite peut survenir (12). Chez les veaux infectés par le BoHV1, une maladie généralisée peut se développer, avec des lésions nécrotiques focales dans les viscères dont découlera probablement une gastroentérite. Beaucoup d'infections sont subcliniques (32). La méningo-encéphalite semble être habituellement le résultat d'une infection avec un autre herpèsvirus apparenté mais distinct, le BoHV5 (27) comme récemment proposé, bien que l'infection à BoHV1 puisse également causer, mais de manière sporadique, une méningo-encéphalite. Le BoHV1 peut affecter les animaux de tous âges, mais la maladie touche généralement les animaux de plus de 6 mois. Les cas d’infections non compliquées à BoHV1 de type respiratoire ou génital se résolvent en général en 5 à 10 jours. Des infections bactériennes secondaires avec, par exemple, des Pasteurella, peuvent provoquer des signes cliniques plus graves dus à l’infection des voies aériennes plus profondes. Le virus pénètre dans l’organisme au niveau des naseaux et se réplique à des titres élevés au niveau des cellules de la muqueuse respiratoire supérieure et dans les amygdales. Il se dissémine ensuite aux conjonctives et par transport axonal jusqu’au ganglion trijumeau. Une faible virémie peut se produire de temps en temps. Après l'infection génitale, le BoHV1 se multiplie au niveau des cellules de la muqueuse génitale ou du prépuce, et s’installe à l’état latent au niveau du ganglion sacré. L'ADN viral persiste dans les neurones du ganglion probablement pendant toute la vie de l’animal. Si l’animal est soumis à un stress, comme le transport ou la parturition, il peut se produire une réactivation du virus latent. Le virus peut alors être excrété par intermittence dans l'environnement. La lésion primaire est une nécrose focale des muqueuses nasale, laryngée, trachéale ou génitale. Cette lésion est probablement la conséquence directe de la réplication du virus et de son effet cytopathogène (ECP) sur les cellules. L'animal réagit dès lors par une réponse inflammatoire intense. Les lésions peuvent fusionner pour former de grandes pustules renfermant des infiltrations de leucocytes. Les leucocytes périphériques du sang peuvent héberger le BoHV1 (9, 19). Une infection aiguë à BoHV1 induit l'apoptose des cellules lymphoïdes (35). Lors d’infections bactériennes secondaires, une pneumonie peut se développer. Chez les avortons, de petits foyers nécrotiques sont disséminés dans de nombreux tissus, en particulier dans le foie. L’infection induit normalement une réponse immune de type humorale avec production d'anticorps ainsi qu’une réponse immune de type cellulaire dans les 7 à 10 jours qui suivent l’infection. La réponse immune persiste normalement durant toute la vie de l’individu, bien qu'elle puisse tomber au-dessous des seuils de détection des tests de détection. Cependant, l'immunité protectrice induite par l’infection n'est pas éternelle et les animaux peuvent se réinfecter. Des anticorps maternels sont transférés aux jeunes veaux par l'intermédiaire du colostrum et ces derniers sont par conséquent protégés contre la maladie (16). Les anticorps maternels ont une demi-vie biologique d'environ 3 semaines, mais peuvent être détectés de temps en temps chez les animaux jusqu'à 9 mois, mais rarement chez les animaux au-dessus de cet âge. Le virus existe dans le monde entier, partout où l’on trouve des bovins domestiques. D’autres ruminants peuvent être infectés par le BoHV1, mais ceci n'a probablement aucune influence sur la diffusion du BoHV1 chez les bovins domestiques. Indépendamment des ruminants, aucun autre réservoir de BoHV1 n'existe. La dose minimale infectieuse de BoHV1 n'est pas connue. Après infection, l’excrétion virale via le jetage est détectée 8 10 pendant 10 à 14 jours, avec des titres maximaux de 10 à 10 DICT50 (Dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) par ml de sécrétion nasale. La transmission aérienne de BoHV1 n’est possible que sur de courtes distances (15). Le sperme d'un taureau infecté peut contenir du BoHV1, ce virus peut dès lors être transmis par monte naturelle et par insémination artificielle (21). Le contrôle du BoHV1 au sein d’une exploitation est basé sur un minimum de mesures hygiéniques prises au sein de cette exploitation. Dans le meilleur des cas, une période de quarantaine de 2 à 3 semaines est imposée pour les animaux entrant dans l’exploitation. Seuls les animaux séronégatifs envers le BoHV1 seront admis au sein de l’exploitation. Les vaccins empêchent habituellement le développement de signes cliniques graves et réduisent l’excrétion du virus post-infection, mais ne préviennent pas l'infection. Seuls des vaccins dont l'efficacité et l’innocuité sont démontrées devraient être employés (voir la section C). Manuel terrestre de l’OIE 2005 529 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse La suspicion d’une infection par le BoHV1 peut se faire sur base des signes cliniques, lésionnels et épidémiologiques. Cependant, pour poser un diagnostic définitif, on doit recourir à des examens de laboratoire. Une procédure complète de diagnostic dans le laboratoire est réalisée détectant le virus causal (ou les composants viraux) et les anticorps spécifiques qu'il induit. B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l’agent pathogène a) La récolte et le traitement des échantillons (prélèvements) : Les écouvillons nasaux sont récoltés sur plusieurs animaux (de 5 à 10) en phase précoce (aiguë) de l’infection. Ces animaux présentent un jetage plutôt de type séreux que mucopurulent. Dans les cas