Role des cellules mesectodermiques issues des

/. Embryol. exp. Morph. Vol. 31, 2, pp. 453-477, 1974 453
Printed in Great Britain
Role des cellules mesectodermiques
issues des crates neurales cephaliques dans la
formation des arcs branchiaux et
du squelette visceral
Par C. LE LIEVRE1
Laboratoire d'Embryologie (Professeur N. Le Douarin),
Universite de Nantes
SUMMARY
The participation of neural crest cells in the formation of the branchial arches and especially
of the hypobranchial skeleton has been studied with heterospecific grafts of quail neural tube
into the chick embryo. According to the labelling technique devised by Le Douarin, the
differences between quail and chick interphase nuclei make it possible to use quail cells as
cellular markers in this system.
The excision of the mesencephalo-rhombencephalic primordium of 4- to 12-somite chick
embryos results in the atrophy of the branchial arches, and in important deficiencies of the
hypobranchial skeleton. Nevertheless, the nearly complete absence of the branchial mesen-
chyme does not prevent the visceral pouches and clefts from forming.
The isotopic and isochronic graft of quail neural primordium into the chick shows that the
mesenchymal component of the branchial arches is of neurectodermal origin, except for the
muscle plates and the endothelium of the aortic arches, which derive from the mesoderm.
The mesencephalic neural crests give rise to the totality of the mesenchyme of the first
branchial arch and partially to that of the second one, while the rhombencephalon con-
tributes to the formation of the second, third and fourth arches.
The stability of the marker system produced by quail cells implanted into the chick makes it
possible to follow the migrating cells until they have reached their definitive localization in the
various structures of the hypobranchial skeleton, which thus appears to be entirely of neurecto-
dermal origin. The cells arising from the mesencephalic neural primordium constitute the
lower jaw skeleton (Meckel's cartilage and bones) and are all still in the process of migration
at the 6-somite stage. Cells originating from the rhombencephalon have left the neural axis at
the 9- to 10-somite stage for the anterior part (in front of the first somite) and at the 11- to
12-somite stage for the posterior rhombencephalon.
Differentiation of mesectodermal cells into chondrocytes and osteocytes has been observed
during the morphogenesis of the visceral skeleton.
INTRODUCTION
Les cretes neurales correspondent au territoire ectodermique situe a la
limite de l'ectoderme dorso-lateral et du tube nerveux. Apres la decouverte
par His (1868) des capacites de migration des cellules des cretes neurales,
1 Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Universite de Nantes, B.P. 1044,
44037 Cedex, Nantes, France.

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de nombreux travaux ont mis en evidence les potentialites multiples de ces
cellules.
Depuis les premieres observations de Goronowitsch (1892, 1893), sur
l'embryon de poulet, et de Platt
(1893, 1897), sur celui de Necturus, on sait que
les cretes neurales et certaines placodes ectodermiques donnent naissance a une
partie du mesenchyme de la tete et des arcs branchiaux qui a ete designee pour
cette raison par Platt sous le terme de mesectoderme. Bien que ce point de vue
ait ete longtemps conteste par les tenants de la theorie des feuillets embryon-
naires de Von Baer (1828), des travaux experimentaux ulterieurs realises
essentiellement chez les Amphibiens ont confirme les conclusions que Gorono-
witsch et Platt avaient tirees d'une observation histologique fine. Des techniques
de marquage par les colorants vitaux (Vogt, 1925, 1929; Stone, 1932; Detwiler,
1937; Horstadius, 1950) ou par la thymidine tritiee (Chibon, 1962, 1966) et
d'excision de tron<;ons de crete neurale aux stades precoces du developpement
(Stone, 1926, 1929; Horstadius & Sellman, 1946; Horstadius, 1950; Newth,
1956) ont en effet montre l'intervention des cellules d'origine neurectodermique
dans la formation d'une partie du mesenchyme pharyngien et cephalique dont
derivent diverses structures, nerveuses et paraganglionnaires, pigmentaires et
squelettiques.
En ce qui concerne les Vertebres Superieurs, les techniques d'extirpation
precoce des cretes neurales (Van Campenhout, 1930, 1937; Jones, 1937, 1942;
Yntema, 1944; Hammond & Yntema, 1964) ont permis d'etendre aux Oiseaux
la plupart des donnees acquises chez les Vertebres Inferieurs. Ainsi, Van
Campenhout, d'une part, Hammond & Yntema, d'autre part, ont-ils demontre
que l'excision des cretes neurales cephaliques provoque des deficiences du
squelette visceral et cranien. D'autre part l'utilisation par Johnston (1966) du
marquage isotopique nucleaire (selon Weston, 1963) a mis en evidence l'import-
ance de la participation des cretes neurales cephaliques a la constitution du
mesenchyme de la tete et de la region branchiale chez l'embryon de poulet.
Nous avons repris l'etude de la participation des cretes neurales a la genese
des arcs visceraux en utilisant la technique de marquage biologique mise au
point par Le Douarin (1969, 1971, 1973). Cette methode a, sur l'utilisation des
isotopes, l'avantage de fournir un marquage durable qui permet de suivre la
destinee des cellules des cretes neurales jusqu'a ce qu'elles aient atteint un etat
de complete differentiation. Elle est basee sur des differences de la structure
nucleaire chez deux especes d'Oiseaux, la caille {Coturnix cotumix japonica) et
le poulet (Gallus gallus). Chez le poulet comme dans la plupart des especes
animales, la chromatine est dispersee d'une maniere homogene dans l'ensemble
du noyau constituant un reseau qui presente quelques chromocentres de petite
taille. Chez la caille, au contraire, une partie importante de l'ADN est associee
au nucleole sous la forme d'une volumineuse masse heterochromatique. II en
resulte que l'application de la reaction nucleate de Feulgen & Rossenbeck (1924)
permet de reconnaitre sans ambiguite les cellules de caille des cellules de poulet.

