Axe principal: NBS Spécification des destins cellulaires chez la souris http://www.ijm.fr/fr/ijm/recherche/equipes/destins-cellulaires/ Institut Jacques Monod UMR 7592 CNRS Université Paris Diderot Bâtiment Buffon - 15 rue Hélène Brion - 75013 Paris – France Directeur : Giuseppe BALDACCI http://www.ijm.fr/ Contacts C’nano de l’équipe PEREA GOMEZ Aitana [email protected] COLLIGNON Jérôme [email protected] Responsable d’équipe : COLLIGNON Jérôme [email protected] Membres permanents de l’équipe : AGHION Joël (Enseignant chercheur) [email protected] CAMUS Anne (Chercheur) [email protected] PEREA-GOMEZ Aitana (Chercheur) [email protected] SABÉRAN-DJONEIDI Délara (Enseignant chercheur) [email protected] _________________________________________________________________________ • Activités scientifiques de l’équipe : Notre équipe s’intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans l’embryogenèse précoce des mammifères. Par des approches de génétique, d’imagerie du vivant et d’embryologie expérimentale, nous étudions les réseaux d’interactions entre différents groupes cellulaires et la régulation fine, dynamique et intégrée, des processus de spécification, différenciation et prolifération ayant lieu au cours de la morphogenèse dans l’embryon de souris. Le facteur de croissance Nodal comme morphogène L’équipe s’intéresse au rôle du gène Nodal, codant un facteur de croissance de la famille TGFß, au cours du développement embryonnaire précoce de la souris. Nodal joue un rôle majeur dans la mise en place de la polarité antéro-postérieure, l’initiation de la gastrulation et l’établissement de l’asymétrie droite-gauchei. C’est une protéine sécrétée qui agit comme un morphogène en modulant à distance et de façon dose dépendante la prolifération et la différenciation cellulaires. Récemment, nous avons montré que la fonction de Nodal est essentielle pour le maintien de l’état pluripotent des cellules souches de l’embryon en empêchant leur différenciation prématurée en tissu neuralii. Par ailleurs nous avons généré des lignées de souris transgéniques où des protéines fluorescentes s’expriment sous le contrôle de séquences régulatrices de Nodal, ce qui permet de suivre la dynamique de l’activité de la voie de signalisation Nodal au sein de l’embryon avec une résolution cellulaire (Fig. 1)iii. Figure 1. Le facteur de croissance Nodal dans l’embryon précoce de souris. (a) Embryon sauvage à 6.5 jours de développement (E6.5). (b) Embryon mutant pour le gène Nodal à E6.5: la polarité antéropostérieure n’est pas établie. (c) Expression du transgène ASE-YFP, permettant de suivre la signalisation Nodal à E5.0. Les cellules exprimant le transgène apparaissent avec leur noyau coloré en vert, l’actine de surface de toutes les cellules apparaît en rouge. (d) Expression du transgène ASEYFP, à E4.5 dans les cellules pluripotentes de l’épiblaste. A: antérieur, P: postérieur, ExE: ectoderme extra-embryonnaire, Epi: épiblaste, VE: endoderme viscéral, PrE: endoderme primitif. Echelle=50µm. • Recherche(s) et résultat(s) obtenu(s) dans les domaines d’action des nanosciences : Mise au point d’un microsystème pour l’électroporation localisée d’embryons de souris Notre équipe met en œuvre des approches innovantes pour l’étude quantitative et dynamique des phénomènes biologiques mis en jeu lors du développement embryonnaire. Nous avons ainsi établi une collaboration avec l’équipe de C. Gosse (Laboratoire de Photonique et Nanostructures, CNRS UPR 20, Marcoussis) afin de concevoir et fabriquer des outils adaptés à la manipulation de l’expression génique de petites sous-populations de cellules dans l’embryon. Plus précisément, nos travaux utilisent l’électroporation, technique de modification locale de l’expression des gènes qui consiste en l’application d’impulsions électriques provoquant la formation de pores transitoires au travers desquels des acides nucléiques peuvent pénétrer dans le cytoplasmeiv. Cette technique est difficile à implémenter à des stades précoces chez la souris, la petite taille des embryons rendant l’utilisation du matériel commercial peu prédictible et peu reproductiblev. La localisation précise des effets du champ électrique ne pouvant être obtenue qu’en utilisant des électrodes d’une taille comparable à celle de la zone cible, nous avons donc réalisé des dispositifs dont la production met en en œuvre diverses technologies de microfabrication, les seules permettant d’atteindre une résolution spatiale de quelques microns tout en assurant une excellente reproductibilité de la cartographie du champ électrique appliqué d’une expérience à l’autre. Un modèle physique simple et robuste, appuyé par des simulations numériques, nous permet de guider la conception du microsystème et d’établir des protocoles expérimentaux reproductibles. Les premiers prototypes fabriqués au LPN ont apporté des résultats encourageants : La