Spécification des destins cellulaires chez la souris

Axe principal: NBS
Spécification des destins cellulaires chez la souris
http://www.ijm.fr/fr/ijm/recherche/equipes/destins-cellulaires/
Institut Jacques Monod
UMR 7592 CNRS Université Paris Diderot
Bâtiment Buffon - 15 rue Hélène Brion - 75013 Paris – France
Directeur : Giuseppe BALDACCI
http://www.ijm.fr/
Contacts C’nano de l’équipe
PEREA GOMEZ Aitana
[email protected]paris-diderot.fr
COLLIGNON Jérôme
[e-mail]
Responsable d’équipe :
COLLIGNON Jérôme
[e-mail]
Membres permanents de l’équipe :
AGHION Joël (Enseignant chercheur)
[email protected]-paris-diderot.fr
CAMUS Anne (Chercheur)
[email protected]-paris-diderot.fr
PEREA-GOMEZ Aitana (Chercheur)
[e-mail]
SABÉRAN-DJONEIDI Délara (Enseignant chercheur)
[e-mail]

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• Activités scientifiques de l’équipe :
Notre équipe s’intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans
l’embryogenèse précoce des mammifères. Par des approches de génétique, d’imagerie du
vivant et d’embryologie expérimentale, nous étudions les réseaux d’interactions entre
différents groupes cellulaires et la régulation fine, dynamique et intégrée, des processus de
spécification, différenciation et prolifération ayant lieu au cours de la morphogenèse dans
l’embryon de souris.
Le facteur de croissance Nodal comme morphogène
L’équipe s’intéresse au rôle du gène Nodal, codant un facteur de croissance de la
famille TGFß, au cours du développement embryonnaire précoce de la souris. Nodal joue un
rôle majeur dans la mise en place de la polarité antéro-postérieure, l’initiation de la
gastrulation et l’établissement de l’asymétrie droite-gauche
i
. C’est une protéine sécrétée qui
agit comme un morphogène en modulant à distance et de façon dose dépendante la
prolifération et la différenciation cellulaires. Récemment, nous avons montré que la fonction
de Nodal est essentielle pour le maintien de l’état pluripotent des cellules souches de
l’embryon en empêchant leur différenciation prématurée en tissu neural
ii
. Par ailleurs nous
avons généré des lignées de souris transgéniques où des protéines fluorescentes
s’expriment sous le contrôle de séquences régulatrices de Nodal, ce qui permet de suivre la
dynamique de l’activité de la voie de signalisation Nodal au sein de l’embryon avec une
résolution cellulaire (Fig. 1)
iii
.
Figure 1. Le facteur de croissance Nodal dans l’embryon précoce de souris. (a) Embryon sauvage à
6.5 jours de développement (E6.5). (b) Embryon mutant pour le gène Nodal à E6.5: la polarité antéro-
postérieure n’est pas établie. (c) Expression du transgène ASE-YFP, permettant de suivre la
signalisation Nodal à E5.0. Les cellules exprimant le transgène apparaissent avec leur noyau coloré
en vert, l’actine de surface de toutes les cellules apparaît en rouge. (d) Expression du transgène ASE-
YFP, à E4.5 dans les cellules pluripotentes de l’épiblaste. A: antérieur, P: postérieur, ExE: ectoderme
extra-embryonnaire, Epi: épiblaste, VE: endoderme viscéral, PrE: endoderme primitif. Echelle=50µm.

• Recherche(s) et résultat(s) obtenu(s) dans les domaines d’action des
nanosciences :
Mise au point d’un microsystème pour l’électroporation localisée d’embryons de
souris
Notre équipe met en œuvre des approches innovantes pour l’étude quantitative et
dynamique des phénomènes biologiques mis en jeu lors du développement embryonnaire.
Nous avons ainsi établi une collaboration avec l’équipe de C. Gosse (Laboratoire de
Photonique et Nanostructures, CNRS UPR 20, Marcoussis) afin de concevoir et fabriquer
des outils adaptés à la manipulation de l’expression génique de petites sous-populations de
cellules dans l’embryon.
Plus précisément, nos travaux utilisent l’électroporation, technique de modification
locale de l’expression des gènes qui consiste en l’application d’impulsions électriques
provoquant la formation de pores transitoires au travers desquels des acides nucléiques
peuvent pénétrer dans le cytoplasme
iv
. Cette technique est difficile à implémenter à des
stades précoces chez la souris, la petite taille des embryons rendant l’utilisation du matériel
commercial peu prédictible et peu reproductible
v
. La localisation précise des effets du champ
électrique ne pouvant être obtenue qu’en utilisant des électrodes d’une taille comparable à
celle de la zone cible, nous avons donc réalisé des dispositifs dont la production met en en
œuvre diverses technologies de microfabrication, les seules permettant d’atteindre une
résolution spatiale de quelques microns tout en assurant une excellente reproductibilité de la
cartographie du champ électrique appliqué d’une expérience à l’autre. Un modèle physique
simple et robuste, appuyé par des simulations numériques, nous permet de guider la
conception du microsystème et d’établir des protocoles expérimentaux reproductibles.
Les premiers prototypes fabriqués au LPN ont apporté des résultats encourageants :
La biocompatibilité des dispositifs est satisfaisante, et nous avons obtenu des
électroporations localisées (Fig. 2) dans les embryons de souris en culture
vi
.
A
B
C
Figure 2. Dispositif pour l’électroporation localisée. (a) Premier prototype. (b) Projet de dispositif
incorporant des guides diélectriques. (c) Embryon de souris électroporé à E6.5 montrant la présence
de Dextran-FITC de façon localisée dans quelques cellules l’endoderme viscéral. Echelle=100µm