de vulvovaginite et de balanoposthite, les écouvillons sont prélevés au niveau génital. Les écouvillons doivent être vigoureusement frottés contre les surfaces muqueuses. Le prépuce peut aussi être lavé avec une solution saline, et le liquide de lavage est récolté. Les échantillons sont alors mis en suspension dans un milieu de transport (milieu de culture cellulaire contenant des antibiotiques ainsi que 2 à 3 % de sérum bovin pour éviter l’inactivation virale), refroidi à 4°C, et sont rapidement envoyés au laboratoire. À l’autopsie, les muqueuses du tractus respiratoire, un morceau d’amygdale, de poumon et des nœuds lymphatiques bronchiques sont prélevés afin de réaliser une détection virale. Dans les cas d’avortement, le foie, les poumons, la rate et les reins du fœtus ainsi que le placenta et les cotylédons sont examinés. Les échantillons doivent être envoyés au laboratoire, sur glace, le plus rapidement possible. À leur arrivée au laboratoire, les écouvillons nasaux sont agités dans le milieu de transport pour éluer le virus et sont laissés à température ambiante pendant 30 min. L’écouvillon est retiré du milieu de transport, qui est alors centrifugé à 1 500 g pendant 10 min. Les tissus prélevés sont homogénéisés et suspendus à raison de 10 à 20 % dans un milieu de culture cellulaire puis centrifugés à 1 500 g pendant 10 min. Les surnageants de ces échantillons sont filtrés à travers des filtres de 0,45 µm qui sont utilisés pour les isolements viraux. L’isolement viral dans le sperme nécessite des adaptations car le liquide séminal contient des enzymes et d’autres facteurs cytotoxiques et inhibiteurs de la réplication virale (voir ci-dessous). b) Isolement viral L’isolement viral peut être réalisé sur de nombreux types de culture cellulaire. Des lignées cellulaires rénales bovines primaires ou secondaires, pulmonaires ou testiculaires, des lignées cellulaires de poumon fœtal, de cornets nasaux ou de trachée ainsi que des lignées cellulaires établies comme la lignée cellulaire rénale bovine Madin-Darby sont utilisables. Les cellules peuvent être cultivées sur tubes en verre ou plastique, sur des plaques ou des boîtes de culture. Lorsqu’une plaque 24 puits est utilisée, 100 à 200 µl de surnageant, décrit ci-dessus, sont inoculés au tapis cellulaire. Après une période d’absorption de 1 h, le tapis cellulaire est rincé et un milieu de croissance est alors ajouté. Le sérum ajouté dans le milieu de croissance doit être dépourvu d’anticorps anti-BoHV1. Les cultures cellulaires sont observées chaque jour pour juger de l’apparition d’un ECP qui apparaît dans les 3 jours après inoculation. Cet effet est caractérisé par des amas cellulaires en grappe où les cellules rondes sont amassées autour d’un trou dans le tapis cellulaire ; parfois des cellules géantes avec de nombreux noyaux peuvent être observées. Une certaine expérience est requise pour pouvoir reconnaître ce schéma caractéristique. Quand, après 7 jours en culture de cellule, aucun ECP n’est apparu, un passage en aveugle doit être réalisé. La culture cellulaire est congelée-décongelée et clarifiée par centrifugation, le surnageant est alors utilisé pour inoculer une nouvelle culture cellulaire. Pour identifier le virus qui induit l’ECP, comme le BoHV1, le surnageant de la culture doit être neutralisé par un antisérum spécifique du BoHV1 ou neutralisé par les anticorps monoclonaux (AcM). Pour cette manipulation, une série de dilutions 10 en 10 est réalisée sur le surnageant et pour chaque dilution l’antisérum spécifique du BoHV1 ou le sérum « témoin négatif » sont ajoutés. Les cultures sont alors placées à l’incubateur à 37°C pendant 1 h, les mélanges sont ensuite déposés sur une culture cellulaire et, 3 à 5 jours plus tard, l’index de neutralisation est calculé. L’index de neutralisation est le titre viral (en base log10) du témoin négatif moins le titre viral de la culture virale en présence d’antisérum spécifique. Si l’index de neutralisation est supérieur à 1,5, l’échantillon peut être considéré comme étant positif au BoHV1. Pour diminuer la procédure d’isolement viral, 2 échantillons peuvent être inoculés en culture cellulaire, un étant pré-incubé avec un antisérum spécifique et l’autre étant pré-incubé avec un sérum témoin négatif. Si l’ECP est inhibé par l’antisérum spécifique, l’échantillon peut être considéré comme du BoHV1. 530 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse Une méthode alternative d’identification virale se fait par la démonstration directe de l’antigène BoHV1 en culture cellulaire autour des zones d’ECP (plages de lyse virale) par une technique d’immunofluorescence ou d’immunoperoxydase (11) à l’aide d’antisérums spécifiques conjugués ou d’AcM. • Isolement viral à partir du sperme (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Au moins 0,05 ml de sperme brut doit être testé avec 2 passages en culture de cellules. Pour le sperme congelé, une approximation devrait être faite pour s’assurer que l’équivalent de 0,05 ml de sperme brut est analysé. Le sperme brut est en général cytotoxique et devrait être prédilué avant d’être ajouté à la culture de cellules. Un problème similaire peut parfois survenir avec le sperme congelé. Une méthode expérimentale est décrite ci-dessous. • Protocole i) Diluer 200 µl de sperme frais dans 2 ml de sérum fœtal bovin (sérum dépourvu d’anticorps anti-BoHV1) avec antibiotiques ; ii) Mélangez vigoureusement et laisser 30 min à température ambiante ; iii) Inoculer 1 ml du mélange sperme/sérum bovin sur un tapis monocouche de cellules sensibles (voir