biocompatibilité des dispositifs est satisfaisante, et nous avons obtenu des électroporations localisées (Fig. 2) dans les embryons de souris en culturevi. A B C Figure 2. Dispositif pour l’électroporation localisée. (a) Premier prototype. (b) Projet de dispositif incorporant des guides diélectriques. (c) Embryon de souris électroporé à E6.5 montrant la présence de Dextran-FITC de façon localisée dans quelques cellules l’endoderme viscéral. Echelle=100µm • Programme de recherche : Morphogenèse et contrainte mécanique Par ailleurs, notre équipe met en œuvre diverses approches de lignage cellulaire (suivi du devenir de cellules uniques au sein de l’embryon) pour l’étude des évènements morphogénétiques impliqués dans le développement précoce de la sourisvii. Nous avons mis en évidence un changement de forme jusque-là insoupçonné impliquant l’ensemble des tissus embryonnaires et extra-embryonnaires lors de la croissance de l’embryon de souris après l’implantationviii. Ces observations ouvrent de nouvelles perspectives de recherche pour la compréhension du rôle des contraintes mécaniques dans la régionalisation précoce de l’embryon de souris. L’effet des tensions mécaniques sur la régulation des comportements cellulaires a été décrit dans des cellules en culture et commence à être mieux compris dans certains organismes multicellulaires tels l’embryon de drosophile. Cependant chez l’embryon de souris, l’impact des contraintes mécaniques générées par la matrice extra-cellulaire et l’architecture des tissus sur des phénomènes tels l’acquisition de la polarité et la spécification cellulaires n’est pas connu. Afin d’explorer cette question nous souhaitons combiner des outils de traçage cellulaire développés dans notre laboratoire avec des approches innovantes d’imagerie in toto et d’analyse d’images automatisée à haut débitix, et des techniques de micromanipulation et mesure de force (ablation laser, pinces optiques). Perspectives et intérêt pour le réseau C’nano IdF Nous souhaitons aujourd’hui orienter nos recherches sur la dynamique de l’embryon de mammifère vers des approches permettant de manipuler et de mesurer avec précision et reproductibilité l’expression des gènes et les tensions mécaniques s’exerçant localement sur les cellules au sein d’un organisme complexe. Pour être pertinentes, ces études devront être menées avec des outils travaillant avec des résolutions spatiales micrométriques à submicrométriques. La participation au C’nano IdF, dans le thème nano-biosciences, nous permet de renforcer les collaborations existantes avec des équipes possédant une expertise en nano et microfabrication, mais aussi de débuter de nouvelles recherches dans le domaine de l’étude des tensions mécaniques et de leur impact sur les destinées cellulaires. De plus notre expertise en génétique moléculaire couplée aux approches d’imagerie in vivo et de micromanipulations d’embryons de souris cultivés in vitro pourra être partagée avec les membres de la communauté souhaitant examiner des phénomènes décrits à l’échelle cellulaire et/ou subcellulaire dans le contexte d’un organisme complexe et dynamique. • i Références : Conlon FL et al. (1994) Development, 7, 1919-1928 ; Brennan J et al. (2001) Nature, 411, 965-969 ; Collignon J, et al. (1996) Nature, 381, 155-158 . ii Camus, A., Perea-Gomez, A., Moreau, A and Collignon, J. (2006). Absence of Nodal signaling promotes precocious neural differentiation in the mouse embryo. Dev. Biol. 295: 743-55. iii Granier C, Gurchenkov V, Perea-Gomez A, Camus A, Ott S, Papanayotou C, Iranzo J, Moreau A, Reid J, Koentges G, Sabéran-Djoneidi D and Collignon J. Nodal cis-regulatory elements reveal epiblast and primitive endoderm heterogeneity in the peri-implantation mouse embryo. Dev. Biol. 349 (2011) 350-362 iv Golzio M, et al. (2004) Methods 33, 126-135. v Soares ML, et al. (2008) Dev. Growth Differ. 50, 615-621 ; Mellitzer G, et al. (2002) Mech. Dev. 118, 57-63 ; Khoo PL, et al. (2007) CSH Protoc. doi:10.1101/pdb.prot4893 vi Mazari E, Laniel J, Dubois G, Griffon S, Marty F, Perea-Gomez A, and Gosse C. Mouse embryo electroporation th and culture in devices made by soft lithography. MicroTAS 2010, Proceedings of the 14 International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. S. Verpoorte, H. Andersson-Svahn, J. Emnéus, and N. Pamme (Eds), pp. 312-314. vii Perea-Gomez A, Meilhac SM, Piotrowska-Nitsche K, Gray D, Collignon J, Zernicka-Goetz M. Regionalization of the mouse visceral endoderm as the blastocyst transforms into the egg cylinder. BMC Dev Biol. 2007 Aug 16;7:96. viii Perea-Gomez A, Camus A, Moreau A, Grieve K, Moneron G, Dubois A, Cibert C, Collignon J. Initiation of gastrulation in the mouse embryo is preceded by an apparent shift in the orientation of the anterior-posterior axis. Curr Biol. 2004 Feb 3;14(3):197-207. ix Supatto W, et al., Nat Protoc. (2009) 4(10), 1397-412.