Implication des Galectines-3, 7 et 9 dans la réponse immunitaire

GUILLAUME ST-PIERRE
Implication des Galectines-3, 7 et 9 dans la réponse immunitaire
contre le parasite Leishmania major
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie-immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)
DÉPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE-INFECTIOLOGIE ET D'IMMUNOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Guillaume St-Pierre, 2013
ii
Résumé
La galectine-3, une protéine cytosolique de l’hôte est impliquée dans la réponse
immunitaire contre Leishmania major, un parasite protozoaire causant une infection
cutanée. Lors d’une infection avec la souche LV39 de L. major, la galectine-3 se libère
dans le milieu extracellulaire et participe au recrutement de neutrophiles au site d’infection.
La galectine-3 ne semble cependant pas impliquée lors d’infections avec la souche L. major
Friedlin qui possède un arrangement de saccarides différent sur ses phosphoglycans. In
vitro, les deux souches de L. major sont en mesure de cliver la galectine-3, mais LV39
semble plus efficace. Différents essais ont été effectués in vivo afin de vérifier si les
galectines-7 et 9 peuvent aussi avoir un rôle à jouer lors d’infection avec L. major. Alors
qu’aucun effet significatif n’a pu être attribué à la galectine-9, l’absence de galectine-7
semble apporter une guérison plus rapide des lésions engendrées par L. major Friedlin.
iii
Abstract
Our recent data suggest that galectin-3, a host cytosolic protein is involved in the immune
response against the Leishmania major strain LV39, which induces cutaneous infection.
Following infection with this parasite, galectin-3 is released in the extracellular space and
plays a role in neutrophil recruitment. In contrast, in another L. major strain called Friedlin,
which expresses a different glycan structure on the phosphoglycans, galectin-3 has no
impact on the host immune response and disease outcome. Our laboratory previously
reported that L. major LV39 cleaves galectin-3. Our data suggest that both L. major strains
are able to cleave galectin-3 in vivo, although the cleavage by LV39 is more efficient than
that by Friedlin. We also addressed the role of galectins-7 and 9 in a murine L. major
infection model. Lack of galectin-9 did not alter the pathogenesis of Leishmania infection.
In contrast, lack of galectin-7 contributed to improve healing process.
iv
Table des matières
Résumé............................................................................................................................................ ii
Abstract.......................................................................................................................................... iii
Table des matières ..................................................................................................................... iv
Liste des tableaux ....................................................................................................................... vi
Liste des figures ......................................................................................................................... vii
Liste des abréviations ............................................................................................................... ix
Introduction .................................................................................................................................. 1
Généralités sur le parasite Leishmania .......................................................................................... 1
Leishmania, le parasite.................................................................................................................................... 1
Leishmania, la maladie .................................................................................................................................... 2
Leishmania, le cycle parasitaire................................................................................................................... 4
Leishmania, les molécules de surface ....................................................................................................... 5
Réponse immunitaire ........................................................................................................................... 8
Réponse immunitaire : La théorie du soi, non-soi............................................................................... 9
Réponse immunitaire : La théorie du danger ...................................................................................... 10
Le neutrophile .................................................................................................................................................. 11
Neutrophiles et immunité : les granules du neutrophile................................................................ 13
Neutrophiles et immunité : recrutement cellulaire .......................................................................... 15
Le macrophage ................................................................................................................................................. 17
La phagocytose................................................................................................................................................. 18
Peau et immunité ................................................................................................................................ 18
Peau et immunité : Les kératinocytes..................................................................................................... 20
Peau et immunité : Les cellules dendritiques ...................................................................................... 20
Peau et immunité : Les macrophages ..................................................................................................... 21
Peau et immunité : Les lymphocytes T................................................................................................... 21
Leishmania et immunité ................................................................................................................... 22
Neutrophiles et Leishmania ........................................................................................................................ 23
Macrophages et Leishmania ....................................................................................................................... 24
Lymphocytes T et Leishmania ................................................................................................................... 25
Évasion de la réponse immunitaire ......................................................................................................... 26
Traitements et prévention de la leishmaniose ................................................................................... 27
Glycobiologie ........................................................................................................................................ 29
Galectines ........................................................................................................................................................... 31
Galectines et immunité ................................................................................................................................. 33
Galectines et immunité : Neutrophiles ................................................................................................... 33
Galectines et immunité : Monocytes et macrophages ...................................................................... 34
Galectines et immunité : Cellules dendritiques .................................................................................. 36
Galectines et immunité : Lymphocytes T .............................................................................................. 37
Galectine-7 ......................................................................................................................................................... 38
Galectines et Leishmania .............................................................................................................................. 38
Objectifs de recherche ............................................................................................................. 40
v
Matériel et méthodes ............................................................................................................... 41
Souris ................................................................................................................................................................... 41
Galectine-3 recombinante ........................................................................................................................... 41
Parasites et cellules ........................................................................................................................................ 43
Modèle d’infection du coussinet plantaire............................................................................................ 44
Modèle de la poche d’air............................................................................................................................... 45
Détection de la Gal-3 par Western Blot.................................................................................................. 45
Analyse des cytokines des échantillons de lavages de poche d’air par ELISA ....................... 46
Analyses statistiques ..................................................................................................................................... 46
Résultats ....................................................................................................................................... 47
Résultats connexes précédemment obtenus au laboratoire............................................... 47
Résultats obtenus au cours de ce mémoire de maîtrise ....................................................... 49
Implication de la Gal-3 dans la réponse immunitaire contre les souches LV39 et Friedlin
du parasite Leishmania major .................................................................................................................... 49
Clivage de la Gal-3 par les souches LV39 et Friedlin du parasite Leishmania major .......... 51
Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le parasite
Leishmania : Expérience de la poche d’air ............................................................................................ 56
Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le parasite
Leishmania : Expérience d’infection du coussinet plantaire ......................................................... 58
Discussion .................................................................................................................................... 61
