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ECOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT
Année 2013
ÉTUDE EXPÉRIMENTALE DU POUVOIR
ADJUVANT DU GUI (Viscum album)
EN VACCINATION
THÈSE
Pour le
DOCTORAT VÉTÉRINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL
Le ……………..
par
Thomas GALLOIS
Né le 26 Novembre 1986 à Montauban (Tarn-et-Garonne)
JURY
Président : Pr.
Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL
Membres
Directeur : Dr Ludovic FREYBURGER
Maître de Conférences en Immunologie Clinique – Vetagro-sup
Assesseur : Dr Sophie LE PODER
Maître de Conférences en Virologie à l’ENVA
LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT
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* responsable d’unité
REMERCIEMENTS
Au Professeur de la Faculté de Médecine de Créteil,
Qui nous a fait l'honneur d'accepter la présidence de notre jury de thèse,
Hommage respectueux.
À Mr Ludovic FREYBURGER,
Maître de Conférences en Immunologie Clinique – Vetagro-sup,
Pour m'avoir proposé ce sujet,
Pour son soutien, ses conseils précieux, sa disponibilité tout au long de ce travail
Amitiés et très sincères remerciements.
À Mme Sophie LE PODER,
Maître de Conférences en Virologie à l’ENVA
Pour avoir accepté d'être mon assesseur,
Pour ses conseils avisés et sa relecture attentive,
Sincères remerciements.
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION ................................................................................................................ 7
A-
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................... 9
I-
L’IMMUNOSURVEILLANCE PERMET L’ELIMINATION DES CELLULES TUMORALES ....... 11
1-
L’INITIATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ANTI-TUMORALE. ........................................................11
2- LA MISE EN PLACE DE L’IMMUNITE ADAPTATIVE ...............................................................................14
2.1 - LES ANTIGENES TUMORAUX ....................................................................................................14
2.1.1 : LA MISE EN EVIDENCE DES ANTIGENES TUMORAUX .....................................................................14
2.1.2 LES ANTIGENES SPECIFIQUES DE TUMEURS .................................................................................15
2.1.3 LES ANTIGENES ASSOCIES AUX TUMEURS ...................................................................................16
2.2 - LES CELLULES PRESENTATRICES D’ANTIGENES ; DE LA REPONSE INNEE A LA REPONSE ADAPTATIVE .............17
2.2.1 - LA MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES INDUITE PAR UN ANTIGENE ......................................18
2.2.2 – LA MIGRATION DES CELLULES DENDRITIQUES ...........................................................................20
2.2.3 - LA PRESENTATION DES ANTIGENES A LA SURFACE DES CELLULES PRESENTATRICES ...............................21
2.2.4 - LES INTERACTIONS EN CELLULES PRESENTATRICES D’ANTIGENES ET LYMPHOCYTES ..............................24
2.3 - LES LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES, CELLULES EFFECTRICES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE
ANTI TUMORALE ..........................................................................................................................28
2.3.1 : LA VOIE GRANZYME/PERFORINE ............................................................................................29
2.3.2 : LA VOIE FAS-FASL ............................................................................................................30
2.3.3 : AUTRE VOIE POSSIBLE DE MORT CELLULAIRE :............................................................................31
2.4 - LES LYMPHOCYTES T CD4+, PILIERS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ANTI-TUMORALE.............................32
2.4.1 - LA DICHOTOMIE ENTRE SOUS POPULATIONS DE LYMPHOCYTE T CD4 ..............................................33
2.4.2- LE ROLE DES LYMPHOCYTES T CD4+ DANS LA REPONSE IMMUNITAIRE ADAPTATIVE ANTI TUMORALE ......34
2.5- LE ROLE DES ANTICORPS DANS LA REPONSE IMMUNITAIRE ANTI-TUMORALE .........................................35
2.6- LES MECANISMES INTRINSEQUES DE DEFENSE. ..............................................................................36
II-
L’IMMUNOSELECTION MENE A LA PHASE D’EQUILIBRE ...................................................................37
1-
AUTOSUFFISANCE EN FACTEURS DE CROISSANCE ..........................................................................37
2- INSENSIBILITE AUX SIGNAUX ANTIPROLIFERATIFS ..............................................................................38
3- ECHAPPEMENT A L’APOPTOSE ....................................................................................................39
4- POTENTIEL REPLICATIF ILLIMITE ...................................................................................................39
5- DEVELOPPEMENT DE L’ANGIOGENESE ...........................................................................................40
6- L’INVASION DE TISSUS OU METASTASES .........................................................................................40
III-
L’IMMUNO-SUBVERSION MENE AU DEVELOPPEMENT D’UN CANCER. ................................................41
IV-
VISCUM ALBUM FERMENTE : PRESENTATION, MODE D’ACTION ET PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES. ......44
1
1-
PRESENTATION DU VISCUM ALBUM FERMENTE ...........................................................................44
1.1-LE GUI.................................................................................................................................44
1.2- LA COMPOSITION DES EXTRAITS DE VISCUM ALBUM .......................................................................45
1.2.1- LES LECTINES .....................................................................................................................46
1.2.2- LES VISCOTOXINES .............................................................................................................47
1.2.3- LES AUTRES COMPOSANTS ...................................................................................................48
2-
LES PROPRIETES DE VISCUM ALBUM .........................................................................................48
2.1- LES EFFETS CYTOTOXIQUES ET APOPTOTIQUES DE VISCUM ALBUM .....................................................49
2.2- L’ACTIVATION DES LEUCOCYTES ................................................................................................51
2.3- EFFETS IN VITRO SUR LES CELLULES DE L’IMMUNITE ET SUR LES CELLULES PRECURSEURS HEMATOPOÏETIQUES
DE LA MOELLE OSSEUSE .................................................................................................................51
2.4- EFFETS IN VIVO, DES EXTRAITS DE VISCUM ALBUM ET DE VAA-I SUR LES CELLULES DU SYSTEME IMMUNITAIRE
INNE CHEZ LE MODELE ANIMAL, DES VOLONTAIRES SAINS ET DES PATIENTS SOUFFRANT DE CANCER. .................52
2.5- LES PROPRIETES ANTI-ANGIOGENIQUE DE VISCUM ALBUM...............................................................53
3- L’UTILISATION DES ADJUVANTS DANS UN PROCESSUS D’IMMUNISATION ................................................54
B-
TRAVAUX EXPERIMENTAUX ....................................................................................................57
1- PRESENTATION DES TRAVAUX .....................................................................................................57
2- MATERIELS, METHODES ET ANIMAUX : ..........................................................................................57
2.1 SOURIS ET LIGNEES CELLULAIRES.................................................................................................57
2.2 REACTIFS .............................................................................................................................58
2.3 IMMUNISATION .....................................................................................................................58
2.4 PURIFICATION DES CELLULES CD8+ DE LA RATE ..............................................................................60
3-
RESULTATS ........................................................................................................................66
4-
DISCUSSION .......................................................................................................................78
CONCLUSION .................................................................................................................. 81
BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................... 83
2
TABLE DES FIGURES
Figure 1 : Règle des 3E ….................................................................................................................10
Figure 2 : Mécanisme de régulation de la lyse cellulaire par les cellules NK……………………....13
Figure 3 : Obtention de clones CTL anti tumoraux autologues d’après l’expérience de T. Boon….25
Figure 4 : Activation des cellules présentatrices d’antigènes…………………………………….....18
Figure 5 : Modifications morphologiques des cellules dendritiques au cours de leur maturation….20
Figure 6 : Adressage des antigènes endogènes pour une présentation membranaire……………….22
Figure 7 : Présentation du peptide dans une molécule de CMH de classe I………………………...23
Figure 8 : Présentation des différentes voies de présentation de peptides antigéniques…………....24
Figure 9 : Contact entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice d’antigènes………………...25
Figure 10 : Rôle de l’IL-2 comme facteur autocrine dans l’activation des LT……………………..27
Figure 11 : Induction de l’apoptose…………………………………………………………………31
Figure 12 : Dichotomie entre réponses immunes de type Th1 ou Th2…………….………….…….34
Figure 13 : photo de gui sur un pommier…………………………………………………..…….…45
Figure 14 : Schéma de la plaque ELISPOT…………………………………………………….…...64
Figure 15 : Résultats du marquage tétramère du mélange souris OT-1/naïve………………………67
Figure 16 : Visualisation de la plaque de validation………………………………………………..70
Figure 17 : Comptage des immunospots sur la plaque de validation……………………………….71
Figure 18 : Comptage des cellules LT CD8+ spécifiques obtenues pour chaque souris………..….74
Figure 19 : Moyenne de LT CD8+ spécifiques obtenues pour chaque lot……………………..…...75
Figure 20 : Différence entre les lots………………………………………………………………...76
Figure 21 : Dénombrement des immunospots pour chaque souris………………………………….79
3
LISTE DES ABREVIATIONS
ADCC: Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps
ADN: Acide désoxyribonucléique
BSA: Sérum albumine bovine
CAD: Caspase-actived desoxyribonuclease
CCR: Chemokine C-C motif receptor
CD: Cluster of differentiation
CD ou DC: Cellule dendritique ou dendritic cell
CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité
COX-2: Cyclooxygénase 2
CPA: Cellule présentatrice d’antigènes
CTL ou LTC : Lymphocyte T cytotoxique
EGF: Epidermal growth factor
FADD: FAS associating protein with death domain
Fc : Fragment constant des anticorps
IDO: Indoleamine 2-3 dioxygénase
ICAD : Inhibiting caspase-actived desoxyribonuclease
ICAM : Intercellular adhesion molecule
IFN : Interféron
Ig : Immunoglobuline
IL : Interleukine
kD : Kilo-Dalton
KAR : Killer cell activating receptor
KIR: Killer cell inhibitory receptor
MACS: Magnetic cell sorting
ML: Mistletoe lectin
NK: Natural killer cell
PBS: Phosphate buffer saline
PGE2 : Prostaglandine E2
PMA: Phobol myristate acetate
4
REG: Réticulum endoplasmique granuleux
RIP : Protéine inhibant les ribosomes
TAP : Transporters of antigen-processing
TCR : Récepteur des cellules T
TGF : Tumor growth factor
TNF : Tumor necrosis factor
TLR : Récepteur TOLL
VA: Viscum album
VAA: Viscum album agglutinine
VAF: Viscum album fermenté
VEGF: Vascular endothelium growth factor
5
6
INTRODUCTION
D’après les chiffres de l’Institut National du Cancer (E-CANCER, 2011) en 2011, le nombre
de nouveaux diagnostics de cancer en France métropolitaine est estimé à 365 500 pour l’ensemble
de la population, respectivement 207 000 hommes et 158 500 femmes.
Avec 71 000 nouveaux cas, le cancer de la prostate reste de loin le cancer le plus fréquent
chez l’homme, devant le cancer du poumon et le cancer colorectal.
Avec 53 000 nouveaux cas en 2011, le cancer du sein est le plus fréquent chez la femme
devant le cancer colorectal et le cancer du poumon. Entre 1980 et 2005, l’incidence des cancers était
en croissance pour les deux sexes. Des projections d’incidence pour la période 2005-2011
montreraient une diminution de nouveaux cas chez l’homme, mais une augmentation continue chez
la femme.
Cependant, le taux de mortalité par cancer, tous âges et toutes localisations confondus a
diminué depuis 1984. En 2011, le nombre de décès est estimé à 147 500, dont 84 500 hommes et
63 000 femmes.
C’est dans ce contexte que les recherches contre le cancer s’inscrivent. De multiples pistes
sont explorées notamment en immunologie, grâce aux connaissances de plus en plus précises sur la
réponse immunitaire anti-tumorale. En effet, l’immunothérapie est désormais considérée comme la
quatrième modalité thérapeutique après les approches conventionnelles telles que la radiothérapie,
la chimiothérapie et la chirurgie. Les protocoles d’immunothérapie s’orientent vers deux axes :
l’immunothérapie passive qui englobe notamment l’utilisation d’anticorps monoclonaux spécifiques
et le transfert adoptif de lymphocytes effecteurs activés ex vivo, et l’immunothérapie active ou
vaccination, visant à activer les cellules effectrices in vivo. Le premier axe fondé sur l’utilisation
d’anticorps a prouvé son efficacité bien que les effets secondaires soient importants (inflammations
systémiques, et réactions auto-immunes) (MELERO et al., 2007). Quant à l’immunothérapie active,
les résultats cliniques significatifs sont rares, bien que ceux des travaux menés par MOSOLIT et al.
(2005) se veulent positifs. En effet, ils mettent en évidence une corrélation entre la réponse immune
induite par la vaccination et une réponse clinique détectable (MOSOLITS et al., 2005)
7
Pour notre étude, nous nous sommes attardés sur le pouvoir immuno-modulateur d’une plante
en particulier, le gui (Viscum album).
En effet, les extraits de Viscum album sont très utilisés en cancérologie, notamment dans les
pays germanique et en Suisse. Des études ont mis en évidence une amélioration de la qualité de vie
des patients atteints de cancer suite à un traitement à base de Viscum album, en complément des
éléments thérapeutiques classiques contre le cancer (BOCK et al., 2004 ; SCHUMACHER et al.,
2003).
Nous verrons au cours de ce travail que de nombreuses équipes se sont intéressées à cette
plante et ont mis en évidence une efficacité, notamment in vitro, du gui dans l’immunité anti
tumorale. Cette particularité du gui est d’autant plus importante que le système immunitaire est
fréquemment affaibli par le développement tumoral.
Il nous a paru intéressant de tester le pouvoir adjuvant du gui dans un processus de
vaccination. Il ne s’agit ici que de la phase initiale de cette recherche, c’est pourquoi, nous
utiliserons un antigène bien connu pour son effet immunogène : l’ovalbumine. L’objectif principal
de ces travaux consiste à vérifier le pouvoir adjuvant du gui sur l’induction d’une réponse
immunitaire spécifique, et plus particulièrement son impact sur la réponse cellulaire, en réponse à
des immunisations d’ovalbumine.
Dans un premier temps, nous présenterons les différents mécanismes mis en place par
l’organisme dans la lutte anti-tumorale, ainsi que les stratégies employées par les tumeurs pour
échapper au système immunitaire. Nous verrons dans un second temps l’intérêt des adjuvants en
vaccination, et notamment le rôle potentiel de Viscum album sur la réponse immunitaire, décrit in
vitro. Enfin, nos travaux de recherche seront présentés dans la partie expérimentale de la thèse.
8
A-
Etude bibliographique
Durant toute la vie cellulaire, l’acide désoxyribonucléique ou ADN, est soumis à des
agressions. Dans la majeure partie des cas, ces modifications de l’ADN passent inaperçues car des
mécanismes réparateurs corrigent ces défauts. Pourtant, dans de rares cas, une mutation peut
atteindre et modifier la structure d’un gène indispensable dans le contrôle de la multiplication
cellulaire (oncogène ou gène suppresseur de tumeur) (HANAHAN et WEINBERG, 2011). Il s’agit
de la première étape du développement tumoral. Néanmoins, le système immunitaire de l’hôte est
capable de détruire les prémices tumorales. Cependant, celui-ci n’est pas infaillible, laissant alors
les tumeurs se développer.
La découverte de l’immunité anti-tumorale remonte au XIXème siècle, lorsque William
Coley, chirurgien, a constaté des régressions de tumeur chez des malades qui développaient
parallèlement un épisode infectieux (McCARTHY, 2006). Un peu plus tard, d’autres équipes ont
confirmé que l’injection d’extraits de bactéries à des souris pouvait entrainer la nécrose de leur
tumeur : ces substances stimulaient les défenses immunitaires de l’organisme qui, à leur tour,
limitaient la prolifération cancéreuse.
Il est établi que le système immunitaire protège l’organisme des tumeurs. Ce concept est
appelé l’immunosurveillance (ZITVOGEL et al., 2006). L’observation, confirmée par des données
anatomopathologiques de régressions spontanées de tumeurs sont en faveur de ce concept.
De plus, les cancers sont plus fréquents pendant la période néonatale, notamment les
leucémies (plus nombreuses chez les enfants entre 0 et 14 ans) ainsi que chez les sujets âgés
(CANCER RESEARCH UK, 2012), deux périodes de la vie au cours desquelles le système
immunitaire serait moins efficace. Ces maladies sont également plus fréquentes chez les sujets
immunodéprimés.
Le développement tumoral suit la règle des trois E (Figure 1). En effet, la première
correspond à l’élimination. C'est-à-dire que tout le système immunitaire se déploie de manière
efficace pour détruire les cellules tumorales, il s’agit de l’immunosurveillance. Vient ensuite la
phase d’équilibre ; le système immunitaire arrive à contenir le développement des cellules
tumorales, mais celles-ci augmentent progressivement leur capacité à survivre. Cette phase peut
durer pendant des années. Puis vient la phase de l’échappement. À la faveur d’un évènement
9
extérieur : stress, tabagisme, maladie concomitante… le système immunitaire est dépassé, laissant
place alors à la croissance des cellules tumorales. Soit la tumeur est devenue très agressive au point
de dépasser le système immunitaire, soit c’est celui-ci qui s’est affaibli laissant alors la possibilité à
une tumeur moyennement agressive de se développer.
Figure 1 : Schéma de la règle des 3E (Elimination, Equilibre, Echappement), d’après ZITVOGEL
et al.,2006
Nous allons détailler les mécanismes qui se mettent en place, de l’immunosurveillance à
l’apparition du cancer.
10
I- L’immunosurveillance permet l’élimination des
cellules tumorales
A ce stade-là, le système immunitaire repère les cellules anormales et les détruit avant
qu’elles puissent se développer. L’organisme de l’hôte va mettre en place diverses stratégies pour
aboutir à la lyse des cellules tumorales. Détaillons ces mécanismes.
1- L’initiation de la réponse immunitaire anti-tumorale
Les cellules effectrices de l’immunité innée, telles que les cellules présentatrices
d’antigènes, les cellules cytotoxiques naturelles (cellules NK pour Natural Killer), les macrophages,
ont pour mission de détecter et d’écarter les cellules présentant une anomalie, avant que les
effecteurs de l’immunité adaptative n’aient le temps de répondre spécifiquement.