plus haut) sur une plaque à 6 puits de culture cellulaire ; iv) Incuber la plaque pendant 1 h à 37°C ; v) Eliminer le milieu et laver le tapis cellulaire 2 fois avec 5 ml de milieu de culture, ajouter ensuite 5 ml de milieu de culture dans chaque puits ; vi) Inclure les témoins positif et négatif de BoHV1 dans l’épreuve. Une extrême précaution doit être prise pour éviter les contaminations dans les puits à tester par le témoin positif, par exemple en ajoutant le témoin en dernier et en utilisant des plaques séparées ; vii) Observation quotidienne des plaques au microscope pour repérer des ECP. Si un ECP apparaît, des épreuves de confirmation pour le BoHV1 sont réalisées par séroneutralisation (SN) spécifique ou par méthode de caractérisation immunologique (voir ci-dessus) ; viii) Si aucun ECP n’apparaît après 7 jours, les cultures sont congelées et décongelées, clarifiées par centrifugation et le surnageant est utilisé pour inoculer de nouvelles monocouches cellulaires ; ix) c) L’échantillon est considéré comme négatif s’il n’y a pas d’évidence d’ECP après 7 jours d’incubation en culture cellulaire. Détection de l’antigène viral Les écouvillons nasaux, oculaires et génitaux peuvent être appliqués sur une lamelle couvre-objet ou, après centrifugation, le culot cellulaire (voir Section B.1.a.) peut être déposé sur des lamelles couvre-objet. Ces lamelles sont soumises à une épreuve directe ou indirecte utilisant des anticorps fluorescents. Dans l’épreuve d’immunofluorescence directe, l’antisérum est monospécifique et conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine, tandis que dans l’épreuve d’immunofluorescence indirecte, c’est un second anticorps, anti-immunoglobuline de bovin, qui est conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine. Pour obtenir les meilleurs résultats, il est nécessaire d’échantillonner plusieurs animaux du troupeau présentant de la fièvre ou un léger jetage de type séreux. Les frottis doivent être séchés et fixés dans l’acétone dans les 24 h. Les frottis qui proviennent d’échantillon d’animaux présentant un jetage purulent ou hémorragique sont souvent négatifs (28). L’avantage de cette technique de détection antigénique est qu’elle peut fournir le diagnostic le jour du prélèvement. Cependant la sensibilité de cette procédure est plus faible que pour la technique d’isolement viral (5). Des témoins positif et négatif doivent être inclus pour chaque épreuve. Les tissus prélevés post mortem peuvent être examinés afin d’y détecter la présence d’antigène de BoHV1 par épreuve d’immunofluorescence sur des coupes d’organes congelés. L’immunohistochimie est également employée ; cette technique offre l’avantage de pouvoir localiser le virus au sein de l’organisme. Les AcM sont de plus en plus utilisés pour la détection d’antigènes de BoHV1, menant à une amélioration de la spécificité de l’épreuve. Cependant, de tels AcMs doivent être soigneusement sélectionnés, en effet ils doivent être dirigés directement contre les épitopes conservés qui sont présents à la surface de tous les isolats de BoHV1. Une autre technique pour détecter rapidement l’antigène viral est l’utilisation de la méthode immuno-enzymatique (ELISA). Les antigènes peuvent être complexés par des anticorps mono ou polyclonaux qui tapissent une surface solide, habituellement les puits d’une microplaque. Des titres 4 5 antigéniques équivalents à 10 –10 DICT50 sont exigés pour obtenir un taux élevé de résultats positifs (4). 8 9 Les titres mentionnés ne sont pas exagérément hauts, en effet des titres de 10 –10 DICT50/ml de fluide nasal peuvent être excrétés par les animaux 3 à 5 jours après l’infection par BoHV1. La sensibilité peut être augmentée par des systèmes d’amplification (voir réf. 6 pour un exemple). Manuel terrestre de l’OIE 2005 531 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse Les avantages des méthodes de détection antigénique sur les techniques d’isolement viral tiennent au fait que l’on peut se dispenser de l’équipement de culture cellulaire et que le diagnostic de laboratoire peut être posé en 1 jour. Les inconvénients de cette méthode sont la faible sensibilité de détection directe d’antigène et le matériel supplémentaire par rapport à l’isolement viral, si l’isolat est requis pour d’autres expériences. d) Détection de l’acide nucléique Pendant la décennie passée, de nombreuses méthodes de mise en évidence de l’ADN du BoHV1 dans des échantillons cliniques ont été décrites, incluant l’hybridation ADN–ADN et la réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). La PCR est également très utilisée dans les procédures courantes de diagnostic (18). Comparée à la méthode d’isolement viral, la PCR possède les principaux avantages d’être plus rapide et plus sensible : la PCR peut être réalisée en 1 à 2 jours. Cette méthode permet aussi de détecter l’ADN viral au sein des ganglions nerveux sensitifs infectés de manière latente (29). L’inconvénient de cette méthode est qu’elle est fortement encline à la contamination et donc des mesures doivent être prises pour éviter les résultats faux positifs. Jusqu'à présent la technique de PCR a été utilisée pour détecter l’ADN du BoHV1 dans des échantillons de spermes infectés de manière artificielle (37) ou naturelle (29, 30). Les chercheurs ont constaté qu’il était important d’optimiser complètement les conditions de PCR, y compris la préparation des échantillons, la 2+ concentration en Mg , les amorces et la Taq polymérase, ainsi que les programmes des cycles. La région cible de l’amplification doit être