Implication de la Gal-3 dans le recrutement de neutrophiles lors d’infections avec le
parasite L. major LV39. ................................................................................................................................. 61
Libération de Gal-3 dans la poche d’air lors de stimulations avec L. major LV39................ 63
L. major LV39 et L. major Friedlin peuvent cliver la Gal-3, mais la cinétique de clivage est
ralentie dans des conditions se rapprochant de ce qui est rencontré in vivo. ....................... 65
La Gal-7 inhibe le recrutement cellulaire induit lors de la stimulation avec L. major
Friedlin ................................................................................................................................................................ 68
Les souris Gal-7 KO ont une phase de guérison plus rapide que les souris WT lors de
l’infection du coussinet plantaire avec L. major Friedlin ................................................................ 70
La Gal-9 a un effet inhibiteur sur le recrutement cellulaire lors d’infection avec le
parasite L. major Friedlin............................................................................................................................. 71
L’infection du coussinet plantaire avec L. major ne diffère que très peu d’un point de vue
global entre les souris Gal-9 KO et les souris WT .............................................................................. 72
Conclusion.................................................................................................................................... 74
Bibliographie .............................................................................................................................. 75
vi
Liste des tableaux
Tableau 1: Classification des différentes espèces de Leishmania en fonction du séquençage
du gène HSP70............................................................................................................... 2
Tableau 2: Comparaison du nombre de répétitions de Galβ1-3 retrouvées sur les chaines
latérales du LPS de différentes souches et espèces de Leishmania. .............................. 7
Tableau 3: Les granules et vésicules sécrétoires du neutrophile ......................................... 13
vii
Liste des figures
Figure 1 : Évolution morphologique du parasite Leishmania major en culture. La
transformation de l'amastigote vers le promastigote se fait en environ 24h (Schneider
et al., 1992). ................................................................................................................... 1
Figure 2: Cycle parasitaire de Leishmania ............................................................................ 4
Figure 3: Molécules de surface du promastigote Leishmania ............................................... 5
Figure 4 : Structure du LPG de Leishmania .......................................................................... 6
Figure 5: Clivage de la Gal-3 Visualisation sur gel d’acrylamide coloré au Bleu de
Coomassie, d’une expérience de clivage de la Gal-3 .................................................... 7
Figure 6 : Représentation schématisée de la réponse immunitaire selon la théorie du soi,
non-soi ......................................................................................................................... 10
Figure 7 : Schématisation simplifiée de la réponse immunitaire selon la théorie du danger
..................................................................................................................................... 11
Figure 8: Les différentes cellules immunitaires de l'épiderme et du derme humain ........... 19
Figure 9: Représentation imagée de la théorie du cheval de Troie impliquant le neutrophile
et le macrophage lors de l'infection avec Leishmania ................................................. 23
Figure 10: Les souris C57BL/6 et BALB/c ont des réactions immunitaires différentes face
au parasite Leishmania; la maladie progresse aussi différemment chez ce deux
souches de souris ......................................................................................................... 25
Figure 11: Photographie en microscopie électronique d'un marquage spécifique du
glycocalyx .................................................................................................................... 29
Figure 12: N-glycosylation et O-glycosylation chez les eucaryotes.................................... 29
Figure 13: Le contrôle de la glycosylation chez les mammifères ........................................ 30
Figure 14: Les 3 familles de galectines et leurs membres respectifs ................................... 31
Figure 15: Rôles connus de différentes galectines au niveau des cellules immunitaires .... 33
Figure 16: Test d'hémaglutination des globules rouges effectué comme contrôle qualité des
galectines produites dans notre laboratoire .................................................................. 42
Figure 17: Résultats obtenus suite à l'infection expérimentale de souris Gal-3 KO et WT
avec le parasite Leishmania ......................................................................................... 47
Figure 18: Mesure de la quantité de neutrophiles dans le coussinet plantaire et dans le
noeud lymphatique le drainant. Mesures effectuées à 12h et 24h post infection chez les
souris Gal-3 KO et WT. ............................................................................................... 48
Figure 19: Recrutement cellulaire mesuré après 6h de stimulation lors d'une expérience de
la poche d'air en utilisant L. major LV39 ou le LPS comme stimulant ....................... 49
Figure 20: Lors d'une expérience de la poche d'air, la seule injection de Gal-3 est suffisante
pour induire un recrutement significatif après 6h ........................................................ 49
Figure 21: Comparaison des résultats obtenus lors d'une expérience de la poche d'air
obtenus suite à l'injection de L. major LV39 et L. major Friedlin ............................... 50
viii
Figure 22: Mesure, par Western blot, de la libération de Gal-3 de taille complète (anticorps
Mac-2) par les macrophages (A) et les fibroblastes (B) suite à une stimulation in vitro
de 3h par le parasite Leishmania.................................................................................. 51
Figure 23: Mesure, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L.
major LV39 dans des conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection de la
forme non clivée de la Gal-3 avec l’anticorps Mac-2) ................................................ 51
Figure 24: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L.
major LV39 dans des conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection du CRD
de la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD) ........................................................................ 52
Figure 25: Contrôles utilisés pour les expériences de clivage de la Gal-3. ......................... 52
Figure 26: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un
milieu d'incubation constitué de lavages de poches d’air murines (détection de la
forme entière de la Gal-3 avec l'anticorps Mac-2) ....................................................... 54
Figure 27: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un
milieu d'incubation constitué de lavage de poches d’air murines (détection du CRD de
la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD) ............................................................................. 55
Figure 28: Comptes à l'hémacimètre des leucocytes ayant migré dans la poche d'air suite à
une stimulation de 6h ................................................................................................... 56
Figure 29: Implication de la Gal-7 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air
après une stimulation de 6h ......................................................................................... 57
Figure 30: Implication de la Gal-9 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air
après une stimulation de 6h ......................................................................................... 58
Figure 31: Implication de la Gal-7 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des
souris infectées dans le coussinet plantaire avec L. major Friedlin ou L. major LV39
(suivi hebdomadaire de la différence de volume entre la patte infectée et la patte noninfectée) ....................................................................................................................... 59
Figure 32: Implication de la Gal-9 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des
souris infectées dans le coussinet plantaire avec L. major Friedlin et L. major LV39
(suivi hebdomadaire de la différence de volume entre la patte infectée et la patte noninfectée) ....................................................................................................................... 60
Figure 33: Illustration du pourcentage de LPG comportant le nombre de répétitions de
Galβ1-3 spécifié sus ses chaines latérales.................................................................... 62
Figure 34: Schématisation du lien de la Gal-3 au LPG de L. major, puis de son clivage par
la GP63 du parasite ...................................................................................................... 66
Figure 35: Schématisation du clivage de la Gal-3 par L. major puis de la taille des bandes
détectées par Western blot en employant l'anticorps anti-CRD.................................... ......67
ix
Liste des abréviations
ATP : Adénosine-5'-triphosphate
CD : Clusters de différenciation
CLA : Cutaneous lymphocyte antigen
CMH : Complexe majeur d'histocompatibilité
CRD : Domaine de reconnaissance des sucres
DAMPs : « Damage associated molecular pattern » Patrons moléculaires associés au
danger
Gal : Galectine
GP63 : Leishmaniolysine
GPI : Glycosylphosphatidylinositol
HMGB1 : High-mobility group protein B1
SHP : Heat Shock Protein, protéine de shock thermique
KO : « Knock-out »; se dit d’un gène inactivé par génie génétique
LPG : Lypophosphoglycan
LPS : Lipopolysaccharide
MAC : Complexe d’attaque membranaire du complément
Mac-2 : Désigne un Anticorps monoclonal reconnaissant la partie N-terminale de la
galectine-3 humaine
NK : Natural Killer (se dit d’un type de lymphocyte)
PAMPs : « Pathogen-associated molecular patterns » Patron moléculaire associé aux
pathogènes
PPG : Protéophosphoglycan
PRR : Pattern recognition receptors, récepteur des PAMPs
TCR : Récepteur des cellules T
Th : Lymphocyte T helper (lymphocyte T auxiliaire)
TLR : Toll like receptor
WT : Wild type, de type sauvage
1
Introduction
Généralités sur le parasite Leishmania
Leishmania, le parasite
Leishmania est un genre de la famille des Trypanosomatidae. Ce parasite eucaryote est
l’agent causal de la leishmaniose et est transmis grâce à un insecte : la mouche des sables.