Les cellules NK se développent dans la moelle osseuse à partir d’un précurseur lymphoïde
commun, et circulent dans le sang et les tissus. Plus grandes que les lymphocytes T et B, elles
contiennent des granules cytoplasmiques caractéristiques et sont identifiables sur le plan fonctionnel
par leur capacité de tuer in vitro certaines lignées de cellules tumorales lymphoïdes sans nécessiter
une immunisation ou une activation préalable. Les cellules NK sont appelées ainsi en raison de leur
aptitude à lyser des cellules tumorales ou infectées en l’absence d’immunisation spécifique
préalable. Cette propriété les distingue des autres lymphocytes, tel que les lymphocytes T CD8
cytotoxiques (LT CD8+ ou CTL), qui exercent, par l’intermédiaire de leur récepteur TCR (TCR : T
Cell Receptor), une cytotoxicité spécifique de la cellule visée.
Le mécanisme par lequel les cellules NK tuent les cellules est identique à celui que les
cellules T cytotoxiques du système immunitaire adaptatif utilisent : elles déchargent à la surface de
la cellule cible, des granules cytotoxiques contenant :
- de la perforine (protéine de 70kD). La polymérisation, dépendante du calcium ionisé, de la
perforine donnent naissance à des tubules de polyperforines et est suffisante pour entraîner la lyse
cellulaire ;
11
- des protéoglycanes ;
- des protéases (granzymes) ;
- une cytotoxine similaire au TNF (Tumor Necrosis Factor).
Ce contenu traverse la membrane des cellules cibles et induit la mort cellulaire programmée (LONG
et al., 2013).
Les cellules NK possèdent des molécules CD56 (Cluster of Differentiation) (chez l’homme),
CD16 et NKp46 (chez l’homme et le modèle murin) et n’ont en revanche pas de molécules CD3, les
différenciant ainsi de la famille des lymphocytes T.
Leur fonction est d’éliminer rapidement les cellules anormales (tumorales ou infectieuses),
tout en respectant les cellules saines. Cette faculté résulte d’un équilibre dynamique entre des
signaux activateurs et des signaux inhibiteurs, transmis par des récepteurs membranaires.
Trois familles de récepteurs inhibiteurs ont été identifiées (SANGIOLO, 2011) :
· Ly49, chez la souris ;
· Récepteurs inhibiteurs cytotoxiques (KIRs : Killer Cell Inhibitory Receptors) chez
l’homme ;
· Récepteurs CD49/NKG2A chez l’homme et la souris.
Ces récepteurs sont capables d’inhiber l’activité cytotoxique des cellules NK (figure 2). Ils
sont spécifiques des allèles du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMHI), chez
l’homme. Donc les CMH-I sur les cellules normales sont reconnues par les cellules NK via les
KIRs ou les récepteurs CD49/NKG2A et ceux-ci inhibent alors les signaux des récepteurs
activateurs, protégeant ainsi la cellule saine.
A l’inverse, les cellules NK éliminent les cellules anormales qui n’expriment pas les
molécules de CMH-I ou en faible densité.
Il existe un autre mécanisme dans le cadre de la reconnaissance des cellules tumorales par
les cellules NK. Il implique les récepteurs activateurs (KARs, Killing Activating Receptor) et leurs
ligands. Les ligands tels que H60, Rae, MICA… se trouvent souvent exprimés par les cellules
tumorales, infectées ou « stressées ». Ils se lient aux récepteurs activateurs, et déclenchent ainsi la
cytotoxicité des NK, même si les cellules cibles possèdent des molécules de CMHI.
12
En effet, cette activation est capable de surmonter le signal d’inhibition transmis par les
récepteurs KIR couplés au CMHI. De plus, par cette voie, il a été montré que non seulement la
réponse immunitaire innée est induite, mais également, qu’elle intensifie la réponse immunitaire
adaptative (STRONG, 2002).
Figure 2 : Mécanisme de régulation de lyse cellulaire par les cellules NK
A gauche, les deux récepteurs (KIR et KAR) sont activés mais la balance tend vers l’inactivation de
la lyse, la cellule est alors préservée. A droite, l’absence de récepteur de CMH de classe I, fait
pencher la balance vers l’activation de la lyse, la cellule cible est alors détruite.
Source : http://www.inrp.fr/Acces/biotic/biomol/enjeux/TGS/html/cytoxnk.htm
Les cellules NK synthétisent également des cytokines, en particulier IFN γ, TNF α, IL-10, GMCSF. Elles participent à la régulation de la réponse inflammatoire par le recrutement et l’activation
de macrophages et des cellules dendritiques, ainsi qu’au contrôle du type de réponse adaptative
(Th1 ou Th2).
13
2- La mise en place de l’immunité adaptative
2.1 Les antigènes tumoraux
2.1.1 La mise en évidence des antigènes tumoraux
Les antigènes tumoraux sont produits par les cellules tumorales et déclenchent une réponse
immunitaire dans l’hôte. Ils sont utiles pour identifier les cellules tumorales et sont des candidats
potentiels pour une utilisation dans la thérapie du cancer (CATROS-QUEMENER et al., 2003).
Ils ont été classés en deux principales catégories selon leur expression : les antigènes
spécifiques de la tumeur, qui ne sont présents que sur les cellules tumorales et non pas sur les
cellules saines, et les antigènes associés aux tumeurs, qui sont présents sur certaines cellules
tumorales mais également sur des cellules normales.
La mise en évidence de ces antigènes a été permise par le groupe de T.Boon à Bruxelles en
1992 (ECHCHAKIR et al., 2001) (figure 3). Leurs travaux consistaient à cultiver des cellules issues
d’une biopsie de tumeur primitive, en présence de lymphocytes périphériques du même sujet. Au
cours de cette culture mixte, les lymphocytes reconnaissant des antigènes tumoraux prolifèrent et se
différencient en lymphocytes T cytotoxiques, qui peuvent être clonés. Ces clones sont utilisés pour
sélectionner des sous-populations de cellules tumorales dont les génomes ont pu être comparés.
C’est ainsi que les gènes codant pour ces antigènes ont été identifiés.
14
Figure 3: Obtention de clones CTL anti tumoraux autologues, d’après l’expérience de Boon
Culture de cellules tumorales irradiées provenant d’une biopsie, mélangée à des lymphocytes
circulant du même patient. Les lymphocytes dirigés contre un antigène tumoral prolifèrent et se
différencient. Ils sont alors clonés et testés pour leur capacité à lyser certaines cellules tumorales.
Des sous-populations de cellules tumorales ont ainsi pu être sélectionnées et les gènes codant pour
ces antigènes de « tumeur » ont été identifiés par comparaison des génomes (CATROSQUEMENER et al., 2003).
2.1.2 Les antigènes spécifiques de tumeurs
Ils peuvent être le produit d’un gène normalement présent dans le génome, mais qui ne
s’exprime pas dans la cellule saine. C’est le cas de la famille des gènes MAGE, BAGE (bladder
antigen), GAGE (gastric antigen), RAGE (renal antigen) ou encore de l’α-foetoprotéine. Aucune
expression des gènes MAGE n’est détectable dans les tissus normaux, à l’exception des testicules et
du placenta.
75% des mélanomes expriment au moins un des quatre gènes MAGE. D’après ZHANG et
al. (2010), les gènes MAGE sont localisés dans le chromosome X et sont hautement exprimés dans
de nombreuses tumeurs. Les protéines codées par ces gènes comportent plus de 300 acides aminés,
et les peptides synthétisés à partir de ces protéines peuvent être reconnus par des lymphocytes T
autologues.
15
Il existe également des antigènes partagés par plusieurs types de tumeurs et résultant d’un
défaut de glycosylation. Par exemple, Muc1 est une glycoprotéine transmembranaire fortement
glycosylée qui est abondamment surexprimée à la surface de beaucoup d’adénocarcinome humain.
Il a été démontré que les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont capables de reconnaître les
peptides présentés par des molécules de CMH, issus de Muc1 (BROSSART et al., 2001).
Une mutation ponctuelle peut également conduire à une protéine anormale donnant
naissance à un peptide antigénique. Des oncogènes (ras) ou des gènes suppresseurs de tumeurs
(p53) mutés peuvent ainsi se révéler à la fois oncogéniques et antigéniques. Par exemple, dans 50%
des cancers du colon et 90% des adénocarcinomes pancréatiques, les mutations de ras codent pour
une protéine p21ras connue pour son antigénicité.
2.1.3 Les antigènes associés aux tumeurs
Ces antigènes peuvent être les produits de gènes de différenciation exprimés de façon
limitée par les tissus sains, mais surexprimés ou amplifiés dans les tissus cancéreux.
Il s’agit par exemple de protéines spécifiques des mélanocytes comme la tyrosinase, la
gp100, Melan-A/MART1. Ces protéines se retrouvent de manière surexprimée sur des cellules de
mélanomes. Ces antigènes sont reconnus spécifiquement par des lymphocytes T cytotoxiques
entrainant alors une cytotoxicité envers ces cellules tumorales mais également vers les cellules de
l’organisme qui présentent ces mêmes antigènes (MANDELCORN-MONSON et al., 2003).
Le proto-oncogène HER-2/neu, une tyrosine kinase de 185kDa homologue au récepteur de
l’EGF, est faiblement exprimé dans les cellules normales, et surexprimé dans des cancers de
l’ovaire, du sein, du poumon, du rein et des leucémies aiguës lymphoblastiques.
Il est difficile de prévoir si l’utilisation de ces antigènes dans des protocoles de vaccination
entrainerait des manifestations auto-immunitaires. Cependant, étant donné la faible expression de
ces antigènes dans les tissus normaux, leur reconnaissance par les CTL est peu probable car elle
semble nécessiter un certain niveau d’expression du gène codant l’antigène tumoral (LETHÉ et al.,
1997).
L’identification de nombreux antigènes associés aux tumeurs a beaucoup orienté les essais
vers une stratégie d’immunisation active. Les vaccins contre les cancers ont ainsi suscité un
16
enthousiasme général pour le traitement des tumeurs et plusieurs études ont été menées ou sont en
cours. Cependant, les réponses cliniques significatives sont rares. Néanmoins, une induction de
cellules T spécifiques de la tumeur chez des patients vaccinés a été observée. De plus, les vaccins
développés sont généralement peu toxiques. En effet, les maladies auto-immunes ne sont pas
systématiquement induites : elles se limitent à l’apparition de vitiligo chez des patients atteints de
mélanome (DUDLEY et al., 2002). Le faible taux de réponse à la vaccination peut, par ailleurs
s’expliquer par le fait que les essais, pour des raisons éthiques, sont réalisés sur des patients traités
préalablement par chimiothérapie et donc souvent porteurs de tumeurs particulièrement agressives
et résistantes. De plus, le statut immunitaire du malade est souvent altéré par des traitements
cytotoxiques. Le choix de la mise en place d’une immunothérapie devra donc se faire en fonction
du stade de la maladie ainsi que du statut immunitaire du patient, en complément d’autres thérapies
conventionnelles.
Les antigènes tumoraux, quelle que soit leur origine, doivent être présentés aux cellules de
l’immunité pour que celles-ci deviennent effectrices. En effet, les cellules de l’immunité, non
stimulées, sont au « repos ». Lorsqu’elles sont stimulées, elles s’activent pour aboutir à une réponse
efficace et surtout spécifiquement ciblée vers l’antigène présenté. La présentation a lieu par
l’intermédiaire de cellules dites « présentatrices d’antigènes ».
2.2
Les cellules présentatrices d’antigènes ; de la réponse innée à la
réponse adaptative
L’activation des cellules spécialisées dans la présentation de l’antigène constitue la première
étape indispensable à l’induction de l’immunité adaptative.
Ces cellules se situent dans les tissus, telles des sentinelles (figure 4) : lorsqu’elles captent
un antigène, elles sont activées et migrent vers le nœud lymphatique drainant le tissu.
17
Figure 4 : activation des cellules présentatrices d’antigènes
Les cellules CPA (ici une cellule dendritique) sont présentes dans les tissus. Lorsqu’elles
sont en présence de pathogènes ou de cellules tumorales ou infectées, elles sont activées et migrent
vers le nœud lymphatique le plus proche. Elles présentent à leur surface, un peptide provenant du
pathogène, qui sera reconnu par les cellules T naïfs, qui à leur tour s’activeront. (JANEWAY et
TRAVERS, 2003).
Celles-ci sont principalement constituées par les cellules dendritiques (CD), les
macrophages et les cellules B. Toutes sont issues de la moelle osseuse. Les macrophages capturent
efficacement les antigènes sous forme de particules comme les bactéries. Les agents infectieux
augmentent l’expression par ces cellules de molécules du CMH de classe II et de molécules de
costimulation. La capacité unique des cellules B de reconnaître et d’ingérer les antigènes protéiques
solubles grâce à leurs récepteurs est très importante pour activer les cellules T reconnaissant ce type
d’antigènes, les molécules de costimulation étant aussi induites sur les cellules B.
Parmi ces trois types cellulaires, les cellules dendritiques sont considérées comme les plus
stimulantes parce qu’elles sont capables d’activer des lymphocytes T naïfs.
2.2.1 La maturation des cellules dendritiques induite par un antigène
Il s’agit de cellules phagocytaires spécialisées résidant dans la plupart des tissus. Elles ont
une durée de vie relativement longue et un faible taux de renouvellement. Elles dérivent du même
précurseur de la moelle osseuse que les macrophages et migrent de la moelle osseuse vers des sites
18
périphériques. Elles sont considérées comme les « cellules sentinelles » du système immunitaire. En
effet, de par leur localisation préférentielle au niveau des différentes muqueuses, elles sont les
premières en contact avec les pathogènes ou les protéines étrangères introduites dans l’organisme.
Les cellules dendritiques immatures ont pour fonction majeure, la capture antigénique, c’est
pourquoi elles se trouvent dans les tissus. Avant leur maturation, elles ne présentent à leur surface
que peu de molécules CMH de classe II, peu de molécules de costimulation (B7 (CD80/86), CD40)
et peu de molécules d’adhésion (CD54, CD58) (TARTOUR et LEE, 2004).
Néanmoins, leur capacité à capturer des antigènes via la phagocytose, l’endocytose ou
encore la macropinocytose est élevée, notamment grâce à la présence de nombreux récepteurs à leur
surface. En effet, on retrouve des récepteurs du mannose qui peuvent se lier à de nombreuses
glycoprotéines mannosylées exprimées par de multiples microorganismes, des récepteurs pour le
fragment constant Fc des immunoglobulines, facilitant ainsi la capture de complexe immun, des
récepteurs « scavengers » qui se lient aux lipoprotéines modifiées permettant leur phagocytose, des
récepteurs pour les corps apoptotiques… L’internalisation de l’antigène est un processus propre aux
cellules dendritiques immatures qui diminue au cours de leur maturation (TARTOUR et LEE,
2004).
Les propriétés d’endocytose, de macropinocytose ou de phagocytose sont perdues lorsque
les cellules dendritiques deviennent matures avec notamment une diminution de l’expression des
récepteurs spécifiques de l’endocytose et de la phagocytose.
Une fois l’antigène capté, sous l’influence de signaux inflammatoires locaux telle la
production de cytokines TNFα), ces cellules dendritiques immatures vont migrer via les vaisseaux
lymphatiques vers les zones T des nœuds lymphatiques (cortex profond). Elles présentent alors les
peptides antigéniques associés aux molécules CMH de classe I ou de classe II aux lymphocytes T
CD4 ou CD8. Par ailleurs, elles développent de longs prolongements cytoplasmiques (dendrites)
permettant un contact étroit avec de nombreux lymphocytes T. Ces cellules sont alors appelées
cellules inter digitées (TARTOUR et LEE, 2004). Lors de la maturation, des modifications
intracellulaires ont également lieu. L’environnement inflammatoire autour des cellules dendritiques
conditionne les organites. Par exemple, dans les cellules de l’immunité il existe des protéasomes
dont le rôle est de cliver les peptides antigéniques pour faciliter ensuite leur présentation à la surface
des cellules immunitaires. Lors de la maturation des cellules dendritiques, il y a non seulement les
protéasomes constitutifs mais également des immunoprotéasome qui contiennent des sous-unités
spécialisées qui modifient la quantité et le répertoire des peptides générés. Les sous-unités
spécialisées changent le profil du clivage effectué par le protéasome, lui faisant produire des
19
peptides plus longs qui sont transportés plus efficacement dans le but de produire un spectre plus
vaste de peptides antigéniques que celui généré à partir des produits d’un protéasome constitutifs
(GOLDBERG et al., 2002).
Les cellules dendritiques orchestrent donc les différents acteurs de l’immunité et de ce fait
font le lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative.
Une reconnaissance est visuellement possible entre cellule dendritique mature et immature,
car la morphologie de la cellule change au cours de la maturation (figure 5).
Figure 5: Modification morphologique des cellules dendritiques au cours de leur
maturation
Deux cellules dendritiques immatures (à gauche) et une cellule mature (à droite).
Source : Dossier Pour La Science « Les défenses de l’organisme » Octobre 2000.
2.2.2 La migration des cellules dendritiques
Les agents pathogènes ou les cellules tumorales envahissent les tissus périphériques alors
que les lymphocytes sont concentrés dans les organes lymphoïdes secondaires. Les cellules
dendritiques, grâce à leur propriété de migration au cours de la maturation, font le lien entre la
périphérie et les organes lymphoïdes. La bonne coordination entre la maturation et la migration des
cellules dendritiques est une étape clé de la sensibilisation des lymphocytes. L’activation des
cellules dendritiques est suivie d’un changement radical dans le répertoire des récepteurs de
chimiokines qu’elles expriment, et ce changement permet leur migration de la périphérie vers les
nœuds lymphatiques de drainage. En effet, la maturation est associée à la diminution d’expression
20
des récepteurs de chimiokines inflammatoires et à l’expression de CCR7. Ce récepteur reconnait
deux chimiokines, CCL19 et CCL21, qui sont sécrétées dans les zones riches en lymphocytes T des
organes lymphoïdes secondaires. Les cellules dendritiques quittent ainsi les tissus inflammatoires et
entrent dans la circulation lymphatique qui les conduit vers les nœuds lymphatiques de drainage.
CCR7 est le récepteur principal qui oriente la mobilisation des cellules dendritiques vers les
compartiments riches en lymphocytes T des nœuds lymphatiques.