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Le principe de la technique utilisee dans le present travail consiste a realiser des
greffes isotopiques et isochroniques d'ebauche neurale de caille chez l'embryon
de poulet, dans la region du mesencephale et du rhombencephale presomptifs,
puis a suivre la migration des cellules issues du greffon dans la region branchiale
de l'embryon-hote.
MATERIEL ET METHODE
Les experiences ont porte sur des embryons de poulet {Gallus gallus) de la race
Leghorn blanche et sur des embryons de caille japonaise {Coturnix coturnix
japonic
a).
1. Techniques ope'ratoires
Excision de Vebauche neurale chez Vembryon de poulet
Les excisions bilaterales de troncons d'ebauche neurale cephalique sont
pratiquees au cours du 2eme jour de 1'incubation. A l'aide de microscalpels, des
incisions sont faites de part et d'autre de l'ebauche neurale, ceci permet de
separer le troncon du tube nerveux et les cretes neurales qui lui sont associees
de l'ectoderme dorsal et du mesoderme somitique ou cephalique. Le tube neural
est ensuite detache de la corde sous-jacente et le fragment d'ebauche neurale
ainsi isole est elimine.
Trois types d'operations sont realises selon l'age des embryons. La migration
des cellules des cretes neurales s'etablissant progressivement de l'avant vers
l'arriere au cours de la formation du tube nerveux, l'operation doit etre effectuee
a des stades d'autant plus precoces que le territoire excise est plus anterieur.
Au stade de 5 et 6 somites. L'etendue de l'ablation indiquee sur la Fig. 1A
correspond au territoire presomptif du mesencephale et de la partie anterieure
du rhombencephale. La limite posterieure de l'operation est situee au niveau du
ler somite.
Au stade de 7 a 9 somites. L'excision est realisee depuis la constriction mesen-
cephalorhombencephalique jusqu'au niveau de la 6eme paire de somites
(Fig. IB).
Au stade de 9 a 12 somites. Sur ces embryons seule la partie posterieure de
l'ebauche rhombencephalique entre les niveaux des lere et 6eme paires de somites
est excisee (Fig. 1C).
A l'interieur de ces limites d'autres types d'excisions ont ete pratiques
occasionnellement. Leur niveau exact sera precise par la suite au cours de
l'expose des resultats (Tableaux 1 et 4).
Greffe
isotopique et isochronique de Vebauche nerveuse de caille sur Vembryon de
poulet
Dans cette serie experimentale l'ablation d'un fragment de l'ebauche neurale,
realisee sur des embryons de poulet de 5 a 12 paires de somites a ete suivie de la
greffe du territoire neural homologue provenant d'un embryon de caille de
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V
B
Fig. 1. Niveaux et stades auxquels sont le plus generalement pratiquees les operations
d'excision ou de greffe de l'ebauche neurale, H. (A) Avant le stade de 7 somites,
ebauche mesencephalique et partie anterieure de l'ebauche rhombencephalique.
(B) Avant le stade de 9-10 somites: partie anterieure de l'ebauche rhombence-
phalique. (C) Avant le stade de 11-12 somites: partie posterieure de l'ebauche
rhombencephalique.
meme stade (Fig. 2). L'ebauche neurale de caille est isolee des tissus avoisinants
par action d'une solution de trypsine a 5%0 dans du liquide de Tyrode sans
calcium ni magnesium (Moscona & Moscona, 1952). Le territoire neural greffe
est rapidement incorpore aux structures axiales de l'hote et se trouve recouvert
par l'ectoderme cicatriciel du poulet. Les cellules issues du greffon migrent dans
l'embryon note ou elles peuvent etre reconnues grace a leurs caracteres nucleaires.
2. Observation des resultats
Exarnen de la morphologie externe des embryons qui ont subi Vexcision d'un
fragment d'ebauche neurale
cephalique
Ces embryons sont preleves apres une duree totale d'incubation de 2 a 19
jours. Aux stades 10 a 35 de Hamburger & Hamilton (H. et H.), 1951 (2 a 9
jours d'incubation), les embryons qui ont subi l'ablation de troncons de tube
nerveux et de cretes neurales sont dessines a la chambre claire ou photographies,
leur morphologie cranienne et cervicale est comparee a celle d'embryons
temoins de meme stade. Chez les embryons preleves aux stades de 10 a
19 jours
d'incubation, le squelette branchial est disseque.

Role des cellules mesectodermiques 457
Fig. 2. Greffe orthotopique isochronique d'ebauche neurale de caille sur l'embryon
de poulet. (a) vue dorsale, (b) coupe transversale au niveau du 3° somite. (A) Em-
bryon de poulet de 9 somites apres excision de l'ebauche neurale rhombencephalique,
§3. (B) Embryon de poulet apres remplacement de l'ebauche excisee par une ebauche
neurectodermique homologue (C) prelevee sur un embryon de caille de meme stade
(D) et isolee apres action de la trypsine, HE).
Techniques histologiques
Les embryons qui ont subi l'excision d'une partie de l'ebauche neurale
cephalique sont fixes in toto par le liquide de Bouin aux stades 10 a 35 de H. et H.
Les embryons porte-greffe sont fixes in toto par le liquide de Zenker entre le
2eme et le 8eme jour de l'incubation. Au-dela de ce stade on preleve seulement
la region de la tete et du cou. La coloration appliquee est la reaction nucleale de
Feulgen & Rossenbeck (1924) qui permet de reconnaitre les cellules de Caille
(Fig. 3). Cette reaction est suivie d'une legere coloration de fond au picro-
indigocarmin.
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