Deux morphologies distinctes caractérisent ce parasite : la forme extracellulaire du parasite,
nommée promastigote, est mobile et reconnaissable par un parasite de forme allongée
possédant un long flagelle et est retrouvée dans l'intestin de l'insecte tandis que la forme
intracellulaire du parasite, nommée amastigote est non mobile et est quant à elle
reconnaissable par sa plus petite dimension et par sa forme arrondie et elle est retrouvée à
l'intérieur des macrophages de l’hôte infecté (Peters & Killick-Kendrick 1987) (Schneider
et al. 1992) (Figure 1).
Figure 1 : Évolution morphologique du parasite Leishmania major en culture. La transformation de l'amastigote
vers le promastigote se fait en environ 24h.
Différentes espèces du parasite vont causer différentes manifestations de la maladie. Trois
types de leishmanioses sont connus; soit la forme viscérale, cutanée et mucocutanée. La
classification taxonomique du parasite à été possible par l’emploi de différentes méthodes
telles l’électrophorèse d’isoenzymes (Gardener et al. 1974), l’étude des caractéristiques de
2
croissance (Laison & Shaw 1972), la microscopie électronique (Gardener et al. 1977) ainsi
que par l’utilisation d’anticorps monoclonaux (Pratt & J. R. David 1981). Une nouvelle
classification basée sur la séquence du gène de la heat shock protein 70 a cependant été
proposée récemment (Tableau 1) (Antinori et al. 2011). En tenant compte de ces résultats,
les espèces L. tropica, L. major, L. mexicana, L. guyanensis, et L. naiffi causent la forme
cutanée de la maladie, les espèces L. infantum et L. donovani causent la forme viscérale,
tandis que L. brazillensis cause la leishmaniose mucocutanée.
Tableau 1: Classification des différentes espèces de Leishmania en fonction du séquençage du gène HSP70
Leishmania, la maladie
La forme cutanée de la maladie est la plus répandue avec environ 1.5 million de nouveaux
cas
répertoriés annuellement comparé à environ 500 000 cas pour la leishmaniose
viscérale (Tiuman et al. 2011). Au total, environ 350 millions de personnes sont à risque de
contracter la leishmaniose au cours de leur vie. Comme bien des maladies parasitaires, la
leishmaniose est transmise par un insecte vecteur : la mouche des sables.
3
Leishmaniose cutanée
La distribution géographique de la leishmaniose cutanée est concentrée principalement
dans les pays d’Amérique du Sud, d’Afrique du Nord et au Moyen Orient. La majorité des
infections sont cependant rencontrées dans les pays suivants: Brésil, Pérou, Algérie, Syrie,
Arabie Saoudite, Afghanistan et Pakistan,(Reithinger et al. 2007). La plupart des infections
cutanées restent probablement asymptomatiques (Murray et al. 2005). Dans le cas où des
symptômes apparaissent, le premier signe clinique est l’apparition d’un érythème à
l’endroit où l’hôte a été piqué par la mouche des sables. La maladie se développera ensuite
sur une période allant de deux semaines à six mois. Les rougeurs évolueront vers
l’apparition d’une papule, puis d’un ulcère. L’infection va se résorber sans besoins
d’interventions externes (sans traitement). La disparition des symptômes va se faire en un
temps variable selon l’espèce de Leishmania dont il est question. Dans le cas de L. major,
cela va se faire une période variable allant de quelques mois à quelques années (Alrajhi et
al. 2002). Le fait de guérir de la maladie va procurer à l’individu une protection contre les
prochaines infections. Dépendamment des cas, cette protection peut ou pas être spécifique
à l’espèce de Leishmania qui est responsable de la primo-infection (passé en revue dans
(Review & Reithinger 2008)).
Leishmaniose viscérale
La grande majorité des cas rapportés de leishmaniose viscérale proviennent des pays
suivants : Bangladesh, Brésil, Éthiopie, Inde, Népal, Soudan (Reithinger 2008).
Contrairement à la leishmaniose cutanée, la leishmaniose viscérale peut être fatale si non
traitée.
Les
symptômes
la
caractérisant
sont
principalement
la
fièvre,
l’hépatosplénomégalie (augmentation du volume du foie et de la rate), la lymphadénopathie
(augmentation de volume des ganglions lymphatiques), la pancytopénie (réduction
importante du nombre de globules blancs, de globules rouges et de plaquettes dans le sang),
la perte de poids, une faiblesse généralisée et éventuellement, la mort (Reithinger, 2008).
4
Leishmania, le cycle parasitaire
Deux stades principaux caractérisent le cycle parasitaire du parasite Leishmania (Figure 2).
Une première partie de ce cycle se déroule chez le vecteur, la mouche des sables. Cet
insecte appartient à la famille des Psychodidae. Deux principaux genres sont connus pour
participer à la transmission du parasite soit le genre Phlebotomus rencontré dans les zones
arides de l’Eurasie tandis que le genre Lutzomyia est surtout rencontré en Amérique du Sud
(Killick-Kendrick 1990). Lorsque l’insecte pique un hôte infecté, il ingère des cellules
infectées par des amastigotes.
Figure 2: Cycle parasitaire de Leishmania.