2.2.3 La présentation des antigènes à la surface des cellules présentatrices
Les cellules dendritiques matures sont dévolues à la présentation de l’antigène. Elles le
deviennent après avoir reçues « un signal de danger » le plus souvent issu de la réponse innée
(sécrétion de cytokines…). Les cellules dendritiques matures ont des propriétés de phagocytose
diminuées cependant, elles ont une capacité de présentation très forte, obtenue grâce à une
importante expression de molécules de CMH et de costimulation (CD80, CD86, CD40).
La cellule dendritique ainsi activée et mature, se différencie en cellule présentatrice
d’antigène. La présentation des antigènes est complexe. Prenons l’exemple de protéines d’origine
tumorale précédemment citées :
Les protéines MAGE, BAGE et GAGE une fois internalisées, sont coupées en peptides par
des polypeptides de faible poids moléculaire (LMP) du protéasome, et sont transportés dans la
lumière du réticulum endoplasmique par des pompes appelées TAP (Transporters of AntigenProcessing). Les sous-unités des immunoprotéasomes potentialisent ces étapes en clivant
différemment les peptides de telle sorte à avoir une taille plus importante et un transport plus
efficaces. Les peptides antigéniques interagissent ensuite avec des molécules du complexe majeur
d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) pour former un complexe, qui est exprimé à la surface des
cellules tumorales via l’appareil de Golgi (figure 6).
Les lymphocytes T cytotoxiques peuvent reconnaître ces complexes à la surface des cellules
par interactions avec leurs récepteurs TCR pour activer leurs fonctions de destruction.
21
Figure 6 : Adressage des antigènes endogènes pour une présentation membranaire.
Les peptides issus du protéasome, ainsi que certains petits peptides cytosoliques d’origine
lysosomiale, sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique granuleux (REG) par un
complexe de transport TAP (transporter-associated with antigen processing). Les molécules de
classe I synthétisées dans le REG accueillent les peptides qui y sont transférés. Cette association est
complétée par la fixation de β2-microglobuline (β2-m) et est chaperonnée par des protéines
d’adressage (HSP). Les peptides associés aux molécules CMH-I sont ensuite véhiculés dans des
vésicules recouvertes de coatomères (manteau impliqué dans la formation des vésicules adressées
au réticulum endoplasmique) qui empruntent le flux vectoriel permanent. Ils se positionnent à la
surface cellulaire par un mécanisme d’exocytose constitutive (CATROS-QUEMENER et al., 2003).
Rappelons que la molécule de CMH de classe I est un hétérodimère comprenant une chaîne
α transmembranaire (poids moléculaire 43kDa) liée de façon non covalente à la β2-micro globuline
(12kDa), qui ne traverse pas la membrane (figure 7).
La chaîne α se replie en trois domaines α1, α2, α3. Les domaines α3 et β, sont repliés de
façon similaire, alors qu’α1 et α2 forment un sillon, constituant le site dans lequel les antigènes
peptidiques se lient aux molécules du CMH.
22
Figure 7: Présentation du peptide dans une molécule de CMH de classe I.
Le peptide est présenté dans le sillon du complexe de CMH I formé par les domaines α1 et
α2 de la chaîne α (JANEWAY et TRAVERS, 2003).
Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) présentent également à leur surface des
molécules du CMH de classe II. La présentation des peptides exogènes par les molécules de CMHII conduit à l’activation des lymphocytes T CD4 spécifiques de ces antigènes.
La molécule de CMH de classe II, quant à elle, est composée de deux chaines de
glycoprotéines transmembranaires, α (34kDa) et β (29kda). Chaque chaine comporte deux
domaines, les deux chaines formant une structure compacte, de quatre domaines, semblable à celle
de la molécule de classe I. Le site de liaison est formé par la chaine α1 et la chaine β1 qui ne sont
pas jointes par une liaison covalente.
Cependant, les CPA ont la capacité de présenter des peptides issus d’antigènes exogènes par
leur CMH de classe I et non de classe II comme les autres cellules de l’organisme, selon un procédé
appelé « présentation croisée » (figure 8).
Les peptides présentés par ce biais, conduisent à l’activation des lymphocytes T CD8 avec
ou sans l’aide des lymphocytes T CD4 spécifiques.
23
Figure 8 : présentation des différentes voies de présentation de peptides antigéniques.
La présentation croisée permet aux cellules présentatrices d’antigènes de porter sur le
CMH de classe I, des peptides antigènes d’origine exogène. Cela permet l’activation de cellules T
CD8+, indépendamment de l’aide des CD4+, même si une costimulation entre eux existe. Source :
HEALTH et CARBONE, 2001.
La reconnaissance du complexe CMH-peptide par le TCR spécifique du peptide présenté,
constitue un premier signal de l’activation des lymphocytes T.
2.2.4
Les
interactions
en
cellules
présentatrices
d’antigènes
et
lymphocytes
L’adhésion repose sur des interactions entre molécules spécifiques. Ces molécules se
classent en cinq grandes familles, dont la superfamille des immunoglobulines (ICAM-1, PECAM-1
et CD2), les intégrines (LFA-1, MAC-1 et VLA-4), les sélectines (CD62L, CD62P et CD62E), les
mucines (CD43, PSGL-1) et les cadhérines. La liaison initiale constitue la première étape de
l’adhérence cellulaire. La durée de la liaison dépend de la nature de celle-ci et des forces appliquées
(SEDWICK et al., 1999).
Le contact entre lymphocyte T et CPA fait intervenir des interactions entre la molécule
d’intégrine LFA-1 du LT et son ligand ICAM-1 sur la cellule présentatrice d’antigène. Or ces
molécules présentent une affinité modérée l’une pour l’autre. La liaison est cependant suffisamment
stable pour instaurer la reconnaissance du TCR au CMH. Suite à cette reconnaissance un signal
d’activation est induit conduisant alors à un changement de conformation de l’intégrine LFA-1.
24
L’affinité entre la nouvelle conformation de LFA-1 et son ligand ICAM-1 est alors nettement
supérieure. L’interaction est alors prolongée (figure 9).
Figure 9 : Contact entre un lymphocyte, en jaune, et une cellule présentatrice d’antigène
(cellule dendritique), en bleu.
Ce contact peut mener à la création d’une synapse immunologique. Microscopie
électronique à balayage (SCHWARTZ, 2012).
Cependant, la reconnaissance seule du complexe CMH-peptide-TCR est encore insuffisante
pour induire une activation fonctionnelle des lymphocytes T. En effet, le signal doit être renforcé
par un deuxième, issu des molécules de costimulation.
Les molécules de costimulation les plus importantes sont B7a et B7b (CD80 et CD86
appelées B7). Ces molécules s’ancrent sur le CD28 porté à la surface du lymphocyte T.
Le signal induit, permet à la cellule T d’entrer dans un nouveau cycle cellulaire. L’entrée en
phase G1 de la cellule T fraîchement activée permet d’obtenir rapidement une prolifération de
clones, spécifiques du peptide antigénique qui se différencieront ensuite en cellules effectrices.
Ce phénomène de prolifération et de différenciation est contrôlé par une cytokine, IL-2 qui
est produite par la cellule T elle-même. Parallèlement à son entrée en phase G1, la cellule T
synthétise de l’IL-2 ainsi que la chaine α du récepteur à IL-2. Celui-ci est composé de trois chaînes
α, β et γ. Les cellules T au repos expriment un récepteur composé des chaines β et γ qui fixe IL-2
25
avec une faible affinité ; il permet aux cellules T au repos de répondre aux fortes concentrations
d’IL-2. L’association de la chaîne α avec les chaînes β et γ forme un récepteur de plus haute affinité
pour l’IL-2, ce qui permet à la cellule T de répondre à de très faibles concentrations d’IL-2. La
fixation de cette cytokine sur son récepteur de haute affinité permet la progression de la cellule dans
le cycle cellulaire.
Cependant, ce mécanisme est très finement régulé et implique une synapse immunologique
stable entre la CPA et le lymphocyte T. La liaison avec la molécule de costimulation CD28 sur B7
prend toute son importance ; la reconnaissance de l’antigène par le récepteur de la cellule T induit
également la synthèse de différents facteurs de transcription. Un de ces facteurs, facteur nucléaire
des cellules T activées (NFAT), se fixe sur le promoteur du gène de l’IL-2 ; il est indispensable
pour activer la transcription du gène. Cependant, la transcription du gène ne permet pas à elle seule
la production d’IL-2, qui nécessite en plus la fixation de CD 28 sur B7. Un des effets de la
signalisation par CD28 semble être la stabilisation de l’ARNm de l’IL-2. Les ARNm des cytokines
ont une vie très courte à cause d’une séquence « d’instabilité » dans leur région 3’ non traduite.
Cette instabilité empêche une production et une libération soutenue de cytokines et permet de
réguler très finement l’activité de ces cytokines (JAIN et al., 1995 ; CERDAN et al., 1995). La
stabilisation de l’ARNm de l’IL-2 augmente sa synthèse de 20 à 30 fois. Un autre effet de la liaison
de CD28 est l’activation de facteurs de transcription (AP-1 et NFκB), ce qui augmente la
transcription du gène de l’IL-2 d’environ 3 fois. Ces deux mécanismes permettent donc une
amplification d’environ 100 fois de la production d’IL-2 (FRASER et al., 1991) (figure 10).
26
Figure 10 : Rôle de l’interleukine 2 comme facteur autocrine dans l’activation des
lymphocytes T
En entrant dans la cellule T, celle-ci exprime la chaine α du récepteur à IL-2 qui permet
d’augmenter l’affinité du récepteur. L’association du récepteur permet de répondre massivement à
IL-2 conduisant alors à la prolifération cellulaire. Source : Kenneth, 2011.
Néanmoins, la cellule présentatrice d’antigènes exprime peu de molécules de costimulation
B7. En effet, pour une expression optimale de B7 (CD80 et CD86) par la CPA, comme certaines
autres molécules de costimulation, la cellule présentatrice d’antigène doit recevoir une stimulation
via ses récepteurs CD40, des lymphocytes T CD4+ qui possèdent à leur surface le ligand CD40L. Il
s’agit d’une activation réciproque entre les deux cellules.
La cellule dendritique stimule donc la cellule T CD4 qui, à son tour, l’active via le CD 40L.
La cellule dendritique ainsi activée, exprime davantage de B7 à sa surface, favorisant ainsi la liaison
avec la cellule T CD8+ voisine. En effet, l’activation des LT CD8+ nécessite des signaux de
costimulations plus forts que pour les LT CD4, donc une expression élevée de molécules B7 leur est
favorable.
On pensait que les deux lymphocytes, CD4+ et CD8+, devaient se positionner à proximité
sur la même cellule dendritique pour rendre cette activation possible. Or, la probabilité que ces rares
cellules se trouvent sur la même cellule dendritique est si faible que cette théorie s’est effondrée. On
pense maintenant que les LT CD4+ ont la capacité via CD40L d’activer plusieurs cellules
27
dendritiques qui pourront ainsi accroître l’activation des LT CD8+. Ce phénomène permet de plus,
une amplification de la réponse immune. Cette théorie a été prouvée in vitro, mais est difficilement
vérifiable in vivo (CASTELLINO et GERMAIN, 2006).
Des cytokines sont également synthétisées par la CPA et sont impliquées dans la
différenciation des cellules T CD4+. En effet, la libération d’IL-12 et d’IFN γ par la CPA crée un
environnement favorable à une réponse TH1, alors que la sécrétion d’IL-4 tend vers une réponse
TH2.
La synthèse de TGF-β par la CPA, amène à une différenciation en cellule T régulatrice,
libérant ainsi du TGF-β et de l’IL-10. Cette dernière différenciation sera reprise par les cellules
tumorales dans l’échappement à la réponse immunitaire.
Enfin, la régulation de la prolifération des lymphocytes T s’effectue grâce à une molécule
analogue à CD28. Il s’agit de CD 152. Celle-ci s’exprime plus tardivement après l’activation des
lymphocytes T et partage avec CD28 la reconnaissance des ligands B7. Le CD 152 joue un rôle
opposé par rapport au CD 28. Cette liaison, dont l’affinité est beaucoup plus forte, envoie un signal
inhibiteur au lymphocyte T activé qui limite alors sa prolifération induite au préalable par l’antigène
spécifique (CARRENO et al., 2000).
2.3 Les lymphocytes T cytotoxiques, cellules effectrices de la réponse
immunitaire adaptative anti tumorale
Les lymphocytes T CD8+ possèdent à leur surface un marqueur nommé CD8 qui se lie à des
sous-unités alpha-2 de la molécule de CMH de classe I.
Suite à leur activation par les CPA et à leur prolifération, les lymphocytes T CD8+ naïfs se
différencient en cellules effectrices cytotoxiques ou en cellules mémoires.
Les molécules d’adhérence jouent un rôle dans la cytotoxicité des LT CD8+. En effet, la
phase initiale de l’interaction des LT CD8+ avec leurs cellules cibles est faite grâce aux molécules
d’adhésion non spécifiques (LFA-1, ICAM). Si aucune interaction spécifique (CMH-peptide-TCR)
n’a lieu, alors les cellules se détachent. En revanche, s’il y a reconnaissance, alors la stabilité permet
le relargage de molécules cytotoxiques.
28
L’effet cytotoxique des lymphocytes T CD8+ effecteurs est la principale fonction du
système immunitaire adaptatif contre les tumeurs. Les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques sont
efficaces en déclenchant l’apoptose ou la nécrose des cellules cibles via de multiples voies de lyse.
2.3.1 La voie granzyme/perforine
Ce mécanisme se met en place dès lors qu’une synapse immunologique est formée. À la
suite de cet engagement, on note des réorganisations importantes du cytosquelette d’actine : en
effet, le centre organisateur des microtubules se réoriente vers la synapse. De plus, il intervient dans
la dispersion des molécules de signalisation, dans la relocalisation de l’appareil sécrétoire et dans la
libération polarisée des lymphokines et des granules cytolytiques dans l’espace délimité par la
synapse (KUHN et POENIE, 2002).
Les protéines et les enzymes effectrices cytotoxiques qui induisent l’apoptose sont stockées
dans ces granules. Parmi celles-ci, la perforine et les granzymes (granzymes A et B) sont les plus
connus.
La perforine est capable de se polymériser en présence de calcium pour former des pores à
travers la membrane des cibles, cependant la fonction précise de ces pores n’est pas encore clarifiée.
L’entrée d’eau et de sels pourrait participer à la mort de la cellule. En effet, lorsque
l’intégrité de la membrane cellulaire est détruite, la cellule meurt.
On pensait que les granzymes ne pénétraient dans les cellules cibles qu’à partir de ces pores
transmembranaires, or ce concept a été bouleversé par l’internalisation du granzyme B dans la
cellule cible en l’absence de perforine. Le récepteur du granzyme B à la surface membranaire entre
par endocytose dans la cellule cible. C’est celui-ci qui a été identifié (MOTYKA et al., 2000).
Les granzymes sont des protéases. Donc, bien qu’ils contribuent à l’induction de l’apoptose
de la cellule cible, ils ne peuvent pas fragmenter directement l’ADN. Ils doivent activer, dans la
cellule cible, une enzyme ou plus exactement une cascade enzymatique.
Le granzyme B peut cliver l’enzyme cellulaire ubiquitaire CPP-32. On pense qu’il joue un
rôle clé dans la mort cellulaire programmée de toutes les cellules. En effet, CPP-32 est une caspase
qui active une nucléase, appelé CAD (« caspase-activated desoxyribonuclease), en clivant sa
protéine inhibitrice ICAD qui maintient la désoxyribonucléase sous forme inactive. Il semblerait
que cette enzyme soit l’effecteur final de la dégradation apoptotique de l’ADN.
29
De nombreuses autres protéines sont présentes dans les granules d’exocytose des CTL et
possèdent aussi leur rôle dans l’activité cytotoxique. Parmi ces protéines, il est important de citer la
granulysine, une protéine toxique qui détruit directement les membranes bactériennes et induit
l’apoptose de lignées tumorales in vitro (WANG et al., 2000).
2.3.2 La voie FAS-FASL
La libération du contenu des granules est responsable de la grande partie de l’activité
cytotoxique des cellules T CD8+ effectrices, comme le montrent les souris rendues déficientes en
perforine ; elles ont perdu la majeure partie de leur activité cytotoxique (KAGI et al., 1996). La
cytotoxicité induite par les granules est strictement dépendante du calcium. Cependant, une certaine
activité cytotoxique des cellules T CD8+ persiste après déplétion calcique. Cela suggère qu’il existe
un second mécanisme de cytotoxicité indépendant de la perforine.
Cette voie ne dépend donc pas de la perforine, ni du calcium, bien que celui-ci soit
nécessaire pour la synthèse et la mobilisation intracellulaire du ligand FAS (FAS-L). Détaillons le
mécanisme apoptotique (figure 11).
Les CTL expriment à leur surface des molécules qui appartiennent à la superfamille du TNF
et qui sont actives sous forme de trimère appelé FAS-L. Ces molécules ciblent les récepteurs FAS.
Cette liaison entraîne un changement de conformation de FAS, aboutissant à la formation des
domaines de mort (FADD). Ceux-ci se lient à des protéines adaptatrices activant alors la procaspase 8 en caspase 8 active.
A partir de là, deux voies sont possibles :
-
soit la voie directe ; la caspase 8 activée abouti à une cascade d’activation de caspases
qui activent directement la caspase 3.
-
Soit la voie indirecte ; la caspase 8 activée peut, par l’intermédiaire d’un clivage d’une
protéine pro-apoptotique Bid, relocaliser une protéine nommée BAX sur la membrane
mitochondriale libérant ainsi le cytochrome C (LUO et al., 1998). Celui-ci, va interagir
sur des caspases aboutissant à la caspase 3 activée.
30
Dès lors que la caspase 3 est activée, quelle que soit la voie d’activation, elle va cliver
l’inhibiteur des protéines CAD (Caspase Activated DNase) qui seront alors libérées dans le
cytoplasme. Ces dernières migrent dans le noyau et dégradent l’ADN de la cellule.
Figure 11 : Induction de l’apoptose
Suite à la liaison FAS-FASL, les domaines de mort activent la caspase 8 qui, soit est
introduite dans une cascade de réaction aboutissant à la caspase 3, soit va libérer le cytochrome C
par l’intermédiaire de molécules de la membrane mitochondriale. La libération du cytochrome C
active à son tour des caspases jusqu’à l’obtention de la caspase 3. D’après Nature reviews
immunology June 2002
2.3.3 Autre voie possible de mort cellulaire
Les CTLs peuvent aussi exprimer leur cytotoxicité par la sécrétion de cytokines comme
l’IFN-γ, le TNF-α et le TNF-β qui contribuent à la défense anti-tumorale par différents mécanismes.