présente dans toutes les lignées de BoHV1, et la séquence nucléotidique doit être conservée. Les gènes TK, gB, gC, gD et gE ont été utilisés comme cible pour l’amplification PCR. Les PCR basées sur la détection des séquences de gE peuvent être utilisées pour faire la différence entre le virus sauvage et la souche vaccinale délétée pour gE (9, 26). La différenciation entre l’infection par des souches IBR virulentes et une autre souche virale vivante atténuée n’est pas possible par technique PCR. Les PCR ont été développées pour faire la différence entre le BoHV1 et le BoHV5 (1, 25). Expérimentalement, on a démontré que la PCR était plus sensible que l’isolement viral : cette méthode détecte en effet 5 fois plus d’échantillons positifs que ne le fait la technique d’isolement viral. En outre, cette technique PCR a un seuil de détection de seulement 3 molécules. Néanmoins, des résultats faux négatifs ne peuvent être exclus. Afin d’identifier les possibles résultats faux négatifs, il est recommandé d’introduire un étalon dans le tube de réaction de l’échantillon de sperme avec les mêmes amorces. Cet étalon peut être élaboré, par exemple, en insérant un fragment de 100 paires de bases dans la région cible. Cet étalon témoin rend possible la semi-quantification de la quantité d’ADN qui est détectée (25, 29, 30). Avant que la PCR ne puisse être reconnue internationalement comme un outil diagnostique performant dans le cadre des échanges internationaux d’animaux, elle devra être validée par un programme d’évaluation comparative inter-laboratoires. e) Différenciation des sous-types d’herpès bovins 1 En utilisant les AcM et l’immunofluorescence, la radioimmunoprécipitation, l’immunoperoxydase ou l’immunoblot, les sous-types 1 et 2b peuvent être différenciés (24, 36). L’analyse de restriction par l’utilisation d’endonucléases rend possible la différenciation de tous les sous-types connus de BoHV1 (17). L’ADN est d’abord extrait des virions ou des cellules infectées, digéré par des endonucléases de restriction, et les fragments qui en sont issus sont séparés par électrophorèse en gel d’agarose. Le nombre et la taille des fragments indiquent le sous type du virus. De telles techniques offrent une valeur diagnostique limitée mais peuvent être utiles pour des études épidémiologiques. f) Interprétation des résultats L’isolement de BoHV1 ne signifie pas de manière non équivoque que le virus est l’agent causal de la maladie. Cela peut, par exemple, être un virus latent réactivé dans des conditions de stress. Un diagnostic de confirmation de laboratoire doit être fait sur les groupes d’animaux et doit être accompagné d’une séroconversion négative à positive, ou d’une élévation d’au moins 4 fois ou plus du titre d’anticorps anti-BoHV1. Les animaux sur lesquels les échantillons naseaux ont été prélevés, doivent subir 2 prises de sang à 2 ou 3 semaines d’intervalle. Ces échantillons de sérum couplés sont examinés tous les deux par épreuve sérologique détectant la présence d’anticorps spécifiques (voir section B.2). 2. Les épreuves sérologiques Les épreuves sérologiques peuvent êtres utilisées à plusieurs fins : i) 532 pour diagnostiquer une infection aiguë : des prélèvements de sérum pris sur un animal en phase aiguë et en convalescence sont examinés dans une seule épreuve. Une séroconversion de négatif en positif ou une augmentation d’au moins 4 fois du taux d’anticorps est considérée comme signe d’infection ; Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse ii) pour démontrer l’absence d’infection, par exemple, dans le cadre des échanges internationaux ; iii) pour déterminer la prévalence de l’infection dans des études séro-épidémiologiques ; iv) pour participer à des programmes d’éradication et de surveillance ultérieure ; v) dans un but de recherche, par exemple, pour l’évaluation de la réponse en anticorps anti-BoHV1 après vaccination et épreuve virulente. Des tests de SN et divers tests ELISA (13) sont couramment utilisés pour détecter des anticorps sériques contre BoHV1. Une autre épreuve sérologique est l’épreuve d’immunofluorescence indirecte (33). Puisque la latence virale est une conséquence normale de l’infection par le BoHV1, l’identification des animaux sérologiquement positifs fournit un indicateur du statut infectieux. Tout animal porteur d’anticorps contre le virus est considéré comme porteur latent et comme excréteur intermittent potentiel. Les seules exceptions sont les jeunes veaux qui ont acquis passivement ces anticorps par le colostrum de leur mère et les animaux non infectés qui ont été vaccinés à l’aide de vaccins inactivés. Des tests ELISA, incluant l’ELISA gE, sont souvent utilisés pour la détection d’anticorps dans des échantillons de lait, mais ont quelques limitations. Un test négatif sur le lait de tank indique que moins de 20 % des animaux producteurs sont porteurs d’anticorps contre le BoHV1. Beaucoup de vaches séropositives ont un taux en anticorps dans le lait qui est inférieur à 1/5. Ce titre peut changer légèrement, selon le niveau de détection du test ELISA utilisé. En conséquence, il est impossible de déclarer un troupeau indemne de BoHV1 sur la base de tests réalisés sur le lait de tank ou sur un pool de lait, et un test négatif sur le lait de tank doit être suivi par l’intermédiaire d’échantillons de sérum de tous les animaux du troupeau. Pour des programmes de surveillance, des tests réalisés sur le lait de tank peuvent donner une estimation de la prévalence de BoHV1 dans le troupeau, une région ou un pays (20). Ces tests doivent être complétés