Ceux-ci vont par la suite se transformer en promastigotes et vont coloniser l’appareil
digestif de l’insecte. Cette transformation est principalement induite par des changements
environnementaux. Les parasites passent d’un environnement d’une température de 37°C
qui pauvre en nutriment (le phagolysosome) vers un environnement d’une température de
26°C très riche en nutriments (le tube digestif de l’insecte) (Hart et al. 1981). Par la suite,
ces promastigotes évoluent de la forme procyclique vers la forme métacyclique; cette
dernière morphologie étant reconnue comme étant la forme infectieuse du parasite, dû à sa
résistance au complément (Puentes & R. Da Silva 1990), qui est transmise à un hôte
mammifère lors du prochain repas sanguin. Il est aussi possible de reproduire le
phénomène de métacyclogénèse in vitro. Le fait de laisser les parasites de 6 à 10 jours leur
5
permet d’atteindre une phase de croissance stationnaire, obtenant alors un pourcentage
significatif de parasites sous la forme métacyclique (Sacks, 1989). Finalement, à l’entrée
du parasite dans les macrophages de l’hôte mammifère, la transformation des
promastigotes en amastigotes est principalement médiée par une augmentation de
température ainsi qu’une baisse de pH (Bates, 1993; Zilberstein and Shapira, 1994).
Leishmania, les molécules de surface
Les promastigotes du parasite Leishmania sont recouverts d’un glycocalix assez dense. La
plupart des molécules le composant sont ancrées à la membrane cellulaire du parasite par le
glycosylphosphatidylinositol (GPI). Des molécules de GPI sont aussi retrouvées seules;
sans être reliées à une protéine (Figure 3) (McConville and Ferguson, 1993) (Ilgoutz and
McConville, 2001).
Figure 3: Molécules de surface du promastigote Leishmania
Le lipophosphoglycan (LPG) est une molécule de surface majeure du parasite Leishmania.
Cette molécule structurelle est entre autres importante dans la survie du parasite face aux
différents stress qu’il rencontre au cours de son existence (A. Descoteaux & Salvatore J
Turco 2002) (Puentes & R. Da Silva 1990). La structure du LPG peut être divisée en quatre
sections principales : i) l’ancrage à la membrane se faisant par le phosphatidylinositol (PI),
ii) un cœur de polysaccharides, iii) des répétitions de polysaccharides et iv) une coiffe.
6
La partie qui nous intéresse le plus pour cette étude est la section composée de
phosphosaccharides. La partie centrale de cette section est conservée à travers les
différentes espèces de Leishmania. Les chaines latérales (R) sont cependant variables selon
l’espèce rencontrée. En effet, lorsque l’on fait la comparaison des chaines latérales de L.
major et de L. donovani, on constate que celles de L. donovani sont uniquement composées
d’atomes d’hydrogène tandis que celles de L. major peuvent être composées de différents
saccharides dont des répétitions de galactose reliées par des liaisons β1-3. C’est par cette
différence structurelle qu’il est possible d’expliquer le fait que la Gal-3 lie L. major, mais
pas L. donovani (la Gal-3 ayant une affinité pour les polymères de galactose liés entre eux
par des liens β1-3; plus de détails à ce sujet dans la section glycobiologie). Il est possible
d’en faire la preuve par l’usage d’une souche modifiée génétiquement de L. major Friedlin,
nommée « Spock ». Cette souche n’est pas en mesure de lier la Gal-3 car, tout comme L.
donovani, elle est déficiente en β-galactosyltransférase, rendant ses les chaines latérales
identiques à celles de L. donovani (Figure 4) (Pelletier & S. Sato 2002).
Figure 4 : Structure du LPG de Leishmania.
Un détail important à propos des espèces de Leishmania utilisées dans le cadre de cette
étude est ici à souligner. Deux souches de L. major ont été utilisées : L. major LV39 et L.
major Friedlin. Ces deux souches causent la forme cutanée de la maladie. La
caractéristique principale qui les distingue est le nombre de répétitions de Galactoseβ1-3
composant les chaines latérales de leur LPG (Tableau 2) (Dobson et al. 2010).
7
Tableau 2: Comparaison du nombre de répétitions de Galβ1-3 retrouvées sur les chaines latérales du LPS de
différentes souches et espèces de Leishmania.
Souche de
Leishmania
L. major Friedlin
L. major LV39
L. donovani
% du LPG contenant le nombre de répétitions du nombre d’unités de
(Galβ1-3) mentionné
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
21
59
11
1
0
0
0
0
0
0
7
16
22
16
17
11
7
3
2
0
100 0
0
0
0
0
0
0
0
0
Moyenne du
nombre de
répétitions
1.2
3.3
0
Une des protéines les plus abondantes retrouvées à la surface du parasite est la
leishmaniolysine, aussi appelée GP63. Cette protéine est une zinc protéase (Novozhilova &
N. V. Bovin 2010). Elle est exprimée chez les promastigotes ainsi que chez les amastigotes,
mais en plus faible quantité chez ces derniers (Medina-Acosta et al. 1989). Cette protéase
est connue pour hydrolyser des protéines de la matrice extracellulaire (P. B. Joshi et al.
2002) ainsi que certaines protéines du système immunitaire, dont des composants du
système du complément (Brittingham et al. 1999). Des résultats obtenus précédemment
dans notre laboratoire tendent à démontrer que la GP63 pourrait être à l’origine du clivage
de la Gal-3 par les parasites Leishmania (Figure 5) (Pelletier et al. 2003).
Figure 5: Clivage de la Gal-3
Visualisation sur gel d’acrylamide coloré au Bleu de Coomassie d’une expérience de clivage de la Gal-3.
Il est cependant à noter que la Gal-3 doit premièrement lier le parasite via son LPG pour
ensuite être clivée par la GP63. C’est pourquoi L. donovani, bien qu’il possède une GP63
fonctionnelle, ne clive pas la Gal-3.
Le protéophosphoglycan (PPG) est aussi présent à la surface des parasites et est impliqué
dans la protection contre les enzymes protéolytiques (Secundino & Kimblin 2010). Le
protéophosphoglycan est en fait un terme regroupant les protéines contenant une partie
8
phosphoglycan liée de manière covalente via les résidus sérines de la partie protéique. Le
phosphoglycan du protéophosphoglycan de L. major, comporte, tout comme celui du LPG,
les répétitions de polysaccharides Gal-Man-PO(4), une coiffe ainsi qu’un nombre
important de répétitions de Galactoseβ1-3. C’est aussi grâce à ces dernières que le PPG
est aussi être un ligand potentiel pour la Gal-3.