L’IFN-γ, souvent associé au TNF, peut avoir une activité cytotoxique directe contre certaines
tumeurs d’après les études réalisées par FRANSEN et al. (1986).
31
Il inhibe la prolifération des cellules tumorales, active également les macrophages et induit
une augmentation de l’expression des molécules de CMH améliorant ainsi la reconnaissance des
antigènes par les CTL (GREENBERG, 1991).
Une voie similaire à celle du récepteur Fas, mais néanmoins distincte, est utilisée par le
récepteur 1 au TNF-α. Dans certaines cellules, la signalisation par le récepteur du TNF induit
l’apoptose, alors que dans d’autres, elle conduit à l’expression de gènes de réaction inflammatoire.
On ignore encore ce qui détermine le choix entre l’apoptose ou l’activation de la transcription
génique.
Si l’IFN-γ est connu pour intervenir dans la cytotoxicité anti-tumorale, on notera par ailleurs
que cette cytokine est impliquée dans l’inhibition de l’angiogénèse tumorale (SCHRODER et al.,
2004), or celle-ci est indispensable au développement des cellules tumorales.
2.4
Les lymphocytes T CD4+, piliers de la réponse immunitaire anti-
tumorale
De nombreuses études se sont concentrées sur le rôle des CD8+, car la majorité des tumeurs
expriment les molécules de CMH de classe I et non de CMH de classe II. De plus, les LT CD8+
sont capables de lyser directement les cellules tumorales via la reconnaissance des complexes TCRpeptide-CMH, et leur capacité à éradiquer de larges masses tumorales in vivo a été démontrée.
Depuis peu, des études se sont attardées sur le rôle des cellules T CD4+ dans l’immunité
antiumorale (TOES et al., 1999).
Les cellules T CD4+ possèdent un marqueur nommé CD4 qui se fixe sur la chaine β de la
molécule de CMH de classe II. CD4 est une molécule simple chaîne composée de quatre domaines
immunoglobuline.
Les cellules T CD4+ donnent lieu dans la première phase de différenciation à un précurseur
nommé Th0. Celui-ci donnera, en fonction de l’environnement proche, différentes sous-populations
de cellules T CD4+.
32
2.4.1 La dichotomie entre sous populations de lymphocyte T CD4
Les lymphocytes T CD4+ peuvent se différencier en plusieurs sous-populations Th1, Th2 et
Th17, dont les deux plus connues sont les Th1 et Th2 (figure 12).
Les éléments qui déterminent si une cellule T CD4+ va se différencier en Th1 ou Th2 ne
sont pas encore entièrement connus. Les cytokines induites par certains agents infectieux, les
molécules de costimulation utilisées pour induire la réponse et la nature du complexe CMH-peptide
jouent un rôle dans ce mécanisme.
En particulier, la décision de se différencier en Th1 plutôt qu’en Th2 se prenant précocement
au cours de la réponse immunitaire, les cytokines produites en réponse au pathogène par les cellules
de l’immunité innée jouent un rôle important dans l’orientation de la réponse immunitaire
adaptative. Les conséquences de l’orientation vers Th1 plutôt que Th2 sont importantes : les
cellules Th1 sécrétant principalement de l’IFN-γ, de l’IL-2, du TNF-α et du TNF-β conduisent à
une immunité de type cellulaire. Elles jouent un rôle dans l’activation des cellules NK, dans
l’amplification des macrophages et dans la différenciation des cellules cytolytiques. Tandis que les
cellules Th2 produisent préférentiellement de l’IL-4, de l’IL-5 et de l’IL-10, de l’IL-13 et du TGF-β
et mènent plutôt à une immunité de type humorale. Elles ont pour rôle d’activer les lymphocytes B,
d’induire la sécrétion d’immunoglobulines, d’activer les mastocytes et les éosinophiles. La voie Th2
est antagoniste de la Th1 par l’intermédiaire de l’IL-4.
Ces populations Th1 et Th2 dérivent d’un précurseur commun appelé Th0. En présence
d’IL-12 sécrétée par des macrophages et des cellules dendritiques, les cellules Th0 vont se
différencier en lymphocytes Th1, tandis qu’un environnement riche en IL-4, les lymphocytes se
différencient en Th2.
33
Figure 12 : Dichotomie entre réponses immunes de type Th1 et Th2
Lors de la sensibilisation par un alloantigène, les lymphocytes CD4+ peuvent se différencier
soit en lymphocytes Th1, produisant de l’IFN-γ, du TNF-α et de l’IL-2, soit en lymphocytes Th2,
produisant de l’IL-4, de l’IL-5, de l’IL-9 et de l’IL-13 (SEDLIK et al., 1996).
Il existe une autre sous population de lymphocytes T, appelés T régulateurs. Après leur
activation, ils sécrètent des quantités élevées de cytokines immunosuppressives comme l’IL-10 ou
le TGF-β.
2.4.2 Le rôle des lymphocytes T CD4+ dans la réponse immunitaire
adaptative anti tumorale
Les LT CD4+, activés par la reconnaissance de l’antigène présenté par les CPA via le CMH
de classe II, vont permettre l’activation des lymphocytes CD8+ via les interactions CD40/CD40L
entre LT CD4+ et CPA, comme décrit plus haut.
En dehors de ce rôle, les cellules T CD4+ sont essentielles dans le maintien de la
prolifération et des fonctions des cellules effectrices T CD8+, par l’intermédiaire de la sécrétion de
cytokines dont IL-2, qui est la plus connue. Cette cytokine participe à la différenciation et à la
survie des CTL, elle contribue à leur protection contre l’apoptose et l’anergie, au maintien de leur
capacité cytotoxique et au support de la production de cytokines (FEARON et al., 1990).
34
De plus, une activation directe des CTL par les T CD4+ a été récemment découverte. La
prolifération et les fonctions cytolytiques des CTL peuvent être augmentées par les LT CD4+ via
des signaux de costimulations transmis par des molécules de surface. Les récepteurs de
costimulation tels que CD27, CD134 et le CMH de classe II, portés à la surface des CTL, sont
capables d’interagir directement avec les ligands correspondants à la surface des LT CD4+,
permettant alors une élévation de la croissance et de la survie des CTL durant la phase effectrice de
la réponse immunitaire anti tumorale (CASTELLINO et GERMAIN, 2006 ; GIUNTOLI et al.,
2002). Plusieurs expériences ont mis en évidence le rôle majeur des cellules T CD4+ dans la
réponse immunitaire anti tumorale. Une régression tumorale a été permise en l’absence de
lymphocytes T CD8+, lymphocytes B et de cellules NK (LUNDIN et al., 2003).
De plus, l’IFN-γ, sécrété par les cellules T CD4+ pourrait être impliqué dans les activités
anti tumorales et dans la destruction de la vascularisation tumorale (QIN et BLANKENSTEIN,
2000).
2.5
Le rôle des anticorps dans la réponse immunitaire anti-tumorale
Le rôle de la réponse humorale naturelle contre les tumeurs n’est pas clairement établi. Par
contre, depuis le début du XXIème siècle, le succès des anticorps thérapeutiques en cancérologie a
constitué une avancée thérapeutique majeure. Ainsi, des anticorps contre le facteur de croissance de
l’endothélium vasculaire (VEGF), ou contre l’antigène tumoral Her2/neu, par exemple, ont
démontré leur efficacité et sont prescrits pour le traitement de nombreuses tumeurs.
Il est admis que leurs mécanismes d’actions mettent en jeu le recrutement d’effecteurs et de
molécules du système immunitaire.
Ainsi, lorsque l’anticorps s’est fixé sur sa cellule cible tumorale, il peut entraîner une lyse de
la cellule par un mécanisme de cytotoxicité cellulaire dépendante d’anticorps (ADCC)
correspondant à la fixation de la portion constante Fc de l’anticorps sur un récepteur activateur du
fragment constant FcR, exprimé par des macrophages ou des cellules NK. Les anticorps d’isotypes
IgG1 et IgG3 sont les plus efficaces pour cette activité.
35
Par ailleurs, la liaison de l’anticorps par son fragment AB (Fab) sur des antigènes de la
cellule tumorale peut entraîner la fixation de la protéine C1q sur le fragment Fc de l’anticorps,
suivie par la cascade d’activation des protéines de la voie classique du complément, pour aboutir à
la formation du complexe d’attaque membranaire capable de lyser la cellule tumorale. Cette
activation de la voie classique du complément libère aussi les facteurs chimiotactiques C3a et C5a,
capables de recruter des effecteurs immunologiques anti-tumoraux pro-inflammatoires.
Néanmoins, une réponse immunitaire humorale n’est pas favorable à l’hôte. En effet, une
trop grande proportion d’anticorps masque alors les antigènes tumoraux. Or ceux-ci sont
indispensables au déclenchement de la réponse cellulaire cytotoxique.
2.6 Les mécanismes intrinsèques de défense
Lors de la division cellulaire, des erreurs ou cassures peuvent apparaître lors de la
réplication de l’ADN. Des mécanismes de réparation se mettent en place et font intervenir différents
complexes de protéines telles que l’ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated), et la protéine p53.
La protéine p53 a un rôle crucial dans la réponse anti tumorale. En effet, l’instabilité
génétique est le point de départ menant au développement des tumeurs. Dès la reconnaissance de
cette instabilité génétique, l’activation de la protéine p53 mène le plus souvent à l’apoptose de la
cellule instable. Des souris, à la fois prédisposées à l’instabilité génétique et à un manque en
protéine p53 sont susceptibles de déclencher un cancer (ATTARDI, 2005).
Cependant, des mutations apparaissent lors de développements tumoraux, inhibant ainsi ces
complexes. Néanmoins, l’organisme peut encore réagir. En effet, il semblerait qu’il y ait un lien
entre la réponse aux dommages d’ADN et l’expression de molécules à la surface de la cellule telles
que MICA et RAE. Or ces deux molécules sont des ligands du récepteur NKG2D, fortement
exprimé sur les cellules NK et certains lymphocytes T CD8+, induisant donc une augmentation de
l’immunogénicité de la tumeur (ZITVOGEL et al., 2006).
36
Le système immunitaire fait intervenir de multiples facteurs pour éliminer de l’organisme
les cellules anormales. Il est en effet capable de les reconnaitre puis de les éliminer avant que ces
cellules ne puissent proliférer. Cependant, l’immunosurveillance semble être contournée par les
cellules tumorales. En effet, le développement d’une tumeur passe par une phase d’équilibre,
pendant laquelle les cellules tumorales vont s’adapter au système immunitaire. Les cellules
tumorales ne seront plus détruites par l’organisme. L’immunosélection définit les stratégies
d’adaptation des cellules tumorales sous la pression du système immunitaire.
II-
L’immunosélection mène à la phase d’équilibre
Jusqu’à cette phase d’équilibre, le système immunitaire exerce une pression si puissante sur
les cellules tumorales, que celles-ci sont détruites. Néanmoins, les cellules tumorales vont réagir à
cette pression, en développant des stratégies en fonction du système immunitaire. Les stratégies
mises en place vont déjouer le système immunitaire.
Par conséquent, durant cette phase d’équilibre, le système immunitaire tente de contenir les
développements tumoraux, mais il n’arrive plus à détruire les cellules anormales.
Voyons à présent les stratégies mises en place par les cellules tumorales dans le but de
déjouer le système immunitaire.
1- Autosuffisance en facteurs de croissance
Les cellules tumorales ont acquis la capacité de synthétiser les facteurs de croissance qui
leur sont utiles. Ceux-ci créent une boucle de régulation positive, appelé stimulation autocrine.
Beaucoup d’entre eux vont, non seulement engendrer des signaux de stimulation de croissance,
mais aussi renverser la réponse immunitaire à la faveur du développement tumoral (STASSI et al.,
2003).
Par exemple, les interleukines 4 et 10 (IL-4 et IL-10) sont libérées par les carcinomes
thyroïdiens et vont polariser la réponse immune vers une réponse Th2, inhibant ainsi l’immunité
anti-tumorale. En effet, comme décrit plus haut, la réponse immunitaire à médiation humorale n’est
pas adaptée dans la lutte contre le développement tumorale (STASSI et al., 2003).
37
L’interleukine 6 (IL-6) est l’un des plus importants facteurs autocrines intervenant dans la
pathogénie de nombreux cancer, comme le cancer de la prostate, le cancer rénal ou encore le
myélome (WANG et al., 2004). Or, l’IL-6, via son récepteur, active le facteur de transcription
STAT-3 des cellules tumorales, dont son rôle dans l’inactivation de la réponse inflammatoire a été
démontré. Il agit également sur les interactions entre la réponse immunitaire innée et acquise,
favorisant ainsi le développement tumoral (WANG et al., 2004). De plus, l’activation de STAT-3
modifie la cellule tumorale, en diminuant l’expression de molécules de CMH et en augmentant la
production d’IL-10, inhibant ainsi la reconnaissance des cellules tumorales, mais également en
stoppant la maturation des cellules inflammatoires à proximité des tumeurs.
2- Insensibilité aux signaux antiprolifératifs
Dans un tissu sain, de multiples signaux antiprolifératifs opèrent pour maintenir
l’homéostasie du tissu. Un des principaux signaux est le TGFβ (Transforming growth factor β ou
tumor growth factor). Beaucoup de tumeurs désactivent un des composants de la cascade
d’activation du TGFβ, par mutation ou sous expression de son récepteur par exemple. Le TGFβ se
retrouve alors dans le milieu environnant. Or, il est connu pour être un puissant agent
immunosuppresseur agissant à différents niveaux du système immunitaire (GORELIK et
FLAVELL, 2002).
En effet, le TGFβ réduit le nombre d’antigènes présentés par les cellules dendritiques, il
désactive l’interféron γ (IFNγ), réduit la prolifération des lymphocytes T et supprime la fonction
cytotoxique des cellules natural killers (NK).
Le TGFβ stimule la prolifération des cellules T régulatrices. Ces lymphocytes inhibent la
réponse immunitaire par la sécrétion d’IL-10 et par leur capacité à réduire la production d’IL-2. Ils
diminuent également l’expression des molécules du CMH et des molécules costimulatrices par les
cellules présentatrices d’antigènes. Donc, en ignorant les signaux transmis par TGFβ, les cellules
tumorales peuvent se répliquer dans un environnement immunodéprimé.
38
3- Echappement à l’apoptose
Le programme apoptotique s’effectue par deux principales voies. La voie mitochondriale
implique la perméabilité de la membrane externe de la mitochondrie (en relarguant des protéines
induisant l’apoptose, tel que le cytochrome C). La seconde voie est celle du signal de mort cellulaire
via un récepteur.
En échappant à l’apoptose, les tumeurs ont acquis une résistance envers les molécules de
chimiothérapie et aux effecteurs du système immunitaire. Une molécule conférant la résistance a été
découverte : MUC1. Celle-ci est surexprimée dans de nombreux carcinomes (REN et al., 2006).
De plus, elle possède plusieurs effets immunosuppresseurs. Elle intervient dans la
différenciation des monocytes en cellules dendritiques. En effet, les cellules dendritiques ainsi
différenciées ont un phénotype particulier produisant une quantité importante d’IL-10 et peu d’IL12 (MONTI et al., 2004). Les CD restent alors immatures et sont incapables de stimuler
correctement la réponse Th1.
Les tumeurs peuvent aussi perdre l’expression d’agents tels que les APAF1 (ApoptoticProtease Activating Factor 1), indispensables pour l’activation de la cascade apoptotique.
4- Potentiel réplicatif illimité
Au cours de la division cellulaire, des motifs TTAGGG sont perdus en raison de l’incapacité
de la machinerie conventionnelle à répliquer les extrémités linéaires des chromosomes. La majorité
des cellules n’ont pas la possibilité de les rallonger. Le raccourcissement des télomères au-dessous
d’une taille critique est une source d’instabilité et est à la base de la sénescence conduisant à la mort
de la cellule.
Or, les cellules tumorales ont développé une télomérase qui est une transcriptase inverse
spécialisée, assurant alors la synthèse de novo des répétitions télomériques sur les télomères
préexistants, maintenant ainsi leur longueur (AMARNATH et al., 2006).
De plus, pour augmenter leur potentiel de réplication, les cellules tumorales peuvent avoir :
soit des mutations, soit une perte d’expression de protéines induisant la sénescence comme la
protéine p53. Cependant, tant la télomérase que la p53 mutée, elles sont reconnues comme
39
antigènes tumoraux, pouvant donc augmenter l’immunogénicité des cellules. Toutefois, ces
antigènes là ne sont pas connus pour stimuler une réponse immunitaire (GIRE, 2005).
5- Développement de l’angiogénèse
Dans de nombreuses tumeurs, le taux de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire
VEGF (Vascular endothelial growth factor) est important par rapport à un tissu sain. Ce facteur est
déterminant pour l’angiogénèse.
Au cours du développement tumoral, les cellules ont besoin de nutriments pour leur
croissance. C’est pourquoi l’angiogénèse est importante pour leur développement, en apportant les
nutriments nécessaires. Elle est par ailleurs indispensable à la dissémination des cellules tumorales
dans l’organisme de l’hôte.
Une fois de plus, le facteur VEGF est un inhibiteur du système immunitaire. Celui-ci agit sur
le facteur nucléaire κ-B des cellules dendritiques stoppant leur maturation ainsi que l’activation des
cellules T. Preuve du pouvoir immunosuppresseur de ce facteur de croissance : en administrant des
anticorps spécifiques du VEGF, on augmente l’efficacité de l’immunothérapie (YANG et
CARBONE, 2004).
Autre exemple, le médiateur pro-inflammatoire cyclooxygénase-2 (COX2) est souvent
surexprimé dans les tumeurs. Or il permet une surproduction locale de prostaglandine 2 (PGE2) qui
joue un rôle important dans l’angiogénèse en stimulant la production de VEGF (BROWN et
DUBOIS, 2005). Tant COX-2 que PGE2, dépriment le système immunitaire en désactivant les
macrophages et les cellules T, et en favorisant une réponse Th2.
6- L’invasion de tissus ou métastases
Les métastases sont à 90% la cause de décès chez les patients atteints de cancer. L’invasion
à distance de tissus requiert une altération de protéines impliquées dans la liaison cellulaire.