par des tests sérologiques (individuels ou sur groupes d’animaux) sur les animaux ne donnant pas de lait. a) Séroneutralisation virale (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Les protocoles utilisés pour les épreuves de SN sont variables. Les variations concernent la souche virale utilisée dans le protocole, la première dilution du sérum, la période d’incubation virus/sérum (1 à 24 h), du type de cellules utilisées, du jour de lecture finale et de la lecture du point final (50 % ou 100 %) (22). De toutes ces variables, la période d’incubation du virus/sérum a l’effet le plus important sur le titre d’anticorps. Avec une période d’incubation de 24 h, on peut atteindre des taux en anticorps 16 fois plus élevés qu’avec une période d’incubation de 1 h (2), et cela est recommandé dans les cas où une sensibilité maximale est exigée (par exemple pour les échanges internationaux). Diverses cellules ou lignées cellulaires bovines sont utilisables pour l’utilisation d’épreuves de SN, y compris les cellules bovines secondaires rénales et testiculaires, les lignées cellulaires bovines pulmonaires et trachéales, ou une lignée cellulaire bovine rénale continue Madin-Darby. Un protocole approprié pour une épreuve de SN est mentionné ci-dessous : i) inactiver les sérums, y compris les sérums standards témoins, pendant 30 min au bain-marie à 56°C ; ii) faire des dilutions doubles des sérums à tester dans le milieu de culture cellulaire. Commencer par le sérum non dilué et continuer jusqu’à 1/1024 horizontalement dans une plaque microtitre 96 puits à fond plat, avec au moins 2 puits par dilution et des volumes de 50 µl par puits. Les dilutions d’un sérum témoin positif, et des sérums internes témoins positif et négatif sont également utilisés dans l’épreuve. Un puits supplémentaire avec du sérum test non dilué est également utilisé pour le contrôle de la toxicité des sérums ; iii) ajouter 50 µl par puits de BoHV1 à une dilution en milieu de culture calculée pour avoir 100 à 200 DICT50 par puits. Dans les puits témoins négatifs, ajouter 50 µl de milieu de culture à la place des virus. Ajouter 100 µl de milieu de culture dans 10 puits vides pour évaluer la croissance cellulaire ; iv) faire au moins 4 dilutions de 10 en 10 du stock viral résiduel (titrage de retour) dans le milieu de culture, en utilisant 50 µl par puits et au moins 4 puits par dilution ; v) incuber les plaques pendant 18 à 24 h à 37°C ; vi) 4 ajouter 100 µl par puits de la suspension cellulaire à raison de 3 X 10 cellules par puits ; vii) incuber la plaque pendant 3 à 5 jours à 37°C ; viii) lire les plaques au microscope pour y détecter des ECP. Valider l’épreuve en testant par titrage viral de retour les puits testés (qui devrait donner une valeur de 100 DICT50 avec une gamme de valeurs Manuel terrestre de l’OIE 2005 533 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse permises entre 30 et 300 DICT50), les sérums témoins et les puits de contrôle cellulaire. Le sérum témoin positif devrait donner un titre de +/– une dilution 2 fois (+/– 0,3 log10 unités) de sa valeur cible. Le sérum faiblement positif devrait être positif. Le sérum négatif ne devrait donner aucune neutralisation une fois examiné sans dilution (équivalent à la dilution finale 1/2 au stade de neutralisation). Dans les puits de contrôle cellulaire, la couche monocellulaire doit être intacte ; ix) b) les résultats des épreuves sérologiques sont exprimés en tant que dilution de sérum réciproque qui a neutralisé le virus de 50 % des puits. Si le virus est neutralisé dans 50 % des puits avec le sérum non dilué, le titre (à la dilution initiale) est lu comme 1 (1/2 si on utilise la dilution finale comme référence). Si le virus est neutralisé dans tous les puits de sérum non dilué et dans 50 % des puits avec sérum à moitié dilué, le titre (dilution initiale) est 2 (dilution finale 1/4). Pour des résultats qualitatifs, n’importe quelle neutralisation à un titre de 1 ou supérieur (dilution initiale conventionnelle) est considérée comme positive. Si on observe une cytotoxicité dans les puits du contrôle de la toxicité sérique, l’échantillon est dit toxique (pas de résultat) à moins que la neutralisation virale sans cytotoxicité ne soit observée à de plus hautes dilutions et à un titre pouvant être lu sans ambiguïté. Dans le cas où le sérum est cytotoxique, sérum pour lequel il est donc difficile d’obtenir un résultat, le fait de changer le milieu des puits dans les dilutions les plus basses (2 ou 3 dilutions) 16 à 24 h après l’addition de cellules va empêcher l’effet cytotoxique de beaucoup de sérums qui posent problème. Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Il semble que les tests de SN utilisés pour la détection des anticorps anti-BoHV1 soient progressivement remplacés par des tests ELISA. Une procédure standard pour l’ELISA n’a pas été établie. De nombreux types d’ELISA sont disponibles, parmi ceux-ci des ELISA indirects et de blocage. Les procédures d’ELISA indirect sont plus communément utilisées. Diverses trousses de diagnostic ELISA sont disponibles sur le marché, la plupart de celles-ci sont également utilisables pour détecter les anticorps dans le lait. Pour des raisons de standardisation (d’étalonnage) dans un pays ou un État, il peut être souhaitable de comparer la qualité des trousses de diagnostic et d’examiner chaque groupe par des critères précédemment définis dans un laboratoire national de référence, avant qu’ils ne soient employés par d’autres laboratoires du pays. Les protocoles ELISA présentent un certain