Réponse immunitaire
Le système immunitaire humain est composé de deux axes principaux : l’immunité innée et
l’immunité adaptative. L’immunité innée va réagir aux infections en peu de temps et de
manière non spécifique tandis que l’immunité acquise prend plus de temps à réagir, mais
est plus spécifique et possède une capacité mémoire de manière à contrer plus efficacement
une infection subséquente impliquant un pathogène ayant des caractéristiques
immunologiques similaires. Deux modèles de pensée sont proposés afin d’expliquer le
fonctionnement général du système immunitaire. Le modèle classique du soi et du non-soi
proposé par Charles A Janeway expliquait initialement que le système immunitaire
reconnait comme immunogène ce qui ne provient pas du soi (Medzhitov & Janeway 2002).
Ce modèle s’est cependant adapté au fil du temps en ajoutant des éléments supplémentaires
à ce principe de base (discutés plus loin). La théorie proposée par Polly Matzinger est quant
à elle basée sur la dangerosité d’un évènement. Un évènement dangereux pour l’organisme
est détecté par le fait qu’il entraine le bris de tissus ou de cellules. Ce bris occasionne la
libération de molécules intracellulaires (comme HMGB1 ou l’ATP). Ces composés sont
aussi appelés alarmines du fait qu’elles sont les responsables de l’activation de la réaction
immunitaire (Matzinger 2002). La glycosylation fait aussi partie intégrale de différents
mécanismes associés au système immunitaire. En effet, chez les vertébrés, les séquences de
sucres ajoutés aux protéines se terminent souvent par un acide sialique. Cette glycosylation
est essentielle pour différents processus de communication intercellulaire (Axford 2001).
Des patrons de glycosylation spécifiques peuvent aussi être retrouvés chez certains
pathogènes. Les lectines de type C, les galectines ainsi que les siglecs ont été décrits dans
la littérature comme étant des PRRs (Dam & Brewer 2010). Les lectines de type C peuvent
avoir différentes spécificités; par exemple, DC-SIGN reconnaît les glycans se terminant par
9
des résidus mannose et/ou fucose tandis que la « Macrophage galactose lectin » reconnaît
les glycans se terminant par un résidu galactose ou N-acétylgalactosamine. Les siglecs sont
quant à eux impliqués à la fois dans la reconnaissance des PAMPs présents sur certains
virus, bactéries ou parasites, mais aussi de certaines molécules de l’hôte; facilitant ainsi a
communication intercellulaire (Crocker et al. 2007). Finalement, certaines galectines ont
démontré une capacité à lier des pathogènes; qu’ils soient d’origine bactérienne (Mey et al.
1996), virale (Lee 2007, St-Pierre et al. 2011, Ouellet et al. 2005) ou eucaryote (Pelletier, et
al. 2003; Pelletier & S. Sato 2002). Ce lien à un pathogène peut cependant bénéficier
davantage au pathogène en question qu’à son hôte (Mercier et al. 2008).
Réponse immunitaire : La théorie du soi, non-soi
Selon la dernière version de cette théorie, le système immunitaire est en mesure de réagir à
3 types d’évènements (Figure 6) (Medzhitov & Janeway 2002). La présence d’un « non-soi
microbien » basée sur la reconnaissance de patrons moléculaires uniques aux
microorganismes (ex. reconnaissance du LPS par le TLR-4). Ces molécules uniques sont
appelées PAMPs pour Pathogen Associated Molecular Patterns. Ces patrons moléculaires
sont donc reconnus par le système immunitaire via les PRRs pour Pattern recognition
Receptors. Parce que les PAMPs sont retrouvés à la fois sur les microorganismes
pathogènes et sur ceux qui ne le sont pas, ce système de reconnaissance ne peut cependant
pas être la seule explication du fonctionnement de notre système immunitaire. En effet, le
fait que notre corps soit en mesure de tolérer des microorganismes à certains endroits
particuliers (système digestif, muqueuses) invalide le fait que les PAMPs soient la seule
explication au fonctionnement de notre système immunitaire. Pour complémenter le
système des PAMPS, le système immunitaire mise aussi sur la reconnaissance d’un « soi
manquant » détecté par l’absence de marqueurs du soi normal (ex. l’activation des cellules
NK par l’absence de CMH-1 à la surface d’une cellule). Finalement, la présence d’un « soi
anormal » détectable par la présence de marqueurs induits lors d’une situation particulière
(ex. l’exposition de molécules de phosphatidyl sérine par une cellule infectée par un virus
va mener à l’élimination de cette cellule par phagocytose) est le troisième mécanisme
d’activation de la réponse immunitaire (Medzhitov & Janeway 2002).
10
Figure 6 : Représentation schématisée de la réponse immunitaire selon la théorie du soi, non-soi.
Réponse immunitaire : La théorie du danger
Bien que le modèle du soi, non-soi était présent dans le monde de la science depuis des
nombreuses années, quelques questions étaient toujours ambigües. Par exemple, comment
le système immunitaire fait pour s’adapter aux changements du soi lors de la puberté ou de
la maternité? Comment les fétus sont tolérés ? Pourquoi il est nécessaire d’ajouter des
adjuvants pour rendre les préparations vaccinales efficaces ? N’étant pas satisfaite des
modèles précédents, c’est vers le milieu des années 90 que Polly Matzinger élabora une
nouvelle théorie expliquant le fonctionnement du système immunitaire, la théorie du
danger (Figure 7). Cette théorie se base sur le principe que le système immunitaire va
réagir non pas aux molécules étrangères, mais plutôt au danger, signalé par des molécules
de l’hôte nommées alarmines. Ces signaux de danger peuvent être d’origines variées, mais
la clef est qu’ils sont produits selon deux possibilités : soit sécrétés par des cellules
immunitaires stimulées ou libérés par la nécrose ou la mort non physiologique d’une
cellule. Des molécules telles, les Heat-Shock proteins (HSP), la protéine HMGB1
(impliquée dans l’organisation de l’ADN) (Klune et al. 2008), les protéines S100 liant le
calcium et retrouvées chez les cellules d’origine myéloïde (Foell et al. 2007) ainsi que
l’ATP qui est une molécule intracellulaire connue comme coenzyme de bien des réactions
11
métaboliques (Kouzaki et al. 2011) sont des exemples d’alarmines souvent cités. Ces
molécules vont, lorsqu’elles se retrouvent dans le milieu extracellulaire, activer les cellules
présentatrices d’antigènes se trouvant à proximité. Pour être qualifiées d’alarmines, les
molécules candidates doivent répondre a certains critères (Bianchi 2007). Elles doivent être
(i) libérées dans l’environnement suite à la mort cellulaire non programmée de la cellule.