Le gène suppresseur de tumeur TSLC1 (tumour suppression in long cancer 1), qui est
fréquemment inactivé dans un contexte tumoral, code pour une protéine appelée NECL-2 (BOLES
40
et al., 2005). Celle-ci permet, entre autres fonctions, de joindre les cellules entres elles à travers des
interactions de protéines. Elle est aussi reconnue par des molécules nommée CRTAM permettant
alors aux cellules T de se lier au CMH1, et aux cellules NK et CD8+ d’exercer leur cytotoxicité.
L’inactivation du gène codant pour la protéine NECL-2 joue un double rôle : non seulement,
les liens cellulaires sont défaillants, mais aussi la reconnaissance des cellules est affaiblie par un
manque de liaison aux cellules du système immun. La sécrétion d’enzymes protéolytiques comme
les cathépsines contribue également à l’invasion de cellules tumorales dans les tissus. Cette
sécrétion est liée à l’augmentation de l’expression de la protéine HSP70 sur la membrane
lysosomiale et plasmique des cellules tumorales.
En revanche, cette surexpression rend la cellule davantage immunogène, car elle entre en jeu
dans la présentation croisée des cellules T CD8+ (GASTPAR et al., 2005).
Les cellules tumorales ont la capacité d’envahir d’autres tissus, mais en revanche, cette
propriété les rend plus immunogènes.
L’immuno-sélection permet donc aux cellules tumorales de subsister dans l’organisme en
résistant au système immunitaire. Cette phase d’équilibre entre cellules tumorales et système
immunitaire peut persister dans le temps. Mais à la faveur d’un stress de l’organisme, d’un
affaiblissement de celui-ci ou d’une agressivité accrue des cellules tumorales, celles-ci vont
activement s’attaquer au système immunitaire pour croitre et développer un cancer. On parle alors
d’immuno-subversion.
III- L’immuno-subversion mène au développement d’un cancer
Comme décrit précédemment, les cellules tumorales développent des stratégies pour
subsister dans l’organisme telles que la sous expression des molécules CMH1. C’est à travers un
sous développement de molécules impliquées dans la présentation d’antigènes, telle que la tapasine
par exemple, que cette stratégie opère. Cette perte d’expression s’effectue progressivement au cours
du développement tumoral.
Il s’agit ici d’une perte de reconnaissance, mais l’échappement ne s’arrête pas là. Les
cellules anormales tentent d’inhiber les effecteurs du système immunitaire : il s’agit alors de
l’immuno-subversion.
41
En effet, les cellules tumorales développent des mécanismes pour rendre inefficaces les
cellules T cytotoxiques. Une surexpression de sérines protéases inhibiteurs PI-9 sur les membranes
des cellules tumorales, bloque efficacement les granzymes et perforines libérées par les CTL. Cette
sérine protéase est également retrouvée dans les tissus sains. En effet, elle se localise dans les tissus
lymphoïdes, site privilégié de la mise en place de l’immunité, ainsi que sur les lymphocytes T
cytotoxiques. Ceci suggère donc que la présence de la sérine protéase PI-9 protège les CTL contre
la destruction via leur propre granzyme B. Par ce mécanisme, les cellules tumorales déjouent
l’efficacité des cellules effectrices telles que les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques
(MEDEMA et al., 2001).
Divers produits des cellules tumorales impliqués dans les six propriétés détaillées plus haut,
sont mis en cause dans l’immunosubversion. Il s’agit d’une suppression active de la réponse
inflammatoire. Autre produit mis en cause de manière importante : l’indoleamine 2 – 3
dioxygénase (IDO), qui permet la dégradation du tryptophane. L’IDO est constamment exprimée
dans les tumeurs, et permet la résistance au système immunitaire.
L’IDO, localement, bloque la prolifération des lymphocytes T CD8+ dans le site tumoral et
induit l’apoptose des lymphocytes T CD4+ (UYTTENHOVE et al., 2003).
Dans le modèle murin, des cancers avancés désorganisent les fonctions immunes. En effet,
des LT CD8+ spécifiques des tumeurs sont activés au stade initial du développement tumoral, mais
progressivement, ces cellules montrent une perte de leur fonction cytolytique lors de la phase
d’expansion tumorale (HUANG et al., 2005).
De la même manière, des lymphocytes T CD4+ perdent progressivement leur activité anti
tumorale alors que le nombre de lymphocytes T régulateurs augmente. De nombreuses recherches
s’attardent sur les mécanismes exacts de l’immuno-subversion. Une piste possible est de considérer
la tumeur comme un « faux organe lymphoïde ». La présentation aux cellules T dans
l’environnement tumoral est défectueuse, induisant des signaux de tolérance.
En effet, rappelons que l’environnement tumoral est constitué de nombreux facteurs
(VEGF, IL-6, IL-10, TGF-β, NOS2, IDO, PGE2, COX2) dont la capacité d’inhibition de la
différenciation, de la maturation ou des fonctions des cellules dendritiques a été présentée plus haut.
Par ces mécanismes, les cellules dendritiques immatures apportent une immunosuppression et non
une immunostimulation.
Ces multiples exemples ont pour but de montrer qu’une réponse immunitaire anti tumorale
incomplète bénéficie aux tumeurs au détriment de l’hôte.
42
Les thérapies ne doivent donc pas uniquement s’attarder sur la destruction des tumeurs, mais
doivent prendre en compte la situation immunitaire du patient.
Quelques pistes thérapeutiques stimulent la réponse immunitaire anti tumorale. Par exemple,
de faibles doses de cyclophosphamide peuvent sélectivement détruire et inhiber des cellules T
régulateurs, restaurant alors une réponse CTL normale (BERD et MASTRANGELO, 1987).
D’autres thérapies cliniques comme des injections intra tumoral d’anthracyclines peuvent
augmenter les propriétés antigéniques des cellules. De plus, la radiothérapie augmente l’expression
des molécules de CMH-I, rendant la cellule tumorale plus antigénique.
L’objectif est donc d’accroitre l’efficacité des thérapies anti-tumorales en les combinant
avec des agents immunostimulants.
Dans notre étude, nous cherchons une molécule qui permettrait de rediriger une réponse
immunitaire dans la voie adéquate ; c'est-à-dire la réponse immune à médiation cellulaire, même si
la voie Th2 est déjà mise en place. Nous recherchons également à stimuler les effecteurs de la
réponse cellulaire pour qu’ils soient, non seulement efficaces, mais également spécifiques d’un
antigène tumoral.
43
IV- Viscum album fermenté : présentation, mode d’action et propriétés
pharmacologiques
1- Présentation du Viscum album fermenté
Les extraits aqueux de Viscum album fermenté sont utilisés de façon traditionnelle en
cancérologie humaine dans de nombreux pays, dont l’Allemagne et la Suisse.
1.1 Le gui
Le gui - dont l’appellation latine est Viscum album - est un sous arbrisseau hémiparasite de
la famille des Loranthacées, originaire des régions tempérées de l’Ancien Monde, qu’on trouve sur
diverses espèces d’arbres feuillus ou résineux comme le chêne, l’orme, le pommier, le pin, le sapin,
le saule pleureur, le peuplier… Il utilise les ressources de la plante hôte en lui soutirant eau et sels
minéraux ; il possède de la chlorophylle et est donc capable de faire sa propre photosynthèse.
Les feuilles du gui renferment des protéines spécifiques, les viscotoxines et des lectines. Le
fruit du gui est une baie blanchâtre toxique produite en grande quantité.
44
Figure 13 : Photo de gui sur un pommier. Source :
http://www.jpdugene.com/fiches_botanique/gui_blanc.htm
1.2 La composition des extraits de Viscum album
Le Viscum album fermenté est un remède phytothérapique hautement dynamisé dont la
composition varie en fonction de l’arbre hôte sur lequel il est prélevé. Lors de la prescription, le
nom de Viscum album fermenté doit donc être suivi du nom de l’arbre hôte. Des études ont permis
l’identification et la caractérisation de composés actifs présents dans les extraits de gui fermenté.
Les lectines et les viscotoxines sont les principaux groupes contribuant à l’activité biologique de
Viscum album. Cependant une centaine de composants a été retrouvée dans les extraits de gui
fermenté (BLOSTIN, 2005). La composition est d’autant plus complexe qu’elle change également
en fonction de la saison de récolte.
45
1.2.1
Les lectines
Les lectines sont des protéines ou glycoprotéines capables de se fixer, de manière spécifique
et réversible, à des résidus osidiques des membranes cellulaires sans montrer d’activité
enzymatique.
Trois lectines ont été mises en évidence chez Viscum album : Lectine 1 (Mistletoe lectine 1 (ML I)
ou viscumine), ML II et ML III. Ces lectines sont des glycoprotéines spécifiques pour le Dgalactose (ML I), pour le N-acétylglucosamide (ML III) ou pour les deux (ML II) (HAJTO et al.,
2005). Il s’agit de molécules hétérodimériques à liaison disulfure qui se composent de sous unités
fonctionnelles, la chaîne A et la chaîne B.
Les chaînes se séparent au moment de la pénétration dans la cellule. La chaîne A inhibe
l’activité des ribosomes en clivant l’ARNr. Par cette activité enzymatique, les lectines appartiennent
à la famille des protéines inactivant les ribosomes de type II (RIP). Elles sont donc responsables de
la mort cellulaire. La chaîne B, quant à elle, possède un site de fixation au sucre. Elle se lie aux
glucides des cellules, facilitant ainsi l’internalisation de la lectine.
Ces trois lectines ont la propriété commune d’agglutiner les érythrocytes in vitro. C’est
pourquoi on les nomme également agglutinine.
Ø ML 1 ou Viscumine ou Viscum album agglutinine 1
La lectine 1 est la plus étudiée. Elle est composée d’une chaîne A de poids moléculaire de
29kDa et d’une chaîne B de 34kDa. A forte concentration, la lectine 1 peut se lier à une autre
lectine 1 par une liaison non covalente, adoptant ainsi une structure hétérotétramère.
La chaîne A désactive la synthèse protéique, dans la sous unité 28S, de l’ARNr, d’où son
appartenance à la famille des protéines inactivant les ribosomes (RIP). L’affinité de la chaîne B
envers le D-galactose permet à la lectine 1 de s’attacher sur un grand nombre de cellules.
Ø ML 2 ou lectine 2
La lectine 2 est composée de deux sous unités fonctionnelles, la chaîne A de 27kDa et la
chaîne B de 32 kDa, liées entre elles par une liaison disulfure.
46
Ø ML 3 ou lectine 3
La lectine 3 est également composée de deux chaînes fonctionnelles, A et B, dont le poids
moléculaire est respectivement de 25kDa et de 30kDa. Tout comme la lectine 2, elle ne peut pas
s’associer à une autre lectine.
1.2.2
Les viscotoxines
Une viscotoxine est une protéine de la famille des thionines, retrouvée dans les feuilles et
tiges de nombreuses plantes. Il s’agit d’un polypeptide de 46 acides aminés avec 3 ponts disulfures
qui lui confère une structure en trois dimensions. Elle présente également des résidus hydrophobes
et hydrophiles définissant deux régions distinctes de la protéine. Elle exerce différentes activités
cytotoxiques, aussi bien envers les champignons, les bactéries, les cellules animales et végétales. Ce
pouvoir toxique pourrait jouer un rôle dans la défense de la plante contre les bactéries, champignons
ou insectes.
Six isoformes nommés A1, A2, A3, B, 1-PS et U-PS ont été découverts. La viscotoxine A3
est la plus cytotoxique, contrairement à la B dont le potentiel toxique est le plus faible
(BRUNETON, 1993).
Son pouvoir toxique est dû à sa conformation qui rend possible des interactions entre les
phospholipides de la membrane plasmique et la région hydrophobe de la viscotoxine, conduisant
ainsi à la perturbation de la membrane plasmique (GIUDICI et al., 2003).
Outre le remaniement de la membrane plasmique, un des modes d’actions de la viscotoxine
consisterait, après une liaison au niveau des membranes cellulaires musculaires, en une action de
défixation du calcium de son site membranaire, entraînant une dépolarisation musculaire. Cette
toxicité s’exercerait essentiellement au niveau cardiaque et vasculaire, amenant à une
vasoconstriction (OCHOCKA et PIOTROWSKI, 2002).
Les viscotoxines A1, A2, A3 et 1-PS sont responsables de l’accélération de la mort
cellulaire, de l’altération de la perméabilité des membranes cellulaires, et de la génération
d’oxygène intermédiaire réactif.
47
1.2.3
Les autres composants
Les extraits de gui fermenté contiennent également des polysaccharides. Ils sont également
composés de flavonoides et surtout des dérivés de l’isorhamnétol, des éthers méthyliques du
quercétol, des glucosides de flavanones et de chalcones méthoxylées, accompagnés de rhamnazol.
La composition en flavonoïdes permet de différencier certaines sous espèces.
Des phénylpropanes et des lignanes sont également des métabolites secondaires du gui. Les extraits
sont également riches en acides aminés, en lipides, en peptides. Ils sont aussi composés de
triterpènes, phytostérols et de plusieurs enzymes (WICHTL, 1999). Cependant, peu d’études ont été
réalisées sur ces composés présents dans les extraits de gui.
2- Les propriétés de Viscum album
Le Viscum album est utilisé depuis des décennies comme traitement adjuvant ou palliatif en
cancérologie, notamment en Suisse et en Allemagne.
Plusieurs études ont révélé un bénéfice clinique des préparations à base de VAF chez les
patients cancéreux. Les traitements avec des préparations de VAF ou des lectines purifiées ont
montré une association avec des régressions tumorales dans plusieurs modèles expérimentaux
(AUGUSTIN et al., 2005).
Les mécanismes permettant l’activité anti tumorale des préparations de VA sont complexes
et pas encore complètements élucidés. Les mécanismes proposés incluent l’induction de l’apoptose
des cellules tumorales, l’inhibition de l’angiogénèse et la stimulation des cellules du système
immunitaire (DUONG VAN HUYEN et al., 2002 ; ELLURU et al., 2009 ; HAJTO et al., 2005).
Dans les extraits aqueux de Viscum album, l’effet immunomodulateur est dû aux lectines et
à leur chaîne B. Ces lectines sont en quantité variable dans les extraits.
Les
effets
biologiques
sont
divers
et
peuvent
être
aussi
bien
cytotoxiques
qu’immunostimulants. En effet, dans une culture de monocytes périphériques, on peut aussi bien
stimuler la production de cytokine que l’apoptose. Il est donc important de comprendre les doses
ainsi que les temps d’incubation.
48
2.1
Les effets cytotoxiques et apoptotiques de Viscum album
· L’effet dose et temps dépendants de VAF dans une culture cellulaire
Si des cellules eucaryotes sont incubées 24h en présence de la lectine ML-1 (également
nommée Viscum album agglutinine 1(VAA-1)). Cette lectine induit des effets cytotoxiques sur les
lignées cellulaires. En effet, dans des cultures de cellules mononuclées de sang périphérique
(PBMC), Viscum album commence par avoir un effet cytostatique puis cytotoxique dès lors que
l’on tend vers des concentrations supérieures à 10µg/ml, si le temps d’incubation est de 24h. Si le
temps d’incubation diminue, la concentration toxique est naturellement plus haute (DUONG VAN
HUYEN et al., 2006).
Il a été prouvé que l’effet inhibiteur de croissance décrit précédemment dans différentes
cultures cellulaires peut être dû à l’induction de l’apoptose. En cultivant des cellules en présence de
doses croissantes de Viscum album, on a pu mettre en évidence que l’effet apoptotique est dose
dépendante et que celle-ci est variable en fonction des types cellulaires. Les lymphocytes montrent
une sensibilité variable à l’apoptose en fonction de la sous population cellulaire. Par ordre
décroissant de sensibilité, les cellules NK sont les plus sensibles puis suivent les LT CD8+, puis les
LT CD4+.
Par ailleurs, les lymphocytes activés sont également plus sensibles à l’apoptose que les lymphocytes
inactivés.
· La voie apoptotique déclenchée par l’administration de VAA-1.
En cultivant des cellules promonocytes U937 en présence de VAA-I, la concentration
cytosolique de l’ion calcique est augmentée, ce qui est entre autres, un signe d’apoptose. D’autant
plus que VAA-I peut potentialiser l’effet stimulant de l’histamine et du complément (C5a) sur la
concentration calcique cytosolique, jouant ainsi un rôle accélérateur dans le mécanisme de
l’apoptose. Ces résultats mettent donc en évidence un phénomène apoptotique.
La voie apoptotique ferait intervenir des cascades d’activation des caspases, jusqu’à la
caspase 8, via différents facteurs, mais indépendamment des récepteurs de mort (BANTEL et al.,
1999).
49
De plus, d’autres études sur le modèle murin génétiquement modifié (p53+/+ et p53-/-)
montrent que la fragmentation de la membrane mitochondriale et l’activation de la caspase 3
s’opèrent de manière indépendante de p53 avec le traitement avec VAA-I.
· La synthèse de cytokine proinflammatoire est influencée par VAA.
Les résultats de recherche de cytokines par les extraits de Viscum album sont pour la plupart
exclusivement issus de données in vitro et ne peuvent pas être directement transférés dans des
situations in vivo. In vivo, les cytokines sont actives à des doses extrêmement faibles dans un
mécanisme très complexe. In vitro et in vivo, les effets modulateurs peuvent seulement porter sur
un changement de concentration de cytokines sur un très court terme, et à de très petites doses de
l’ordre du picogramme. Les recherches sur les cytokines induites par Viscum album sont très
importantes car les patients souffrant de cancer montrent souvent une diminution de la réponse
inflammatoire.
24h de culture de PBMC en présence de faible dose non toxique de lectines (1 à 10ng/ml)
stimulent la libération de cytokines pro inflammatoires telles que IL-1, IL-6 et TNF-α dans le
surnageant de manière dose dépendante (HOSTANKA et al., 1995). Cet effet sécrétoire est dû à
l’ose porté sur la chaine B. Celui-ci est fondamental pour l’effet immunomodulateur.
De plus, une augmentation de l’expression de l’ARNm codant pour du TNF-α a été mise en
évidence dans des monocytes humains et des macrophages chez la souris, à la suite d’une
incubation de 24h avec des lectines. Après ce temps d’incubation de PBMC dans du VAA-I à des
doses non toxiques, l’expression des ARNm a été mesurée pour une série de cytokines à l’aide
d’une réaction inverse de polymérisation en chaîne (rPCR).