nombre de variations. Les plus communes sont : la préparation et le recouvrement des antigènes, la dilution de l’échantillon test, la période d’incubation de l’antigène et de l’échantillon, et la solution substrat/chromogène. Avant d’être utilisé en routine, un ELISA doit être validé en ce qui concerne sa sensibilité, sa spécificité et sa reproductibilité. À cette fin, un panel de sérums diagnostiques : des sérums très positifs, faiblement positifs et négatifs, devront être testés (par exemple par un test de SN). • ELISA indirect Un exemple de protocole ELISA indirect est donné ci-dessous : 534 i) préparer l’antigène par multiplication du BoHV1 en culture cellulaire. Quand des ECP étendus sont observés, les cellules et le milieu sont congelés à –20°C. Après décongélation, le lysat cellulaire est centrifugé pendant 4 h à 8 500 g. Le culot contenant le virus est suspendu dans un petit volume de solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), refroidi sur glace et agité à l’aide d’un sonicateur. La préparation antigénique est alors centrifugée pendant 10 min à 800 g, et le surnageant est utilisé à une dilution appropriée pour couvrir les plaques. Beaucoup d’autres méthodes de productions d’antigène peuvent être trouvées dans la littérature ; ii) recouvrir la plaque de microtitrage avec l’antigène en ajoutant 100 µl d’antigène dilué (dans 0,05 M de tampon carbonate, pH 9,6) dans chaque puits de la microplaque. Fermer les boîtes avec du ruban adhésif, incuber à 4°C toute la nuit ou à 37°C pendant 1 à 2 h, et stocker à –20°C ; iii) avant que le test soit réalisé, laver les plaques. Pour éviter des liaisons non spécifiques au cours du test, responsables d’un bruit de fond important, un second recouvrement avec une protéine non révélante (ex : albumine) peut être nécessaire. Ajouter le tampon, l’échantillon sérique et les sérums témoins positifs, faiblement positif et négatif. Habituellement, les échantillons sériques sont dilués 1/10 à 1/100 dans le PBS avec 0,05 % de Tween 20. Secouer et sceller les plaques et incuber pendant 1 h à 37°C ; iv) laver les plaques entièrement, et ajouter le conjugué anti-immunoglobuline bovine/peroxydase de raifort à une dilution prédéterminée, et incuber encore pendant 1 h à 37°C ; v) ajouter une solution fraîchement préparée substrat/chromogène (par exemple : 0,1 M d’un tampon citrate phosphate, pH 4, contenant de l’acide 2,2’–azino–bis–[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonique]). 2NH4 [ABTS ; 0,5 mg/ml] et une solution 3 % d’H2O2 fraîchement ajoutée [2 µl/ml]), et incuber pendant le temps approprié ; vi) mesurer l’absorbance des puits de dilution par un spectrophotomètre microplaque à la longueur d’onde appropriée ; Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse vii) un échantillon test est considéré comme positif s’il a une valeur d’absorbance de 0,2 plus haut que le sérum négatif témoin. Le test est valide si les sérums positifs ou faiblement positifs sont positifs et si le sérum négatif possède une absorbance inférieure à 0,2. Les tests non valides sont répétés. Les limites acceptables pour les valeurs témoin et rejet doivent être déterminées par des expériences individuelles. • ELISA de blocage Le principe de l’ELISA de blocage ou ELISA de compétition est basé sur le blocage de la liaison de l’antigène à l’antisérum BoHV1, antisérum qui est couplé à l’enzyme ou à des anticorps monoclonaux anti-BoHV1 marqué par les anticorps de l’échantillon à tester. La présence des anticorps dans l’échantillon à tester bloquera la liaison, il en résultera une diminution de la coloration après l’addition de la solution substrat/chromogène. Une comparaison des ELISA indirect et de blocage a montré que ce dernier était généralement plus sensible (22). Récemment, les ELISA gE ont été décrits pour être employés en même temps que des vaccins marqués pour détecter les animaux infectés dans les troupeaux vaccinés (31, 34). Dans un ELISA gE, le lait peut remplacer le sérum (34). c) Standardisation Dans chaque test sérologique, des témoins appropriés à l’aide de sérums très positifs, faiblement positifs et négatifs doivent être inclus. Un groupe de scientifiques en Europe, initié par un groupe de vétérinaire responsables de l’insémination artificielle dans l’Union Européenne (UE), a récemment donné son accord sur l’utilisation de sérums positifs, faiblement positifs et négatifs pour la standardisation des tests de BoHV1 dans les laboratoires qui examinent en routine les échantillons des centres d’insémination (23). Ces sérums ont été adoptés comme standards internationaux de l’OIE pour les tests BoHV1 et sont disponibles 1 dans les Laboratoires de référence de l’OIE pour l’IBR/IPV . Les épreuves recommandées pour les échanges internationaux (SN ou ELISA) doivent être capables de caractériser comme positifs à la fois les standards fortement et faiblement positifs (ou standards secondaires nationaux d’activité équivalente). C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE De nombreux vaccins BoHV1 atténués et inactivés sont disponibles actuellement. Les vaccins contiennent les souches virales qui ont habituellement subi de multiples passages en culture de cellules. Certaines lignées de virus vaccinaux ont un phénotype thermosensible, par exemple ils ne peuvent pas se répliquer à des températures supérieures ou égales à 39°C. Les vaccins atténués sont administrés de manière intranasale ou intramusculaire. Les vaccins inactivés contiennent une concentration élevée de virus inactivés ou des portions de particules virales