(ii) Les cellules du système immunitaire peuvent être en mesure de sécréter ces molécules
sans avoir à mourir. (iii) Ces molécules doivent être en mesure de recruter et d’activer les
cellules immunitaires exprimant le récepteur correspondant afin de déclencher la réponse
immunitaire. (iv) Les alarmines doivent finalement être en mesure de restaurer un état
d’homéostasie en favorisant la reconstruction des tissus pouvant avoir été endommagés
directement ou indirectement par la réponse immunitaire.
Figure 7 : Schématisation simplifiée de la réponse immunitaire selon la théorie du danger.
Toujours selon ce modèle, les cellules présentatrices d’antigène sont à la fois en mesure de
reconnaitre les signaux endogènes et exogènes. Sont cités en exemple la reconnaissance de
HSP70 et du LPS par le TRL-4 (Fang et al. 2011) ainsi que le lien du HSP60 et de
différentes lipoprotéines microbiennes par le TLR-2 (Zanin-Zhorov & Cahalon 2006).
Le neutrophile
Chez l’homme, les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants du sang. Ce sont
aussi un des premiers types cellulaires à être recrutés au site d’infection. En plus de leurs
12
nombreuses granules intracellulaires, les neutrophiles ont la capacité de phagocyter les
pathogènes. Il est de plus en plus documenté que les neutrophiles jouent un rôle important
dans l’activation et dans la régulation de la réponse immunitaire innée et adaptative
(Mantovani et al. 2011). Les neutrophiles possèdent un arsenal de défense assez
impressionnant. La plupart des molécules constituant cet arsenal se trouvent dans des
granules retrouvées à l’intérieur du neutrophile. La dégranulation des neutrophiles se fait
en plusieurs étapes ; ce ne sont pas tous les types de granules qui sont libérées en même
temps. La cinétique de dégranulation est la suivante : (1) vésicules sécrétoires, (2) granules
gélatinases, (3) granules spécifiques et (4) granules azurophiles (Sengelov 1993) (Sengelov
et al. 1995)
13
Neutrophiles et immunité : les granules du neutrophile
Tableau 3: Les granules et vésicules sécrétoires du neutrophile
(Faurschou & Borregaard 2003)
14
Vésicules sécrétoires
Ces vésicules sont les premiers à être libérés. Une stimulation avec le fMLP ou avec
l’ionomycine déclenche rapidement la libération d’albumine, un marqueur utilisé pour les
vésicules sécrétoires. Aussi, contrairement à la libération des autres types de granules, la
libération des vésicules sécrétoire est très peu affectée par la chélation du calcium
extracellulaire. (Sengelov 1993b). La libération de ces vésicules provoque la libération de
différentes molécules qui seront ensuite incorporées dans la membrane cellulaire. Parmi ces
molécules, on retrouve la β2-integrin CD11b/CD18 (Mac-1) (Sengeløv et al. 1993) le
récepteur 1 du complément (CR1) (Sengelov & Lars Kjeldsen 1994) ainsi que le récepteur
du fMLP (Sengelov & Lars Kjeldsen 1994). À cela s’accompagne aussi l’exposition des
molécules de L-sélectines, molécules impliquées dans le processus de migration des
neutophiles (Bainton et al. 1994).
Granules gélatinases
Le contenu des granules gélatinases ne possède pas d’activité peroxydase. Leur contenu est
plutôt composé d’enzymes capables de dégrader la matrice extracellulaire telles la
gélatinase et l’héparinase (Mollinedo et al. 1997). Ces enzymes ont un rôle important à
jouer dans la migration et l’extravasion des neutrophiles. Elles peuvent cependant aussi
avoir des effets néfastes sur la santé lorsque leur niveau est mal contrôlé ; des maladies
telles l’asthme et la fibrose kystique peuvent en résulter (Cederqvist et al. 2001). Les
granules gélatinases diffèrent des granules spécifiques par le fait qu’elles ne contiennent
pas de lactoferrine. En effet, les granules spécifiques (qui contiennent de la lactoferrine)
contiennent aussi de la gélatinase (Segal 2005).
15
Granules spécifiques
Comme mentionné précédemment, les granules spécifiques contiennent de la lactoferrine ;
un agent antimicrobien qui va lier et séquestrer le fer ; exerçant ainsi des propriétés
antimicrobiennes pouvant agir sur un large spectre de bactéries à Gram-négatif ou positif
(Oram & Reiter 1968). Ces granules contiennent aussi la majorité du lysozyme, une
enzyme ayant une activité antibactérienne par sa capacité à hydrolyser le peptidoglycan
(Baggiolini et al. 1969).
Granules azurophiles
Les granules azurophiles sont les dernières à êtres libérées dans le processus de
dégranulation du neutrophile. Elles se distinguent des autres granules par leur activité
peroxydase provenant de la myélopéroxidase une enzyme catalysant la production d’acide
hypochloreux à partir de peroxyde d’hydrogène et de chlore. Cet acide hypochloreux ainsi
que différents autres sous-produits de la réaction chimique vont attaquer les membranes des
microorganismes par des réactions d’oxydoréduction (Klebanoff 2005). Il est aussi
retrouvé dans ces granules l’enzyme élastase, qui, en plus pouvoir dégrader l’élastine (une
composante de la matrice extracellulaire) (Sinha et al. 1987), possède la capacité de cliver
la partie N-terminale de la Gal-3 (Nieminen et al. 2005). Finalement, les granules
azurophiles contiennent aussi une variété de peptides antimicrobiens, dont les cathepsines
et les défensines (Ganz 2003).
Neutrophiles et immunité : recrutement cellulaire
Lors d’une réaction inflammatoire, une série de mécanismes impliquant entre autres de
nombreuses lectines, amènent les neutrophiles au site inflammatoire (Parham 2003). Cela
commence par l’activation de l’endothélium vasculaire situé à proximité du site d’intérêt.
Des médiateurs inflammatoires tels le leucotriène LTB4, le fragment C5a du complément
ou l’histamine contribuent à l’exposition rapide de la P-sélectine, qui était préalablement
16
conservée dans les corpuscules de Weibel-Palade, à la surface des cellules endothéliales
activées. Des molécules pro-inflammatoires telles le LPS et le TNF-α peuvent, quant à
elles, provoquer l’expression de la E-sélectine à la surface des cellules endothéliales. Alors
que l’expression de la P-sélectine peut se faire en quelques minutes, celle de la E-sélectine
demande plutôt quelques heures. Ces sélectines vont lier des glycoprotéines contenant des
structures osidiques de type sialyl-Lewis situées sur les neutrophiles et vont permettre une
adhérence réversible des neutrophiles aux parois de l’endothélium. Cela permet donc aux
neutrophiles de rouler sur la surface de l’endothélium vasculaire
La seconde étape de la migration des neutrophiles vers le site d’inflammation est
l’adhésion ferme. Cela se fait par l’interaction entre les intégrines LFA-1 et Mac-1 du
neutrophile avec les molécules d’adhérence cellulaire de l’endothélium tel ICAM-1. Lors
du processus de roulement, les médiateurs inflammatoires tel l’IL-8 présents permettent de
modifier la conformation des molécules LFA-1 et Mac-1 du neutrophile, augmentant ainsi
la force de l’adhérence des neutrophiles aux parois endothéliales ; le roulement est ainsi
stoppé pour laisser place à l’adhésion ferme.