VAA induit l’expression de gènes codant pour IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF (facteurs
de croissance des monocytes et granulocytes) et IL-10. En revanche, ni IL-2, ni IL-5 n’ont été
retrouvées. Les résultats obtenus à partir des lectines II et III sont similaires (HOSTANKA et al.,
1995).
50
2.2 L’activation des leucocytes
Les investigations portées sur les cytokines laissent à supposer que les monocytes
constituent le point de départ. Cette hypothèse est confortée par le fait que les monocytes portent à
leur surface des molécules, dont l’affinité avec VAA est considérablement plus élevée que pour les
lymphocytes. Dans les cultures de monocytes, on observe qu’en présence de VAA, les
concentrations d’inositol phosphate sont plus élevées, indiquant un signal de transcription dans les
monocytes.
Cependant, l’effet sur le système immunitaire n’est pas réduit uniquement aux monocytes.
Les granulocytes montrent également une grande affinité pour les lectines issues de Viscum album
par rapport aux lymphocytes. En comparant les affinités dans les sous populations de lymphocytes,
on arrive au classement suivant par ordre décroissant d’affinité : NK>CD8+>CD4+.
Faisant suite à la présence de VAA, des cytokines pro inflammatoire sont synthétisées. Une
autre cytokine IL-12, qui régule aussi l’immunité innée a été recherchée. Lors de culture de PBMC,
la présence de VAA induit une augmentation de la sécrétion d’IL-12 totale et de sa forme active
p70. Or, cette cytokine joue un rôle primordial dans la régulation de la balance entre la voie Th1 et
Th2 (HAJTO et al., 1998).
2.3
Effets in vitro sur les cellules de l’immunité et sur les cellules
précurseurs hématopoïétiques de la moelle osseuse
Depuis plus de 15 ans, on a découvert que VAA-I et sa chaîne B stimulent l’activité
phagocytaire des leucocytes humains, via un mécanisme dépendant du calcium.
VAA est souvent plus efficace lorsqu’il est combiné avec des cytokines. Ainsi, VAA associé à IL-2
et IL-12 induit une augmentation de l’activité cytotoxique des NK plus importante qu’en présence
d’une seule cytokine (HAJTO et al., 1998).
Durant le développement tumoral, les cellules cancéreuses échappent au système
immunitaire via la sécrétion de facteurs tels que VEGF, IL16 et PGE2, connus pour inactiver le
système immunitaire. Parmi les différentes stratégies d’échappement, les cellules tumorales
paralysent la fonction des cellules présentatrices d’antigènes et notamment les cellules dendritiques.
51
Or celles-ci, par leur capacité à stimuler des lymphocytes T naïfs, jouent un rôle pivot dans
l’immunité anti-tumorale. Dès lors qu’elles reçoivent les signaux appropriés, la maturation des
cellules dendritiques est caractérisée par une augmentation de l’expression de molécules du CMH,
de molécules de co-stimulations telles que CD80/CD86 et par la sécrétion de cytokines proinflammatoires.
Les études d’ELLURU et al. (2008), ont permis de mettre en évidence l’action de Viscum
album dans l’immunostimulation.
Faisant suite à une culture de cellules dendritiques en présence d’extraits de VA à des doses
croissantes allant de 5 à 15µg/ml, ils ont analysé l’expression de molécules de surface par
cytométrie de flux. Ils ont montré une augmentation de molécules de présentation d’antigène (HLADR) et de molécules de costimulation CD40, CD80 et CD86 de manière dose dépendante, signe de
maturation des cellules dendritiques. Ils ont par ailleurs démontré la synthèse de cytokine IL-6 et
IL-8.
Ils ont en outre, obtenu à l’aide de culture mixte de CPA et de lymphocytes, des
lymphocytes T CD8+ spécifiques d’un peptide issu d’antigène de mélanome, révélés par la
sécrétion d’IFN-γ et de TNF-α.
Quant aux précurseurs hématopoïétiques des lymphocytes T, en présence de VAA et
d’autres facteurs de croissance, la prolifération cellulaire est significativement augmentée
(VEHMEYER et al., 1998).
2.4 Effets in vivo, des extraits de Viscum album et de VAA-I sur les
cellules du système immunitaire inné chez le modèle animal, des
volontaires sains et des patients souffrant de cancer
Des effets doses dépendants dans différentes cultures cellulaires in vitro ont été
précédemment observés. Le nombre et le ratio de sous populations de lymphocytes circulants, ainsi
que leurs activations ont été recherchés in vivo chez le lapin, en utilisant différentes concentrations
de VAA.
Une injection unique de VAA-I pure (0.25 à 1 ng/kg) chez le lapin, augmente de manière
dose dépendante leur température corporelle ainsi que le nombre et l’activité phagocytaire des
52
granulocytes et l’action cytotoxique des NK dans le sang périphérique. L’effet maximal est obtenu à
une dose de 0.8 ng/kg de poids corporel (HAJTO et al., 1989).
Chez l’homme, l’effet optimal est obtenu pour une dose de 1 ng de VAA-I/kg. Celle-ci étant
loin de la limite toxique. La dose létale à 50% chez la souris est à quelques centaines de µg/kg.
Chez des patients atteints de cancer, des injections bi hebdomadaire sous cutanées de
préparation de Viscum album, dont la dose de VAA était de 1ng/kg, ont mené à une élévation du
nombre et de l’activité cytotoxique des NK dans le sang périphérique. De plus, une augmentation de
lymphocytes T portant des signaux d’activation a été rapportée (HAJTO et al., 1993).
2.5 Les propriétés anti-angiogénique de Viscum album
L’angiogénèse joue un rôle important dans la croissance, la nutrition et les métastases des
tumeurs. L’inhibition de celle-ci est maintenant explorée comme piste thérapeutique anticancéreuse.
Des cultures de cellules endothéliales EA-hy926 ont été incubées 24 heures, avec des extraits de
Viscum album à différentes doses (12.5µg/ml ou 50µg/ml). Les résultats montrent un pourcentage
élevé d’apoptose de manière dose dépendante par rapport au contrôle négatif.
Le marquage Annexin V en cytométrie de flux (méthode utilisée dans cette étude) cible
l’apoptose. Or après une apoptose, il arrive un phénomène appelé nécrose post-apoptotique, mais
celle-ci se différencie tout de même de la nécrose simple qui elle n’est pas marquée par l’Annexin
V. Ici, un double marquage, AnnexinV et Iodure de propidium (PI), marqueur de nécrose (agent
intercalant), a été réalisé. Les cellules sont considérées comme apoptotiques si elles sont annexin
positive et PI négative. On parle donc bien d’apoptose et non de nécrose.
De plus, ces mêmes cellules ont été cultivées sur un gel et se sont organisées en réseau de
capillaires composé d’anastomose. Durant une co-incubation en présence de Viscum album,
toujours aux mêmes doses, Viscum album induit une importante disjonction entre les capillaires
détruisant ce réseau. En revanche, in vivo, le traitement systémique n’a pas permis de mettre en
évidence une association avec une éventuelle réduction de l’angiogénèse (ELLURU et al., 2009 ;
DUONG VAN HUYEN et al., 2002).
53
Viscum album a des effets anti-tumoraux importants, faisant de lui une piste intéressante sur
le plan thérapeutique. Son activité anti-tumorale repose sur deux notions : d’une part, une action
anti-tumorale vraie via notamment son activité apoptotique et antiangiogénique décrites plus haut,
et d’autre part, une action immunostimulante. De plus, les études précédemment citées mentionnent
son action stimulante de la voie cellulaire Th1. C’est cette dernière qui nous motive à l’utiliser
comme adjuvant dans un processus d’immunisation. En effet, nous cherchons à accroitre une
réponse immunitaire cellulaire spécifique d’un antigène grâce à un adjuvant immunostimulant, tel
que Viscum album. Détaillons à présent l’utilisation des adjuvants dans un protocole
d’immunisation.
3 - L’utilisation des adjuvants dans un processus d’immunisation
Avant l’identification des antigènes associés aux tumeurs, les approches vaccinales
consistaient à immuniser les patients avec des cellules tumorales entières irradiées, des cellules
tumorales génétiquement modifiées (capables d’exprimer certaines molécules de costimulation, ou
de secréter certaines cytokines), des fusions de cellules tumorales et de cellules présentatrices
d’antigène, ou des extraits de cellules tumorales administrés en présence ou non d’adjuvants et de
cytokines (CHOUAIB et al., 2006).
L’identification des différents antigènes tumoraux a rendu les stratégies d’immunisation
active de plus en plus spécifiques. De telles stratégies vaccinales ont pour objectif la stimulation
active du système immunitaire du patient afin d’activer ses défenses spécifiquement contre la
tumeur primaire et ses métastases.
Ainsi différents types de vaccins ont été développés pour immuniser les patients, tels que
des antigènes de tumeurs purifiés, des peptides synthétiques, de l’ADN nu, des virus recombinants.
La plupart des essais ont été fondés sur l’administration, au patient, de cellules dendritiques
chargées avec des antigènes tumoraux recombinants ou des peptides issus de la tumeur, ou infectées
par des virus recombinants.
L’un des aspects, inhabituels, de la vaccination antitumorale est qu’elle est thérapeutique et
non préventive, puisqu’elle s’adresse à des patients porteurs de tumeur. Même si des résultats
encourageants ont été obtenus dans les modèles murins, les modèles créés par l’induction
expérimentale de tumeurs n’ont pas, ou peu, de valeur prédictive chez l’homme. Chez les patients
54
soumis à un tel traitement vaccinal, les réponses immunologiques induites par la vaccination, bien
que détectables, ne s’accompagnent pas nécessairement d’une réponse clinique (CHOUAIB et al.,
2006). Il faut, de plus, signaler que le statut immunitaire du patient est souvent altéré par des
traitements cytotoxiques, et que les patients bénéficiant d’une vaccination sont souvent sélectionnés
à un stade relativement avancé de la maladie (stades III et IV), expliquant ainsi la faible réponse
clinique suite à la vaccination.
Le terme « adjuvant » - dérivé du latin adjuvare - signifie aider, assister. Il désigne toute
substance capable d’augmenter l’intensité de la réponse immune dirigée contre un antigène
administré simultanément. Il existe une multitude d’adjuvants, de nature et d’origine extrêmement
diverses, dont il serait impossible de dresser une liste exhaustive.
On distingue parmi les adjuvants, les agents immunostimulants et les « véhicules ». Les
premiers activent directement les cellules de l’immunité en se liant à différents récepteurs. Les
seconds contiennent l’antigène et déterminent la façon dont il sera présenté au système immunitaire.
Cependant, les véhicules ont souvent eux-mêmes des propriétés immunostimulantes, simplement
parce qu’ils constituent des corps étrangers (VERMOUT et al., 2003).
Les adjuvants sont principalement utilisés en tant que constituants de vaccins. Dans la
majorité des cas, ils sont indispensables à l’installation d’une réponse immune protectrice. En effet,
le pouvoir immunogène d’un vaccin non adjuvé, surtout s’il est inactivé, est souvent trop faible car
la vaccination ne peut imiter parfaitement une infection naturelle. Les vaccins sous-unitaires en
cours de développement, qui se réduisent parfois à de simples peptides, sont particulièrement
concernés par ce problème.
L’alun est actuellement le seul adjuvant enregistré pour la médecine humaine. Il s’agit d’un
sel d’aluminium stimulant la production d’anticorps via l’induction d’une réponse de type Th2
(VERMOUT et al., 2003).
Le développement de nouveaux adjuvants est en cours, tels que les saponines ou les
oligonucléotides CpG (ZIMMERMANN et al., 2002). Nous nous attarderons sur ce dernier
adjuvant, car il va nous servir comme témoin positif dans nos expériences. Ce type d’adjuvant est à
rapprocher des constituants bactériens. Contrairement à l’ADN des vertébrés, les génomes
procaryotes sont riches en dinucléotides CpG (Cytidine-Guanosine). Avec leurs séquences
spécifiques, ces dinucléotides forment des motifs « CpG » reconnus par le système immunitaire de
façon non spécifique. Ce type d’adjuvant semble de plus en plus utilisé (KANDIMALLA et al.,
2003 ; ZIMMERMANN et al., 2002).
55
Ces adjuvants ont la capacité d’induire des réponses qui sont très nettement de type Th1,
comme en témoigne notamment l’importante production d’IL-12 et d’IFN-γ qu’ils stimulent
(HALPERN et al., 1996 ; ZIMMERMANN et al., 2002). Cet effet passe par une interaction du CpG
avec le récepteur Toll 9 (TLR-9). Ils peuvent également limiter une réponse Th2 déjà installée et
l’orienter vers une Th1. Cette fonction est particulièrement importante dans certaine pathologie telle
que la Leishmaniose (ZIMMERMANN et al., 2002).
Ils pourraient donc être utiles en tant que vaccins thérapeutiques, cependant, leurs effets
chez l’homme en restent à un stade précoce d’investigations.
De très nombreux adjuvants, aux modes d’actions variées, sont actuellement à l’étude tant
en médecine humaine que vétérinaire. Les adjuvants utilisables dans les vaccins commerciaux ne
permettent pas d’induire une réponse à dominante Th1, exception faite du vaccin contre la
Leishmaniose dont l’adjuvant est Quillaja saponaria permettant une orientation de la réponse
immunitaire vers la voie Th1. Or cette propriété pourrait être la clé d’une immunisation efficace
contre bon nombre de tumeurs ou de maladies infectieuses aujourd’hui incurables.
L’immunisation contre un pathogène a pour but d’accroitre la réponse immunitaire de
manière ciblée vers l’antigène responsable de la pathologie. Dans notre objectif à long terme qu’est
la protection anti-tumorale, une réponse cellulaire et non humorale est souhaitée.
Or, comme présenté précédemment, Viscum album possède non seulement une action antitumorale ciblée (d’où son utilisation en cancérologie), mais également immunostimulante de la voie
Th1, participant également à son action anti-tumorale.
De plus, peu de molécule adjuvante sont capables d’activer la réponse immunitaire
cellulaire. C’est pourquoi, dans cette étude, nous allons étudier le pouvoir immunostimulant de
Viscum album, utilisé comme adjuvant dans un processus d’immunisation contre l’ovalbumine.
56
B- Travaux expérimentaux
1- Présentation des travaux
L’étude consiste à déterminer le pouvoir adjuvant de Viscum album fermenté. Pour cela,
nous utilisons un protocole d’immunisation à l’aide l’antigène suivant ; l’ovalbumine. Plusieurs
injections à intervalles réguliers sont effectuées pour obtenir une réponse immunitaire suffisante
pour l’évaluer grâce à différentes techniques décrites plus bas. De plus, deux voies d’immunisation
(intra péritonéale et intra-veineuse) sont testées afin de comparer leur efficacité. Enfin, certains lots
reçoivent, en plus de l’ovalbumine, des doses croissantes de Viscum album fermenté. Les souris
sont ensuite sacrifiées afin d’évaluer la réponse immunitaire mise en place.
Nous recherchons uniquement la présence d’une réponse immunitaire à médiation cellulaire.
Pour cela, la cytométrie de flux est utilisée pour dénombrer les lymphocytes T CD8+ spécifique de
l’ovalbumine, issus de l’immunisation. Enfin, la fonctionnalité de ces cellules est mise en évidence
par la sécrétion d’IFN γ suite à l’activation de ces cellules. L’IFN γ est mis en évidence par la
technique ELISPOT.
2- Matériels, méthodes et animaux
2.1 Souris et lignées cellulaires
Les souris femelles C56BL/6 proviennent du laboratoire Charles River. Elles sont
maintenues dans une atmosphère contrôlée, exempte de pathogène, et sont utilisées entre 6 et 8
semaines d’âge. Les expériences ont été conduites en accord avec les institutions responsables des
guides et des recommandations sur l’utilisation des animaux de laboratoire. Les souris OT1 sont
modifiées génétiquement de manière à n’avoir que des lymphocytes T dont le TCR est spécifique
du peptide SL8, provenant de l’ovalbumine.
57
Les cellules EL4 utilisées pour l’Elispot ont été fournies par le laboratoire d’Eric
TARTOUR, Hôpital Européen Georges Pompidou. Ces cellules sont utilisées pour présenter à leur
surface l’haplotype « SIINFEKL » (SL8), un peptide issu de la dégradation intracellulaire de
l’ovalbumine. Ces cellules étant tumorales, elles se multiplient en permanence de manière
identique. Il faut cependant prendre soin de vérifier l’expression du CMH sur celles-ci. Des
mutations peuvent avoir lieu lors des multiples réplications. Pour cela, des tests ELISA ont été
réalisés auparavant en présence d’un marqueur de CMH.
Par les cellules EL4, nous pourrons mettre en évidence les cellules CD8+ spécifiques du
complexe CMH1-peptide-TCR-CD8 induites par l’immunisation lors de l’Elispot.
Pour la culture, les cellules sont décongelées rapidement et placées dans une flasque
contenant 50 ml de milieu complet. Ce milieu est composé de RPMI 1640 additionné de 10% de
sérum de veau fœtal, 100mM de pyruvate de sodium, 10000µg/ml de streptomycine, 10000U/ml de
pénicilline et 50mM de béta-2-mercaptoéthanol. Les cellules sont incubées 24 heures à 37°C, puis
sont centrifugées à 1600 tpm, 10 minutes à 20°C. Le surnageant est jeté. On ajoute 50 ml de milieu
complet avant de remettre la culture à l’étuve.
2.2 Réactifs
L’ovalbumine provient du l’albumen d’œuf de poule purifié (grade V) commercialisé par le
laboratoire Sigma-Aldrich. Sa concentration est de 10mg/ml.
Viscum Album provient du laboratoire Weleda. Sa concentration est également à 10mg/ml.
2.3 Immunisation
Principe
L’objectif de l’immunisation est d’obtenir une réponse immunitaire chez la souris. Celle-ci
sera mise en évidence et quantifiée par différentes techniques, tels que le marquage tétramère,
l’Elispot ou encore le dosage d’anticorps. L’ovalbumine est l’antigène utilisé dans ce modèle. Il
s’agit d’une protéine. Son injection induit une réponse primaire de l’organisme dirigée contre cet
antigène. Les deuxièmes et troisièmes injections permettent d’amplifier la réponse immunitaire. En
effet, par ce procédé, les cellules différenciées par le premier contact vont réagir rapidement et de
58
manière plus importante. C’est cette réaction que l’on cherche à mettre en évidence. Dans notre
étude, nous allons tester deux voies d’immunisation : en intra péritonéale, et en intra veineuse
(injection dans le sinus orbitaire). De même, deux concentrations de Viscum album (20µg et 40µg)
vont être testées de manière à voir la dose pour laquelle on obtient une réponse à l’immunisation.