• Programme de recherche :
Morphogenèse et contrainte mécanique
Par ailleurs, notre équipe met en œuvre diverses approches de lignage cellulaire
(suivi du devenir de cellules uniques au sein de l’embryon) pour l’étude des évènements
morphogénétiques impliqués dans le développement précoce de la souris
vii
. Nous avons mis
en évidence un changement de forme jusque-là insoupçonné impliquant l’ensemble des
tissus embryonnaires et extra-embryonnaires lors de la croissance de l’embryon de souris
après l’implantation
viii
. Ces observations ouvrent de nouvelles perspectives de recherche
pour la compréhension du rôle des contraintes mécaniques dans la régionalisation précoce
de l’embryon de souris. L’effet des tensions mécaniques sur la régulation des
comportements cellulaires a été décrit dans des cellules en culture et commence à être
mieux compris dans certains organismes multicellulaires tels l’embryon de drosophile.
Cependant chez l’embryon de souris, l’impact des contraintes mécaniques générées par la
matrice extra-cellulaire et l’architecture des tissus sur des phénomènes tels l’acquisition de la
polarité et la spécification cellulaires n’est pas connu. Afin d’explorer cette question nous
souhaitons combiner des outils de traçage cellulaire développés dans notre laboratoire avec
des approches innovantes d’imagerie in toto et d’analyse d’images automatisée à haut
débit
ix
, et des techniques de micromanipulation et mesure de force (ablation laser, pinces
optiques).
Perspectives et intérêt pour le réseau C’nano IdF
Nous souhaitons aujourd’hui orienter nos recherches sur la dynamique de l’embryon de
mammifère vers des approches permettant de manipuler et de mesurer avec précision et
reproductibilité l’expression des gènes et les tensions mécaniques s’exerçant localement sur
les cellules au sein d’un organisme complexe. Pour être pertinentes, ces études devront être
menées avec des outils travaillant avec des résolutions spatiales micrométriques à sub-
micrométriques. La participation au C’nano IdF, dans le thème nano-biosciences, nous
permet de renforcer les collaborations existantes avec des équipes possédant une expertise
en nano et microfabrication, mais aussi de débuter de nouvelles recherches dans le domaine
de l’étude des tensions mécaniques et de leur impact sur les destinées cellulaires. De plus
notre expertise en génétique moléculaire couplée aux approches d’imagerie in vivo et de
micromanipulations d’embryons de souris cultivés in vitro pourra être partagée avec les
membres de la communauté souhaitant examiner des phénomènes décrits à l’échelle
cellulaire et/ou subcellulaire dans le contexte d’un organisme complexe et dynamique.
• Références :
i
Conlon FL et al. (1994) Development, 7, 1919-1928 ; Brennan J et al. (2001) Nature, 411, 965-969 ; Collignon J,
et al. (1996) Nature, 381, 155-158 .

ii
Camus, A., Perea-Gomez, A., Moreau, A and Collignon, J. (2006). Absence of Nodal signaling promotes
precocious neural differentiation in the mouse embryo. Dev. Biol. 295: 743-55.
iii
Granier C, Gurchenkov V, Perea-Gomez A, Camus A, Ott S, Papanayotou C, Iranzo J, Moreau A, Reid J,
Koentges G, Sabéran-Djoneidi D and Collignon J. Nodal cis-regulatory elements reveal epiblast and primitive
endoderm heterogeneity in the peri-implantation mouse embryo. Dev. Biol. 349 (2011) 350-362
iv
Golzio M, et al. (2004) Methods 33, 126-135.
v
Soares ML, et al. (2008) Dev. Growth Differ. 50, 615-621 ; Mellitzer G, et al. (2002) Mech. Dev. 118, 57-63 ;
Khoo PL, et al. (2007) CSH Protoc. doi:10.1101/pdb.prot4893
vi
Mazari E, Laniel J, Dubois G, Griffon S, Marty F, Perea-Gomez A, and Gosse C. Mouse embryo electroporation
and culture in devices made by soft lithography. MicroTAS 2010, Proceedings of the 14
th
International Conference
on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. S. Verpoorte, H. Andersson-Svahn, J. Emnéus, and N.
Pamme (Eds), pp. 312-314.
vii
Perea-Gomez A, Meilhac SM, Piotrowska-Nitsche K, Gray D, Collignon J, Zernicka-Goetz M. Regionalization of
the mouse visceral endoderm as the blastocyst transforms into the egg cylinder. BMC Dev Biol. 2007 Aug
16;7:96.
viii
Perea-Gomez A, Camus A, Moreau A, Grieve K, Moneron G, Dubois A, Cibert C, Collignon J. Initiation of
gastrulation in the mouse embryo is preceded by an apparent shift in the orientation of the anterior-posterior axis.
Curr Biol. 2004 Feb 3;14(3):197-207.
ix
Supatto W, et al., Nat Protoc. (2009) 4(10), 1397-412.