S’en suit ainsi l’étape de migration du neutrophile à travers la paroi du vaisseau sanguin.
En plus des molécules LFA-1 et Mac-1, la protéine CD31, une immunoglobuline exprimée
sur les leucocytes ainsi que sur la paroi de l’endothélium vasculaire joue un rôle important
dans ce processus. Le processus par lequel le neutrophile passe entre deux cellules
endothéliales se nomme diapédèse. Le neutrophile peut alors atteindre la matrice
extracellulaire, puis, grâce à un gradient de molécules chimiotactiques comme l’IL-8, le
neutrophile se rend jusqu’au foyer du site inflammatoire.
Parce qu’elle a la capacité de lier les neutrophiles ainsi que les cellules endothéliales, il
possible de croire que la Gal-3 ait un rôle à jouer dans ce processus de migration cellulaire
(Nieminen et al. 2008).
Les chimiokines sont des cytokines ayant des propriétés chimioattractantes. Elles jouent un
rôle primordial dans le processus de migration directionnelle des neutrophiles
précédemment expliqué. Elles sont sécrétées par différents types cellulaires suite à une
lésion cellulaire ou suite à la reconnaissance d’un pathogène. Il existe deux familles
17
principales de chimiokines qui sont classées selon la position de certains résidus cystéine
(C) au sein de leur séquence d’acides aminés. Les chimiokines ayant deux cystéines
consécutives (CC) sont connues pour attirer les monocytes ainsi que les lymphocytes T
effecteurs et mémoire. Les chimiokines possédant deux cystéines intercalées par un acide
aminé différent (CXC) sont quant à elles connues pour attirer les neutrophiles et les
lymphocytes T naïfs.
Le macrophage
Selon la différenciation cellulaire qu’ils ont subit et selon leur localisation, les
macrophages sont des cellules assez diversifiées. Les macrophages peuvent être des
cellules résidentes des tissus (ex. dans la peau) ou bien être issus de la différenciation de
monocytes ayant migré vers un site inflammatoire (Taylor et al. 2005). Leurs rôles au sein
du système immunitaire peuvent aussi être assez diversifiés; ils sont entre autres connus
pour leurs capacités phagocytaires, pour leur capacité à agir comme cellule présentatrice
d’antigène ainsi que pour leurs rôles dans la modulation de la réponse immunitaire (Pozzi
et al. 2005). Les antigènes rencontrés par les macrophages ainsi que les lymphocytes T se
trouvant dans leur environnement vont influencer l’hétérogénéité ainsi que la maturation
des macrophages (Van Ginderachter et al. 2006). Les macrophages qui répondent aux
stimuli immunitaires par la sécrétion de molécules pro-inflammatoires et/ou microbicides
sont considérés comme étant activés selon la voie classique (M1). Ces macrophages
proviennent d’un environnement riche en cytokines provenant de cellules Th1 telles l’INFγ et/ou contenant des PAMPs et/ou des DAMPs. Ce type de macrophage peut être reconnu
par sa production élevée d’IL-12 (Verreck et al. 2004), par sa capacité proliférative et
cytotoxique accrue ainsi que par sa production de cytokines pro-inflammatoires telles le
TNF-α, l’IL-6 et l’IL-1 (Bonnotte et al. 2001). Le second type d’activation des
macrophages est appelé activation alternative (M2). Ces macrophages ont plutôt des
propriétés anti-inflammatoires qu’ils ont acquises suite à leur exposition à des cytokines
Th2 telles l’IL4 et l’IL-13 ainsi qu’à d’autres molécules anti-inflammatoires telles l’IL-10,
le TGF-β ainsi que les glucocorticoïdes (Goerdt & Orfanos 1999) (Verreck et al. 2004).
18
La phagocytose
Les neutrophiles ainsi que les macrophages sont considérés comme des phagocytes
professionnels. Ils peuvent phagocyter tant les cellules mortes, les débris cellulaires que les
pathogènes. La phagocytose est le processus par lequel l’élément à phagocyter pénètre à
l’intérieur de la cellule par une vacuole provenant de l’invagination de la membrane
cellulaire. Ce processus est possible grâce à la présence de différents récepteurs qui
peuvent être séparés en deux classes : les récepteurs de type Fc tels FcγRIIA (CD32) et Fc
γRIIIB (CD16) ainsi que les récepteurs du complément tels CR1 (CD35) et CR3 (les
intégrines CD11b/CD18) (Witko-Sarsat & Rieu 2000). Suite à la reconnaissance d’une
molécule à phagocyter, la cellule va réorganiser son cytosquelette afin de former des
pseudopodes et une vacuole nommée phagosome. À ce moment, le phagosome ne contient
aucune molécule microbicide, mais sa maturation va lui permettre de les acquérir. Le
processus de maturation du phagosome commence par sa fusion avec les endosomes de tri
(pH≈6.0). Cela permet l’acquisition de molécules essentielles au guidage du phagosome
précoce ainsi formé à travers le cytoplasme. Par un processus encore mal caractérisé, le
vésicule va fusionner avec les endosomes tardifs (pH≈5.5) afin de former le phagosome
tardif. Ce phagosome tardif va finalement fusionner avec le lysosome (pH<5.5) qui contient
des enzymes hydrolytiques comme la cathepsin D (O. V Vieira et al. 2002), formant ainsi
le phagolysosome. Un second modèle fonctionnel nommé « Kiss and run » a aussi été
proposé (Desjardins 1995). Bien que ce modèle suive les mêmes étapes que le modèle
précédent, la différence principale se situe au niveau du processus de fusion entre le
phagosome qui mature et les endosomes. Au lieu de proposer une fusion complète des deux
vésicules, le modèle « Kiss and run » propose une fusion partielle et transitoire des
membranes des deux vésicules qui serait suffisante pour leur permettre d’échanger leur
contenu intravésiculaire.
