Développement d`un système d`histologie massive

Développement d’un système d’histologie massive multimodale pour l’imagerie ex-vivo
Alexandre Castonguay, Patrick Delafontaine-Martel, Joël Lefebvre, Pier-Luc Tardif
Laboratoire d’imagerie optique et moléculaire (LIOM), Polytechnique Montréal
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Introduction
À ce jour, l'histologie demeure l’outil de référence pour déterminer la nature d’un tissu ainsi que la
composition moléculaire un échantillon biologique. Quoi qu’efficace, l’histologie n'offre qu'un petit
aperçu de l'organe entier. Le système que notre équipe a conçu permet d’imager un organe et
d’obtenir une carte anatomique tridimensionnelle à haute définition en plus d’obtenir de
l’information sur la composition moléculaire des tissus. Le système est constitué de deux
composantes : (1) un trancheur fait d’un vibratome fait sur mesure et de moteurs micrométriques (2)
Un microscope de la modalité désirée (OCT, confocale, 2 photons, etc.).
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Fig. 1 : Schéma du montage d’histologie massive développé. Une acquisition génère
une mosaïque 3D d’images / volumes qui sont assemblés sur ordinateur en un seul
volume.
Méthodologie
Acquisition
L’organe d’intérêt est fixé dans un gel d’agarose, puis il est placé au focus du microscope et imagé
avec la modalité désirée. Le vibratome et les moteurs permettent de couper une tranche très mince.
Le support à échantillon est muni de moteurs effectuant des déplacements latéraux permettant
d’imager la tranche en entier si les dimensions de l’organe dépassent le champ de vue du
microscope. Un algorithme de détection de surface permet ensuite de replacer l’organe au focus et
d’imager la tranche suivante. Cette technique permet d’imager automatiquement tout l’organe.
Reconstruction
En s’assurant d’avoir une zone de recouvrement entre chaque image adjacente dans cette mosaïque,
l’ensemble de données brutes est assemblé sur ordinateur. L’algorithme de reconstruction est séparé
en 3 étapes principales : (1) calcul de la position des volumes au sein de chaque tranche, (2)
reconstruction des tranches de tissu et (3) assemblage des tranches en un seul volume.
Fig. 3 : Exemples de tissus imagés avec le microscope OCT/Confocale (A) Carte d’atténuation optique
dans une tranche de cerveau de souris obtenue à partir de l’analyse de la variation spatiale du
contraste OCT. L’atténuation optique peut être utilisée pour segmenter la matière blanche. (B)
Mesure de la fluorescence (rouge) d’une plaque d’artériosclérose dans une aorte de lapin. Cette
mesure est obtenue par microscopie confocale et l’information anatomique est obtenue par
microscopie OCT. (C) Carte anatomique d’une tranche de cœur de souris acquise en OCT (D) Carte
d’orientation des fibres musculaires dans la même tranche
Microscopie à fluorescence 2-photons
Le système de trancheur peut être déplacé entre le microscope OCT / confocal et le microscope par fluorescence 2photons. Cette modalité optique peut soit être utilisée pour mesurer le contraste intrinsèque des tissus ou bien la
distribution spatiale dans le tissu d’un agent de contraste fluorescent qui a été injecté dans l’animal avant le sacrifice. Par
exemple, en injectant du FITC dans les vaisseaux sanguins, il est possible de mesurer le réseau microvasculaire dans
l’ensemble du cerveau. Aussi, en utilisant du Evans Blue la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique peut être
étudiée.
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Fig. 2 : Exemple de tissus imagés et assemblés à l’aide de notre technique. (A)
Tranche de cerveau de rat assemblée à partir de volumes OCT (B) Volume reconstruit
à partir des tranches OCT présentées en (A). La microscopie OCT permet d’imager les
fibres neuronales myélinisées
Applications
Microscopie OCT / Confocal
La tomographie par cohérence optique (OCT) permet d’observer les interfaces entre les différentes
couches de tissus d’un échantillon biologique. De plus, dans le cas du cerveau, l’OCT possède un
contraste plus élevé pour les fibres neuronales myélinisées. Notre système permet donc d’obtenir une
cartographie tridimensionnelle à l’échelle micrométrique des fibres de matières blanches dans le
cerveau. Une analyse similaire peut être réalisée dans des tranches de cœurs, où la distribution
spatiale de l’orientation des fibres de myocarde pourrait servir à étudier la propagation des champs
électriques dans le cœur. Notre microscope OCT peut être combiné à un microscope confocale, ce qui
permet d’imager dans le même référentiel la réflectivité optique des couches de tissus et la
distribution spatiale d’un agent de contraste fluorescent.
Fig. 4 : Tranches reconstruites à partir d’image acquises par microscopie à fluorescence 2-photons.
(A) Carte de la microvasculature dans le cerveau obtenue en injectant du FITC (avec zoom in sur la
région encadrée) et (B) Bris de la barrière hématoencéphalique imagé en injectant du Evans-Blue.
Références et remerciements
Wang H., Zhu J., Akkin, T. Serial optical coherence scanner for large-scale brain imaging
at microscopic resolution. NeuroImage 2014;84:1007-1017.
Polytechnique Montréal