complétées avec un adjuvant pour stimuler une réponse immune adéquate. Les vaccins inactivés sont administrés par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Des vaccins marqués sont maintenant disponibles dans de nombreux pays. Ces vaccins marqués inactivés ou atténués sont basés sur des mutants délétés ou sur des sous-unités de virion, par exemple la glycoprotéine gD. L’utilisation de tels vaccins marqués en relation avec des épreuves diagnostiques associées rend possible la distinction entre les animaux vaccinés et les animaux infectés, et peuvent donc fournir une base à de nouveaux programmes d’éradication. Les programmes de vaccination intensive peuvent réduire la prévalence d’animaux infectés (3, 14), programmes qui peuvent être suivis en employant une épreuve de diagnostique associée. Dans les situations où c’est économiquement justifiable, les animaux infectés de manière latente pourraient être éliminés, si nécessaire. Il en résulterait que la région serait alors indemne d’IBR. Quelques pays ont récemment mis en place de tels programmes d’éradication et la vaccination n’y est plus permise. Les lignes directrices pour la production de vaccins vétérinaires sont données au Chapitre I.1.7., « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Les lignes directrices données ici et dans le Chapitre I.1.7. sont générales et peuvent être complétées par des directives nationales ou régionales. 1 Disponible auprès de l’Institut central pour le contrôle des pathologies animales, section maladies infectieuses, P.O. Box 2004, 8203 A Lelystad, Pays-Bas, et AFSSA Lyon, Laboratoire de pathologie bovine, 31 avenue Tony Garnier, BP 7033, 69342 Lyon Cedex 07, France. Manuel terrestre de l’OIE 2005 535 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Le vaccin est préparé en utilisant un système de caractérisation. L’origine, l’historique des passages en culture de cellules et les conditions de conservation du lot de semence primaire du virus doivent être enregistrés. Un test d’identification virale peut être utilisé sur ce lot de semence primaire. Le lot de semence contient des lignées BoHV1 qui ont été atténuées pour donner la lignée vaccinale vivante. Les lignées peuvent être atténuées par passage multiple en cultures de cellules, en adaptant le virus à croître à basse température (mutants thermosensibles), ou par génie génétique, par exemple, en délétant un ou plusieurs gènes viraux qui sont non essentiels à la réplication. Il devrait y avoir moyen de distinguer les virus vaccinaux vivant des autres virus (par exemple par leur modèles de croissance température dépendante ou par le polymorphisme de la longueur des fragments de restriction). Les lignées utilisées pour la préparation de vaccins inactivés ne doivent pas être atténuées. Le lot de semence doit donc être exempt de contaminants. b) Méthode de culture Les cellules utilisées pour la production de vaccin sont préparées en utilisant un système de semence. Le virus devrait être cultivé sur des lignées cellulaires établies dont on a montré qu’elles sont aptes à la production vaccinale, par exemple la lignée de cellules rénales bovine Madin-Darby. L’historique de la lignée cellulaire doit être connu. Les lignées cellulaires doivent être exemptes d’agents externes et peuvent être testées pour leur capacité à générer des tumeurs. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale Indépendamment de la méthode de préparation du virus vaccinal de semence, le virus de semence utilisé dans l’incorporation d’un vaccin vivant devra montrer son efficacité, son innocuité et sa pureté. i) Efficacité Celle-ci est démontrée par une épreuve de vaccination en condition de laboratoire. Un exemple de lignes directrices est donné dans une monographie de la Pharmacopée Européenne (8). Brièvement, le vaccin est administré à 5 veaux de 2 à 3 mois séronégatifs envers le BoHV1. 2 veaux sont gardés comme témoins. Tous les veaux sont infectés par voie intranasale 3 semaines plus tard avec une souche de BoHV1 virulente qui induit des signes typiques d’infection à BoHV1. Les veaux vaccinés ne devraient montrer aucun signe clinique ou des signes cliniques faibles. Le titre viral maximal retrouvé dans le mucus des veaux vaccinés puis infectés devrait être 100 fois moindre que celui trouvé dans les veaux témoins. La période d’excrétion virale devrait être plus courte d’au moins 3 jours chez les veaux vaccinés que chez les veaux témoins. ii) Innocuité Une quantité de virus équivalente à 10 doses de vaccin (a) ne doit pas induire de réaction locale ou généralisée significative chez les jeunes veaux ; (b) ne doit pas causer d’infection fœtale ou d’avortement, et (c) ne doit pas redevenir virulente après 5 passages successifs sur veaux. Pour un vaccin inactivé une double dose est généralement administrée. Le test de réversion vers la virulence n’est pas applicable pour les vaccins inactivés. iii) Pureté Le lot de semence est testé pour l’absence de virus étranger et l’absence de contamination bactérienne, fongique et mycoplasmique. Les virus étrangers qui suivent doivent être particulièrement exclus des vaccins BoHV1 : les adénovirus, le virus Akabane, le coronavirus bovin, les herpèsvirus bovins 1, 2, 4 et 5, le parvovirus bovin, le virus respiratoire syncytial bovin, le rotavirus bovin, le virus de la vaccine et les virus de la maladie d’Aujeszky, de la fièvre catarrhale ovine, de la fièvre éphémère bovine, de la leucose bovine, de la papillomatose bovine, de la stomatite papuleuse bovine, de la diarrhée virale bovine, de la variole bovine, de la fièvre aphteuse, de la dermatose nodulaire cutanée, du coryza gangreneux, du para-influenza 3, de la rage, de la peste bovine et de la stomatite vésiculeuse. Comme le virus de la diarrhée virale bovine a été souvent isolé comme contaminant de vaccins, une attention spéciale doit lui être accordée pour s’assurer de son absence. 