Enfin, un contrôle positif sera fait avec du CpG ADN, qui est un adjuvant reconnu pour stimuler
une réponse Th1. Le CpG ADN contient des dinucléotides CpG déméthylés dans un contexte
particulier de bases azotées (motif répété de Guanine et Cytosine). Employé comme adjuvant, il
stimule les cellules dendritiques. Par ses effets, on observe une augmentation des cellules T helper 1
(Th1), des cytokines pro inflammatoires ainsi que la maturation et l’activation de cellules
présentatrices d’antigènes professionnelles. Il peut accroître la réponse immunitaire jusqu’à 500 fois
(KLINMAN, 2006). Il servira donc à vérifier si le modèle utilisé permet d’obtenir une réponse
cellulaire détectable.
Protocole
Différents lots de 4 souris ont été réalisés avec des souris C57BL/6 femelles de 7 semaines
provenant du laboratoire Charles River.
· Lot 0 : immunisation avec 200µg d’ovalbumine à J0, J15, J28 en intra péritonéale.
· Lot 0 + VA : immunisation avec 200µg d’ovalbumine et 20µg de VA à J0, J15, J28 en intra
péritonéale.
· Lot 1 : immunisation avec 200µg d’ovalbumine à J0, puis avec 1mg d’ovalbumine à J12 et
J19 en intra péritonéale, et sacrifié à J25.
· Lot 2 : immunisation avec 200µg d’ovalbumine et 20µg de VA à J0, puis avec 1mg
d’ovalbumine et 20µg de VA à J12 et J19 en intra péritonéale, et sacrifié à J25.
· Lot 3 : immunisation à J0, J7, J13 avec 1 mg d’ovalbumine en intra veineuse puis sacrifié à
J20.
·
Lot 4 : immunisation à J0, J7 et J13 avec 1mg d’ovalbumine et 20µg de VA en intra
veineuse, puis sacrifié à J20.
· Lot 5 : immunisation à J0 et J12 avec 1mg d’ovalbumine et 40µg de VA en intra péritonéale,
sacrifié à J21
· Lot 6 : immunisation à J0 et J10 avec 1mg d’ovalbumine et 50µg de CpG en intra
péritonéale, sacrifié à J19.
59
2.4 Purification des cellules CD8+ de la rate
L’objectif de cette étape de purification est de garder, parmi l’ensemble des cellules spléniques,
uniquement les cellules CD8+. Cette étape se réalise grâce à l’utilisation d’une colonne de
séparation MACS (Magnetic cell sorting du laboratoire Miltenyi biotec). Une semaine après la
dernière immunisation, les rates sont prélevées et déposées dans 5ml de tampon phosphate salin
(PBS pour Phosphate Buffered Saline) complémenté de 1% de BSA (sérum albumine bovine),
refroidie par de la glace. Celles-ci sont ensuite broyées à travers un filtre cellulaire de 70µm. Les
cellules recueillies à travers le filtre sont lavées deux fois avec 10 ml de PBS-BSA 1%. Ajouter la
qsp 50ml de PBS-BSA, puis centrifuger à 1600 tours par minute pendant 10 minutes à 4°C. Le
surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 3 ml de tampon ACK (tampon
de lyse des hématies : Tris HCl 17mM, NH4Cl 144mM, pH 7.4), lysant ainsi les hématies. La
solution est mélangée en continue puis la réaction est stoppée 3 minutes après en ajoutant la qsp
50ml de PBS-BSA 1%. Centrifugation à 1600 tours par minutes, 10 minutes à 4°C. Le surnageant
est éliminé et 100µl d’anticorps anti-CD8 couplés à une microbille (microbille métalique conjuguée
à un anticorps monoclonal anti-souris CD8a) est ajouté pour chaque rate. Après 15 minutes
d’incubation à 4°C, on ajoute 20ml de PBS-BSA 1% puis on centrifuge à 1600 tours par minute, 10
minutes à 4°C. Le surnageant est à nouveau éliminé et on ajoute 1 ml de PBS-BSA.
Les colonnes MACS sont ensuite rincées avec 5 ml de PBS-BSA 1%. Les cellules sont ensuite
déposées dans la colonne placée dans le champ magnétique. Deux rinçages avec 5ml de PBS-BSA
1% sont réalisés. Les cellules CD8+ alors couplées aux microbilles restent donc dans la colonne,
avec que les autres cellules la traversent. On obtient alors une fraction de splénocytes dépourvue de
cellules CD8+. Afin de récupérer cette population, les colonnes sont retirées du champ magnétique
et sont lavées avec 5ml dePBS-BSA sous la pression du piston. Compter les cellules des tubes
CD8+.
Pour les marquages tétramères, déposer dans les tubes deux millions de cellules. Faire deux tubes
par rate : un pour le marquage Kb-SL8, l’autre pour le Kb-VSV. Centrifuger les tubes CD8+, jeter
le surnageant. Ajouter du milieu complet de telle manière à obtenir un million de cellules par ml. Ils
serviront pour l’Elispot.
Cette purification est indispensable pour éliminer le bruit de fond des différentes techniques
utilisées qui est dû aux cellules ne marquant pas les anticorps de manières spécifiques. De plus, en
concentrant nos échantillons en cellules T CD8, la sensibilité des techniques est augmentée, cela est
60
d’autant plus important que l’augmentation de cette population au cours de l’immunisation peut être
faible. Il faut donc une technique particulièrement sensible pour pouvoir la détecter.
Marquage tétramère :
Principe :
Ce marquage consiste à révéler la présence de lymphocyte CD8+ dont le TCR est spécifique
du peptide SL8 provenant de l’ovalbumine. Pour cela, on utilise un CMH-I pentamère (Fluorescent
Pro5®MHC class I Pentamers, H-2Kb SIINFEKL, laboratoire ProImmune). Il est composé de 5
complexes CMH-peptide assemblés ensemble par un domaine spiralé donnant une configuration
plane à la molécule. Cet ensemble est capable de se fixer sur le TCR des cellules induites,
spécifiques du peptide. L’affinité du pentamère et des cellules T est donc déterminée par l’ensemble
CMH-peptide-TCR et CD8. Pour être détecté en cytométrie de flux, le pentamère porte 4
fluorochromes ; la Phycoerythrine (PE) excité à 480, 565 nm. Il émet à la longueur d’onde 578nm.
Malgré l’affinité du pentamère pour les cellules T spécifiques, il peut se fixer de manière non
spécifique sur des cellules autres que les CD8 recherchées. C’est pourquoi on utilise en parallèle, un
autre pentamère Kb-VSV, qui est identique au Kb-SL8 sauf qu’il ne porte pas le peptide SL8. Donc
celui-ci ne pourra pas se fixer de façon spécifique aux CD8 recherchées. Il porte également la
phycoérythrine pour le détecter. Le signal donné par ce pentamère sera le témoin d’un marquage
non spécifique. En le comparant au marquage du Kb-SL8, on pourra alors soustraire le signal non
spécifique du signal spécifique qui nous intéresse.
La technique est complétée par un marquage des cellules CD8 grâce à des anticorps de rat, antiCD8 α de souris, couplé au « Fluorescein Isothiocyanate Isomer A » (FITC).
Dans notre étude, cela permettra de mettre en évidence les lymphocytes T CD8+ activés et dirigés
contre l’ovalbumine issus de l’immunisation, et de les quantifier.
Réalisation :
Dans les tubes contenant 2 millions de cellules CD8+ issus de la purification, ajouter dans
chaque tube 2 ml de PBS-BSA puis centrifuger à 500g pendant 5 minutes à 4°C. Jeter
complètement le surnageant. Déposer 20µl de Kb-SL8 ou 5µl de Kb-VSV selon les tubes et laisser
incuber durant 20 minutes à 4°C à l’obscurité. Laver avec 2 ml de PBS-BSA et centrifuger à 500g,
5 minutes à 4 °C. Jeter à nouveau complètement le surnageant et déposer 1µl d’anticorps anti-CD8.
Incubation à l’obscurité et à 4°C pendant 20 minutes. Puis laver avec 2 ml de PBS-BSA, centrifuger
61
à 500g durant 5 minutes à 4°C. Jeter le surnageant et ajouter 400µl de PFA 1% pour fixer les
cellules. Les tubes sont à conserver à 4°C.
Elispot :
Principe :
L’Elispot est une technique immunoenzymatique permettant de dénombrer des cellules à
partir de leur sécrétion. Son principe consiste à capturer la sécrétion de molécules par des cellules
sur un support. Après l’élimination des cellules, l’immuncomplexe formé par la molécule sécrétée
et l’anticorps de capture est révélé par un anticorps biotinylé. L’enzyme servant à la révélation se
fixe à cette biotine. L’apport du substrat mène à une réaction dont le produit est coloré. La
précipitation de celui-ci génère des taches colorées ou immunospots qui se fixent sur la membrane
située sous les spots. Cette technique a été choisie dans le but de dénombrer les cellules qui sont
capables de synthétiser de l’INFγ après stimulation par des CPA qui présentent le peptide. Par le
nombre de spots sur la membrane, nous obtiendrons la quantification des cellules T CD8+
spécifiques fonctionnelles. Pour permettre cette sécrétion, la cellule T activée doit être en présence
d’une cellule présentatrice d’antigène, portant sur son CMH-I, le peptide dérivé de l’antigène
injecté. Dans cet objectif, une culture de cellules EL4 provenant de lymphome de souris C57BL/6 a
été réalisée en présence du peptide SL8. Ces cellules, incubées avec le peptide pendant 4h, le
présenteront à leur surface et pourront dès lors activer les LT8 spécifiques qui sécrèteront l’IFNγ.
La visualisation des spots, donc de la sécrétion d’INFγ est permise par l’induction d’une réponse
immunitaire spécifique consécutive à l’immunisation des souris. La présentation du peptide par les
EL4 constitue alors une seconde exposition à l’antigène. La stimulation des LT CD8 induits fait
intervenir le complexe CMH-peptide-TCR et CD8. Afin de capturer l’IFNγ, des anticorps anti-IFNγ
sont fixés à la membrane de chaque puits. Les cellules sont mises à incuber durant une nuit à 37°C.
Les lavages permettent d’éliminer les cellules en laissant au fond des puits l’IFNγ capturé. S’en suit
alors la révélation de ce complexe à l’aide de l’anticorps de détection couplé à une biotine. On
ajoute ensuite la streptavidine, qui va se fixer à la biotine. Or la streptavidine porte une phosphatase
alcaline. Le substrat utilisé est le BCIP/NBT. La réaction enzymatique aboutit à un produit coloré
qui précipite sur la membrane, à l’endroit où se trouve la cellule spécifique, ce qui permet en
comptant le nombre de spots, de recenser le nombre de cellules spécifiques activées.
62
Des témoins positifs et négatifs sont mis en place. Le témoin positif est utilisé pour vérifier
que les cellules déposées dans les puits sont capables sous stimulation non spécifique de produire de
l’INFγ, et d’autre part de vérifier que les étapes de l’ELISPOT ont été correctement réalisées. Pour
cela, on met en présence les cellules CD8 avec une solution de PMA/ionomycine. L’ionomycine est
un ionophore permettant l’accroissement du niveau de Calcium intracellulaire. Utilisé en synergie
avec la PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate), l’ensemble permet la production de cytokines,
d’interférons, et de perforines. On doit donc obtenir des immunospots dans les puits correspondant
aux témoins positifs. Quant aux témoins négatifs, ils sont réalisés en incubant dans la plaque les
cellules T des différents lots, d’une part dans du milieu complet seul et d’autre part dans du milieu
complet contenant des EL4 n’ayant pas été en culture avec le peptide SL8. Le premier témoin est
fait dans le but de vérifier qu’il n’y a ni de sécrétion autonome des cellules T, ni d’IFNγ dans les
échantillons. Le second permet de vérifier ces deux points, mais aussi de prouver que les EL4 ne
produisent pas d’IFNγ et surtout que les LT8 sous une stimulation non spécifique par des CPA, ne
synthétisent pas d’IFNγ.
Réalisation :
Coating de la plaque à faire 24 h avant de lancer les expériences. Déposer 25µl/puits
d’éthanol à 70% et laisser incuber 30 secondes à température ambiante. Vider et laver 3 fois avec
100µl/puits de PBS 1X. Préparer 100µl/10ml d’anticorps de capture pour une plaque et déposer
100µL/puits. Incuber une nuit à 4°C avec du parafilm autour de la plaque.
Culture des cellules EL4 : transvaser la flasque dans un Falcon 50 ml et effectuer un comptage
cellulaire. Déposer 4 millions de cellules dans un Falcon noté EL4 et 4 millions dans un Falcon noté
EL4-SL8. Centrifuger ces tubes à 1600 tpm pendant 10 minutes à 20°C. Vider le surnageant et
remettre en suspension les cellules dans 1 ml de RPMI. Ajouter 10µg de peptide SL8 dans le tube
EL4-SL8. Incubation à l’étuve à 37°C pendant au moins 3h.
Sortir la plaque, la vider et laver 1 fois avec 100µl/puits avec du PBS 1X. Préparer 0,2g de lait pour
10 ml de PBS. Saturer la plaque en déposant 100µl/puits de lait. Incuber au moins 1h à 37°C.
63
Préparation de l’Elispot :
Les tubes de CD8+ à 1 million de cellules par ml doivent être prêts. Préparer la PMAionomycine (témoin positif). Mettre dans un tube, 2µl de PMA et 80µl de ionomycine pour 10 ml
de milieu complet. Sortir la plaque de l’étuve, la vider et taper fermement pour éliminer le lait.
Laver ensuite avec 100µl/puits de PBS 1X. Compléter les tubes EL4 et EL4-SL8 à 8ml. Répartir les
solutions dans les puits, 100µl par puits, et incuber une nuit à 37°C
Figure 14 : Schéma de la plaque Elispot
MC
EL4
EL4-SL8
PMA-iono
Souris 1 (100 000 cellules)
Souris 2 (100 000 cellules)
Souris 3 (100 000 cellules)
Souris 4 (100 000 cellules)
Souris 1 (50 000 cellules)
Souris 2 (50 000 cellules)
Souris 3 (50 000 cellules)
Révélation de l’Elispot :
Vider et taper la plaque doucement sur du papier absorbant. Déposer 100µl/puits de PBStween 20 0.1% et incuber 10 minutes à 4°C. Vider et laver 3 fois avec du PBS tween 20 0.1%.
Préparer l’anticorps de détection : 100µl/10ml de PBS-BSA 1% pour une plaque. Distribuer 100µl
par puits. Incuber 1h30 à 37°C. Vider et laver 3 fois avec du PBS tween. Préparer l’enzyme de
détection : 10µl/10 ml de PBS-BSA. Déposer 100µl/puits. Incuber une heure à 37°C. Vider et laver
3 fois avec du PBS tween. Taper fermement sur du papier absorbant. Distribuer le substrat :
100µl/puits de BCIP/NBT prêt à l’emploi (attention, manipuler sous la hotte consacrée aux produits
chimiques). Incuber entre 10 et 30 minutes selon l’apparition des spots et la coloration de la
64
membrane. Laver à l’eau du robinet en prenant les précautions nécessaires à l’élimination des
déchets. Bien laver, retirer la membrane et sécher la plaque. Celle-ci est prête pour la lecture.
65
3- Résultats
L’effet adjuvant de Viscum album a été testé sur 6 lots de 4 souris immunisées avec de
l’ovalbumine à des concentrations de 200µg et 1mg par voie intraveineuse ou intrapéritonéale
suivant un protocole d’immunisation en 3 injections. Les extraits de Viscum album fermenté du
laboratoire WELEDA ont été utilisés à des concentrations de 20µg et de 40µg et à des voies
d’injections différentes (intraveineuse et intra péritonéale). L’efficacité du Viscum album est
comparée à celle du CpG (50µg), adjuvant reconnu pour sa stimulation de la voie Th1.
Réglage du Facs et validation du marquage :
L’objectif de cette étape est double.
D’une part, elle permet de vérifier que la technique et le protocole utilisés permettent de
mettre en évidence des cellules T spécifiques de l’ovalbumine. Il s’agit de la validation de la
technique.
D’autre part, à partir du marquage obtenu pour la validation, on pourra régler le FACS de
manière à bien différencier le marquage spécifique du non spécifique. Le but étant d’être sûr qu’un
résultat positif est dû à un signal spécifique.
Pour cela, on utilise une souris OT1. Elle est génétiquement modifiée. Cette souris ne
possède que des cellules T CD8+ spécifiques du peptide SL8. De plus, elle a été immunisée comme
les autres souris, avec 1mg d’ovalbumine et 20µg de VA dans le but d’accroître la population de
CD8+ spécifiques du SL8. On s’attend alors à un marquage important du tétramère Kb-SL8. Cette
souris va nous permettre de régler le FACS sur ce signal positif. Il faut ensuite une souris nous
permettant d’avoir un signal négatif pour différencier les deux signaux. Pour cela, on utilise une
souris dite « naïve ». Il s’agit d’une souris C57/BL6 qui n’a pas été immunisée avec l’ovalbumine.
Elle n’a donc jamais été en contact avec cet antigène, et ne possède pas de CD8+ spécifique du
peptide SL8. Donc, si on obtient un marquage avec le tétramère Kb-SL8, on saura qu’il s’agit d’un
marquage non spécifique. On pourra alors faire la différence avec un signal positif (OT1) et un
signal négatif (souris naïve).
66
Résultats de ce marquage :
Figure 15 : Résultat du marquage tétramère du mélange souris OT1/ naïve
On a ici un mélange de cellules provenant de la souris OT1 et de la souris naïve :
On sélectionne la population de cellules (graphique A) qui nous intéressent en fonction de leur taille
et de leur granulosité. Ici, on aperçoit des nuages distincts qui correspondent à des lymphocytes.
On encadre alors cette population (R1) et le FACS ne prend en compte que le marquage des cellules
qui sont dans cette population là.
Le marquage vert du graphique C correspond au marquage avec un anticorps anti-isotype. C'est-àdire qu’il s’agit d’un anticorps anti-CD8+ dont le paratope a été remplacé par un paratope anti
isotype. Le but de celui-ci est de voir le marquage non spécifique. En effet, cet anticorps se fixe aux
67
cellules par une partie autre que son paratope. Quant au marquage violet, il s’agit de l’anticorps
anti-CD8+ qui s’est donc fixé à la molécule CD8. On aperçoit deux pics violet, dont un qui
correspond à du marquage non spécifique. On peut l’affirmer grâce à l’anticorps anti-isotype (qui
met en évidence le marquage non spécifique) qui se superpose à ce pic.
R2, correspond à la population que l’on sélectionne. On prend ainsi en compte uniquement les
cellules CD8+. La zone de chevauchement entre le spécifique et le non-spécifique est très réduite,
ceci nous garantit l’homogénéité de la population prise en compte.
Le principe est le même avec le marquage pentamère (graphique B). La courbe verte correspond au
Kb-VSV qui est donc le témoin du marquage non spécifique du tétramère. Le violet traduit le
marquage Kb-SL8. La superposition des deux courbes permet de sélectionner la population M1 qui
coïncide avec des CD8+ qui ont un TCR spécifique du peptide SL8.
Le graphique D est en fait, un résumé des deux précédents. La sélection a été ciblée uniquement sur
les CD8+ (d’où l’absence de nuage dans les cases du bas). L’axe des abscisses témoigne du
marquage pentamère Kb-SL8. On différencie alors les cellules portant un TCR spécifique à SL8 (à
droite car elles sont marquées par la fluorescence PE portée par le Kb-SL8) des cellules ayant un
TCR autre (à gauche, car elles ne portent pas le fluorochrome PE).
Le tableau E, quantifie le nuage. Le pourcentage « UR %Gated » correspond au nombre de
lymphocyte T CD8 qui ont fixé le pentamère Kb-SL8. Ici, il est de 62.82%. Donc parmi les 39 118
cellules CD8+ comptabilisées par le FACS, 62.82% d’entres elles sont spécifiques du peptide SL8.
Ce chiffre est très élevé car on travaille ici avec la souris OT1 (donc les cellules T sont spécifiques
de l’ovalbumine)
37.18% (UL %Gated) des cellules comptabilisées sont des CD8 non spécifiques du SL8. Ce chiffre
relativement élevé est normal car le tube contient un mélange de CD8 issus de la souris naïve et de
CD8 issus de la souris OT1. Il est donc normal de trouver des populations de CD8 spécifiques et
des non spécifiques. Le protocole mis en place est efficace étant donné que le tube « mélange » qui
a servi à régler le FACS comprenait ¾ de CD8+ issus d’OT1 et ¼ issus de la souris naïve. Parmi les
CD8+ comptés par le FACS, 62 % sont spécifiques de SL8 (provenant de la souris OT1) et 37% ne
le sont pas (provenant de la souris naïve). Les proportions sont donc quasiment conservées. Ce
protocole de marquage a donc pu mettre en évidence les différences de TCR entre les cellules
naïves et les OT1.
68
Validation de l’Elispot :
Afin de vérifier que la technique Elispot fonctionne avec notre modèle, nous l’avons réalisée
avec une souris OT1 et une souris naïve. Nous souhaitions notamment inspecter que les cellules
EL4 présentaient bien le peptide SL8. En effet, un des mécanismes d’échappement à la réponse
immunitaire développée par les cellules tumorales est de sous exprimer le CMH1 et donc de ne pas
présenter de peptide à leur surface. Etant donné que l’on travaille avec des cellules de thymome, il
nous paraît important de vérifier. D’après des expériences réalisées auparavant, nous avons pu
garantir que les cellules EL4 ne sécrétaient pas d’IFNγ. Pour cela, un test Elispot a été fait avec ces
cellules, afin de s’assurer que celui-ci était bien négatif.
69
Résultat de validation de l’Elispot:
Figure 16 : Visualisation de la plaque de validation
La plaque est interprétable étant donné que les différents témoins négatifs ou positifs ont
fonctionné. Le lecteur Elispot permet de comptabiliser les spots. La figure 17 ci-dessous est un
grossissement des colonnes 4 à 9 inclus.
70
Figure 17 : Comptage des immunospots sur la plaque de validation
Sur ce grossissement, on observe la présence de nombreux immunospots pour la souris OT1.
Ces spots, révélant l’IFNγ, mettent en évidence les cellules CD8+ spécifiques du peptide SL8
présentes chez la souris OT1. La 3ème ligne de l’Elispot correspond à la souris naïve. Seul un spot
est visible dans le puits 8, sans doute dû à un artefact. Ceci permet d’affirmer qu’on a bien une
réponse négative lorsque les CD8+ présents dans les puits ne sont pas spécifiques du complexe
CMH-peptide-TCR-CD8.
Cet essai a répondu à nos attentes, c'est-à-dire pouvoir détecter l’existence de cellules activées et
d’avoir une réponse négative en leur absence.
71
· Evaluation de la population de cellules CD8+ spécifiques de l’ovalbumine.
Le marquage Kb-VSV est un témoin de marquage non spécifique. Par soustraction avec le
marquage Kb-SL8, qui lui est spécifique du tétramère, il est alors possible d’éliminer le bruit de
fond. Pour chaque lot, on observe sur les graphiques de la figure 18, le marquage spécifique de
chaque souris.
Figure 18 : Comptage des cellules LT CD8+ spécifiques obtenues pour chaque souris.
72
Au sein de chaque lot, les réponses immunitaires sont homogènes pour chaque souris.
L’histogramme (figure 19) présente la moyenne des lymphocytes T CD8+ spécifiques (en
pourcentage) pour chaque lot.
Figure 19 : Moyenne de LT CD8+ spécifiques obtenues pour chaque lot
Pour chaque lot, on observe un marquage de population de lymphocytes CD8+, activés
spécifiquement contre le tétramère. Pour rappel, ces cellules reconnaissent le peptide SL8, présenté
sur le tétramère. Ce peptide étant issu de la dégradation de l’ovalbumine, afin que les cellules
puissent s’y fixer, elles doivent au préalable avoir été activées lors d’un premier contact avec
l’ovalbumine. Ces populations proviennent de l’immunisation des souris par l’ovalbumine.
Le lot 1 ne comportant que de l’ovalbumine (1mg), montre la réponse immunitaire de base
des souris induite par une injection en intra-péritonéale, sans ajout d’adjuvant. Le %gated UR de
0,33 correspond en fait aux cellules présentant une affinité avec le tétramère parmi les 150 000
73
cellules retenues par notre sélection (population R1 définie plus tôt), à savoir 435 cellules
spécifiques de l’ovalbumine activée par l’immunisation. Le lot 3 permet lui de juger de la réponse
immunitaire de base suite à une injection d’ovalbumine par voie intra-veineuse. Ces deux lots
constituent des témoins négatifs, qui nous seront utiles pour juger du pouvoir adjuvant de Viscum
album. Les 4 premiers lots présentent les mêmes caractéristiques. Seule la voie d’administration
change. L’immunisation par la voie intra-péritonéale semble plus importante (0.33% pour le lot 1,
0.49% pour le 2ieme lot, contre 0,17% pour les lots 3 et 4). Dans notre protocole, la voie intrapéritonéale parait donc plus adaptée que la voie intra-veineuse pour obtenir une réponse
immunitaire cellulaire spécifique.
Figure 20 : Différence entre les lots
En comparant les différents lots (figure 20), seule une différence est présente entre les lots 1
et 2. En effet, l’ajout de VAF dans le lot 2 aurait permis une augmentation de 0.16% de la réponse
immunitaire cellulaire spécifique, par la voie intra-péritonéale.
Cependant, la comparaison entre le lot 6 (contenant 50µg de CpG) et le lot 1 (Ova 1mg seul)
est nulle. Dans notre protocole, il n’a donc pas été possible d’avoir une réponse cellulaire accru par
l’emploi de CpG, alors que certaines études ont démontré l’efficacité de celui-ci comme adjuvant de
la réponse immunitaire à médiation cellulaire (KANDIMALLA et al., 2003 ; KLINMAN 2006).
Cela montre que notre protocole d’immunisation n’est pas adapté pour explorer, de manière fiable
et reproductible, cette réponse immunitaire. Quant à la voie intra-veineuse, non seulement la
74
réponse spécifique produit est faible (0.17%), mais l’ajout de VAF n’a pas permis d’augmenter le
nombre de LT CD8+ spécifique de l’ovalbumine.
· Evaluation de la fonctionnalité des cellules CD8 grâce à l’ELISPOT
Pour détecter la sécrétion d’IFNγ par les cellules CD8+ activées, les cellules issues de
l’immunisation ont été incubées en présence des EL4-SL8. Les immunospots sont comptabilisés par
le lecteur.
Afin d’interpréter les résultats (figure 21), il est important de comparer le témoin négatif (EL4
seule) avec notre échantillon (EL4 + SL8) pour chaque souris.
75
Figure 21 : Dénombrement des immunospots pour chaque souris.
76
Il n’y a que très peu d’immunospots dans les puits EL4, on peut alors interpréter les
résultats. La barre verte est obtenue en soustrayant les spots obtenus dans les échantillons aux spots
des témoins négatifs. Cela permet d’éliminer le bruit de fond.
Il faut cependant soustraire les échantillons contenant les VA avec les échantillons ne
contenant que de l’ovalbumine afin de déterminer le pouvoir adjuvant de celui-ci.
Une réponse est considérée comme positive lorsqu’il y a plus de 10 spots spécifiques, et que
le signal est au moins supérieur à 2x le bruit de fond.
Or, aucun des lots n’a de réponses positives. De plus, le lot 6, témoin positif, n’a pas
répondu à l’immunisation. Il est donc impossible de comparer les différents lots pour juger de
l’efficacité de VA.
De plus, les cellules CD8+ spécifiques du lot 1 mises en évidence par la cytométrie de flux
ne semble pas être fonctionnelles étant donné que le lot 1 n’a pas produit d’IFN γ.
L’Elispot n’a pas permis d’évaluer la fonctionnalité de la réponse immunitaire suite à notre
protocole d’immunisation : par conséquent il n’a pas été possible de mettre en évidence les effets de
VA sur la réponse immunitaire.
77
4- Discussion
Une très faible augmentation de la réponse immunitaire cellulaire spécifique de
l’ovalbumine a été mise en évidence par l’emploi de Viscum album fermenté lors d’une
immunisation en intra-péritonéale.
Cependant, il faut rester très prudent sur l’interprétation de ces résultats. En effet, les
cellules LT CD8+ spécifiques mises en évidence par la cytométrie de flux ne semblent pas être
capable de sécréter de l’IFNγ après une stimulation spécifique (absence de réponse à l’ELISPOT).
Elles ne semblent donc pas être fonctionnelles.
De plus, le protocole actuel ne semble pas adapté à l’exploration d’une réponse immunitaire
à médiation cellulaire. En effet, le lot 6 avait pour but de comparer l’emploi de Viscum album au
CpG, qui est un adjuvant de référence (McCLUSKIE et al., 2013). Or, une très faible réponse
cellulaire a eu lieu dans ce lot (seulement 0.02%). Dans d’autres protocoles, le CpG est capable
d’augmenter d’1% (TARTOUR et al., 2007) la réponse immunitaire cellulaire.
Par conséquent, pour évaluer l’efficacité de Viscum album comme adjuvant de la réponse
cellulaire, il sera donc primordial de modifier le protocole, notamment en modifiant l’antigène
utilisé.
En effet, l’ovalbumine est une protéine exogène ; celle-ci a probablement déclenché une
réponse immunitaire humorale, non recherchée dans notre étude, via une présentation par les CMH
II des cellules présentatrices d’antigène. Afin de déjouer cette réponse, nous avions immunisé les
lots avec des doses importantes d’ovalbumine (1 mg) et choisi un protocole en 3 injections dans
l’espoir d’avoir une immunisation intrinsèque comme décrit dans l’étude d’Eric Tartour
(TARTOUR et al., 2007) mais également pour déclencher une présentation croisée.
D’autres protocoles ont permis de mettre en évidence une réponse immunitaire cellulaire
avec l’emploi d’ovalbumine soit en la combinant via une sous unité de la toxine Shiga (VINGERT
et al., 2006), soit en immunisant à différentes semaines (McCLUSKIE et al., 2013).
Avant de poursuivre les investigations sur l’intérêt de Viscum album, il est important de
mettre au point un nouveau protocole d’immunisation avec le CpG, dans lequel on obtient une
78
réponse immunitaire augmentée. C’est à partir d’un tel modèle que l’on pourra à nouveau tester le
pouvoir adjuvant du gui, et conclure sur celui-ci en le comparant à la référence actuelle.
79
80
CONCLUSION
Les cellules de notre organisme se répliquent en permanence et meurent, contribuant ainsi au
maintien de l’homéostasie au sein d’un tissu. L’ADN subit des agressions quotidiennes et des
erreurs dans la réplication peuvent avoir lieu. Mais dans la grande majorité des cas, les mécanismes
de réparation de l’ADN, soit rétablissent les erreurs, soit détruisent les cellules. Cependant, des
mutations peuvent atteindre et modifier la structure d’un gène particulier, codant pour un facteur de
multiplication cellulaire : ces cellules peuvent alors donner des clones anormaux à l’origine de
tumeur.
Cependant, l’organisme de l’hôte est capable de détruire ces cellules anormales dès le
développement de celles-ci. En effet, elles présentent à leur surface des molécules anormales, peu
ou pas retrouvées sur des cellules saines. Les cellules de l’immunité innée sont capables de les
reconnaître et mettent alors en place différentes stratégies pour les détruire. Par la communication
des cellules de l’organisme, une réponse adaptative va se définir pour détruire de manière plus
efficace et plus spécifique les lésions tumorales. Ainsi, des tumeurs régressent avant même
l’apparition de signes cliniques.
Toutefois, les tumeurs ont développé au cours du temps, des stratégies pour échapper et renverser le
système immunitaire. Elles perdent l’expression des molécules de reconnaissance, résistent aux
signaux de destruction libérés par les cellules du système immunitaire, synthétisent des cytokines
immunosuppressives, inhibent les cellules de défense…
La découverte du concept d’immunosurveillance a conduit au développement d’une nouvelle
approche thérapeutique, l’immunothérapie, visant à amplifier la réponse immunitaire antitumorale
naturelle.
Beaucoup d’études se sont orientées vers le gui, Viscum album, car il contient des composants
immunostimulants. Ces derniers permettent la sécrétion de cytokines stimulant une réponse
immunitaire à médiation cellulaire. Ils favorisent la maturation et l’activation de cellules effectrices
et sont capables de détruire des cellules de l’endothélium vasculaire, donc, leur rôle est
particulièrement important pour le développement tumorale à travers l’angiogénèse.
81
Le but de cette étude a été de tester le pouvoir adjuvant du gui dans une vaccination. En comparant
une immunisation avec un antigène (l’ovalbumine) et cette même immunisation, en présence
d’extraits de gui, nous cherchions à mettre en évidence une augmentation marquée des cellules
effectrices du système immunitaire ainsi que l’efficacité de celles-ci à travers la sécrétion de
cytokine IFN-γ.
Cependant, le protocole mis en place n’a pas permis de mettre en évidence une réponse cellulaire
efficace. L’utilisation de CpG, pourtant reconnu comme étant un adjuvant fortement immunogène,
n’a pas induit une réponse immunitaire cellulaire significative dans le protocole mis en place. A
partir de là, aucune comparaison entre les lots complémentés en Viscum album et les lots témoins,
n’est relevant.
Toutefois, la piste de Viscum album est à approfondir. La mise au point d’un protocole
d’immunisation contre l’ovalbumine, avec plus ou moins l’utilisation de CpG, est indispensable
pour y intégrer ensuite Viscum album.
82
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immunosurveillance:
ÉTUDE EXPÉRIMENTALE DU POUVOIR
ADJUVANT DU GUI (Viscum album)
EN VACCINATION
GALLOIS Thomas
Résumé :
En 2011, le nombre de nouveaux diagnostics de cancer est estimé à 365 500 cas pour l’ensemble de
la population française. Afin de réduire la mortalité par cancer, de nombreuses pistes de recherche
sont exploitées et notamment en immunologie. En effet, les tumeurs mettent en place de multiples
stratégies pour déjouer et affaiblir de système immunitaire de l’hôte afin d’assurer leur croissance
aboutissant au cancer. Les études sur les propriétés du gui, Viscum album, ont mis en évidence non
seulement des effets anti tumoraux directs tel que l’inhibition de l’angiogénèse mais également un
effet immunostimulant in vitro. Notre étude a pour objectif de mettre en évidence, in vivo, une
réponse immunitaire cellulaire spécifiquement dirigée contre un antigène donné, induite par l’ajout
d’extrait de gui fermenté suite à une immunisation, et de tester sa fonctionnalité en mettant en
évidence la sécrétion d’interféron γ.
Mots clés : CANCER / ANTIGENE / ADJUVANT / REPONSE IMMUNITAIRE /
IMMUNISATION / GUI / VISCUM ALBUM
Jury :
Président : Pr.
Directeur : Dr Ludovic FREYBURGER
Assesseur : Dr Sophie LE PODER
EXPERIMENTAL STUDY OF THE POWER
ADJUVATING OF THE MISTLETOE VISCUM
ALBUM IN VACCINATION
GALLOIS Thomas
Summary
In 2011, the number of new diagnoses of cancer is estimated in 365 500 cases for the whole French
population. To reduce the mortality by cancer, numerous ways of research are exploited in
particular in immunology. Indeed, tumors set up multiple strategies to thwart and weaken of
immune system of the host to assure their growth ending in the cancer. The studies on the properties
of the mistletoe, Viscum album, highlighted not only an antitumor effect such as the inhibition of
the angiogenesis but also an in vitro immunoregulatory effect. Our study has for objective to
highlight, in vivo, a cellular immune response specifically managed against a given antigen, led by
the addition of extract of of mistletoe fermented further to an immunization, and to test its feature
by highlighting the secretion of interferon γ.
Keywords: CANCER / ANTIGEN /ADDITIVE / IMMUNE RESPONSE / IMMUNIZATION
/ GUI / VISCUM ALBUM
Jury :
President : Pr.
Director : Dr Ludovic FREYBURGER
Assessor : Dr Sophie LE PODER