2. Méthode de fabrication Toutes les substances utilisées pour la production de vaccins doivent être exemptes de contaminants. On devrait employer des cellules qui n’ont pas plus de 20 passages à partir de la culture cellulaire de base. Le virus de semence ne devrait pas être issu de plus de 5 passages à partir du lot de semence primaire. Les virus vaccinaux issus du génie génétique sont traités de la même façon que les souches virales vaccinales atténuées conventionnelles. Quand suffisamment de cellules se sont développées, l’infection de la lignée cellulaire avec le 536 Manuel terrestre de l’OIE 2005 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse virus vaccinal peut avoir lieu. L’addition d’antibiotiques est normalement réservée aux liquides de culture cellulaire. Le liquide surnageant est récolté au moment où la production virale atteint son maximum. Pour les vaccins vivants, le surnageant est clarifié, mélangé à un stabilisateur, congelé–déshydraté et embouteillé. Pour la production de vaccins inactivés classiques, le surnageant est homogénéisé avant que l’agent inactivateur ne soit ajouté. Après cette procédure, un essai pour évaluer l’inactivation complète du virus est effectué. Le test consiste en 2 passages en culture cellulaire. La suspension virale inactivée est alors mélangée avec un adjuvant et mis en bouteille. La production des vaccins doit être conforme aux directives de bonne pratique en matière de production (GMP pour Good Manufacturing Practice). 3. Contrôles en cours de fabrication La lignée de culture cellulaire utilisée ainsi que la lignée virale doivent être dépourvues de tout contaminant. Les cellules doivent avoir une morphologie normale avant d’être inoculée par le virus. Elles sont observées afin d’y distinguer des ECP pendant leur culture. Les cellules témoins non inoculées doivent avoir maintenu leur morphologie jusqu’à la période de récolte. Un titrage viral est réalisé sur le surnageant récolté. Pendant la production de vaccins inactivés, des essais sont réalisés pour assurer l’inactivation. Le volume final devrait être examiné pour l’absence de contaminants. 4. Contrôles des lots Les tests suivants doivent être normalement réalisés sur chaque lot. Des exemples de lignes directrices pour réaliser les contrôles des lots peuvent être trouvés dans les Directives européennes, la Pharmacopée européenne et le code des règlements fédéraux du département de l’agriculture des Etats-Unis d’Amérique. a) Stérilité Aucune bactérie, aucun champignon et virus extrinsèques ne doivent être présents. Les tests de stérilité et d’absence de contamination du matériel biologique peuvent être trouvés au Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». b) Innocuité Pour les vaccins inactivés, une double dose de vaccin, et pour les vaccins atténués, 10 fois la dose, ne doivent pas induire d’effets nuisibles sur des jeunes veaux séronégatifs. c) Activité Tester un lot représentatif suffit pour contrôler l’activité, comme cela est décrit dans la section C.1.c.i. Dans le cas de vaccins atténués, le titre viral de chaque lot doit être déterminé et ne doit pas dépasser 1/10 de la dose à laquelle le vaccin a démontré son innocuité et ne doit pas être inférieur au titre minimum requis. Dans le cas de vaccins inactivés, la puissance est testée en utilisant d’autres méthodes validées, par exemple, des expériences réussies sur des veaux. d) Durée d’immunité Pour ce faire, on peut se contenter de tester le virus de semence qui est multiplié et qui est à l’origine des virus vaccinaux. Un vaccin efficace contre le BoHV1 doit induire une immunité protectrice d’au moins 1 an, cependant beaucoup de vaccins existants n’ont pas été testés selon ce standard. e) Stabilité Pour les vaccins vivants, le titre viral doit rester constant jusqu’à 3 mois au moins après la date de conservation indiquée. En outre, des tests de détermination de la teneur en humidité, de la concentration en conservateur et de pH sont réalisés. Pour des vaccins inactivés, la viscosité et la stabilité de l’émulsion sont aussi testées. f) Agents de conservation L’efficacité des agents de conservation doit être démontrée. La concentration de l’agent et sa persistance durant toute la durée de conservation doivent être vérifiées. La concentration doit être conforme à l’établissement de limites pour les agents de conservation. g) Précautions d'emploi et mise en garde Aucune précaution particulière ne doit être prise. Le BoHV1 n’est pas pathogène pour l’homme. Manuel terrestre de l’OIE 2005 537 Chapitre 2.3.5. — Rhinotrachéite infectieuse bovine/Vulvovaginite infectieuse pustuleuse 5. Contrôles du produit fini a) Innocuité Chaque produit doit être inoffensif chez au moins 2 veaux sensibles qui reçoivent une double dose (dans le cas des vaccins inactivés) ou 10 fois la dose (dans le cas des vaccins vivants). b) Activité Voir section C.4.c. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ASHBAUGH S.E., THOMPSON K.E., BELKNAP E.B., SCHULTHEISS P.C., CHOWDHURY S. & COLLINS J.K. (1997). Specific detection of shedding and latency of bovine herpesvirus 1 and 5 using a nested polmerase chain reaction. J. Vet. Diagn. 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