Peau et immunité
En plus de former une barrière physique et chimique contre le milieu extérieur, la peau
possède aussi des défenses immunitaires biologiques très élaborées. Sont présentes dans les
19
différentes couches de la peau un nombre important de cellules dont certaines sont des
cellules immunitaires spécialisées comme les lymphocytes T, les cellules dendritiques ainsi
que les macrophages alors que d’autres comme les fibroblastes et les kératinocytes ont des
rôles structuraux et immunologiques (Figure 8). Est aussi présent dans la peau un réseau
lymphatique permettant aux cellules de migrer vers les organes lymphoïdes secondaires
drainant cette région (Nestle et al. 2009).
Figure 8: Les différentes cellules immunitaires de l'épiderme et du derme humain.
20
Peau et immunité : Les kératinocytes
Les kératinocytes sont présents dans l’épiderme et sont une des premières cellules
immunitaires à rencontrer les pathogènes. Ils sont en mesure de reconnaître les agents
microbiens grâce aux nombreux TLRs qu’ils possèdent. Sont présents à leur surface les
TLR1 (lipoprotéines bactériennes), TLR2 (lipoprotéines bactériennes), TLR4 (LPS), TLR5
(flagelline) et TLR6 (lipoprotéines bactériennes). Les TRL3 (ARN viral double brin) et
TLR9 (ARN viral simple brin) sont aussi présents dans leurs endosomes (Lebre et al.
2007). Les kératinocytes sont reconnus pour diriger la réponse immunitaire vers une
réponse de type Th1 (Miller & Modlin 2007). Cette généralité à été confirmée comme
pouvant s’appliquer à la leishmaniose où des cytokines telles l’IL-12 étaient exprimées par
les kératinocyes suite à une infection avec L. major (Ehrchen et al. 2010). Suite à
l’activation de ces récepteurs, les kératinocytes peuvent réagir en sécrétant des molécules
antimicrobiennes comme les β-défensines, la calprotectine ainsi que le lysozyme (Bando et
al. 2007) (N. Hayashi et al. 2007). Les kératinocytes activés sont aussi connus pour
produire des cytokines telles CXCL1 ainsi que CXCL8 (Albanesi et al. 2005). Il a
finalement été publié que les kératinocytes peuvent agir comme cellules présentatrices
d’antigènes grâce au fait qu’ils possèdent des CMH à leur surface.
Peau et immunité : Les cellules dendritiques
Les cellules de Langerhans sont localisées dans l’épiderme et sont les premières cellules
dendritiques qui vont rencontrer les molécules antigéniques provenant du milieu extérieur.
Étant une cellule présentatrice d’antigène professionnelle, son rôle principal est de capturer
et de présenter les antigènes aux cellules T (Romani et al. 2006). Elles semblent aussi
induire la différenciation des lymphocytes T vers le type Th2 (Klechevsky et al. 2008). Des
cellules dendritiques sont aussi présentes au niveau du derme et ce sont ces cellules qui
vont migrer vers les organes lymphoïdes secondaires adjacents à leur localisation. Une
étude pouvant remettre en doute le rôle des cellules de Langerhans a démontré que seules
les cellules dendritiques (pas les cellules de Langerhans) peuvent activer la prolifération
des lymphocytes T auxquels elles présentent des antigènes. Cette étude a cependant été
21
faite dans le cadre de recherches sur les réactions d’hypersensibilité utilisant le Plateletactivating factor (PAF) comme stimulant (Fukunaga 2008). Il n’est pas impossible que
l’emploi d’un stimulant différent ait donné des résultats différents. Des monocytes sont
aussi présents au niveau du derme et ils peuvent maturer en cellules dendritiques ou en
cellules de Langerhans (López-Bravo & Ardavín 2008). Il est finalement connu que les
cellules dendritiques de la peau peuvent participer plus directement à la réponse
immunitaire par la production de cytokines (Guttman-Yassky et al. 2007).
Peau et immunité : Les macrophages
Les macrophages présents dans la peau sont surtout retrouvés dans le derme, mais ils sont
aussi connus pour leur capacité à migrer vers les nœuds lymphatiques drainant leur
emplacement d’origine (Furth & Nibbering 1985).
Peau et immunité : Les lymphocytes T
Un nombre impressionnant de lymphocytes T se retrouve dans la peau. Environ 1E6
lymphocytes T par cm2 est présent dans une peau normale ; pour un grand total d’environ
2E10 lymphocytes T, ce qui est environ deux fois supérieur à ce qui est retrouvé dans la
circulation sanguine (Schaerli et al. 2006). Les lymphocytes T peuvent être retrouvés à la
fois dans l’épiderme (souvent près des cellules de Langerhans) (Foster & Yokozeki 1990)
ainsi que dans le derme (Bos & Kapsenberg 1993). Des lymphocytes T CD4+ et CD8+ sont
retrouvés en proportions équivalentes et la majorité d’entre eux sont des cellules mémoire.
Elles ont aussi la particularité d’exprimer un antigène spécifique aux lymphocytes T de la
peau : le « cutaneous lymphocyte-associated antigen » (CLA) (Nestle et al. 2009). Des
cellules moins communes telles les lymphocytes T γδ (Shiohara & Moriya 1990) et Natural
Killer (NKT) sont aussi retrouvées dans la peau.
22
Leishmania et immunité
Le parasite Leishmania entre dans la circulation sanguine sous la forme promastigote. Les
promastigotes sont ensuite phagocytés pas les macrophages. Cette phagocytose est souvent
facilitée par l’opsonisation des parasites avec la molécule C3b. La métalloprotéase de
surface du parasite GP63 va ensuite cliver le C3b en C3i afin de favoriser la phagocytose
du parasite au lieu de mener vers la voie lytique du complément (Hermoso et al. 1991). Il a
aussi été démontré que les parasites sous leur forme stationnaire de culture in vitro ; forme
correspondante au type de parasites injectés par la mouche des sables aussi appelée
promastigotes métacycliques, sont plus résistants au système du complément que les
parasites sous leur forme exponentielle de croissance en culture in vitro (Puentes & R. Da
Silva 1990); forme correspondant aux parasites retrouvés dans les premières étapes de
développement chez la mouche des sables et aussi appelée promastigotes procycliques. Ni
les promastigotes, ni les amastigotes ne sont en mesure d’inhiber la fusion du phagosomes
avec les endosomes tardifs ou avec les lysosomes (Courret et al. 2002). Il a cependant été
démontré que le LPG peut inhiber de manière transitoire la maturation du phagosome afin
de permettre aux promastigotes de se transformer en amastigotes qui sont plus résistants
aux hydrolases (Dermine et al. 2000). L’emploi de parasites L. major déficients en LPG a
confirmé ce résultat par l’obtention d’un taux de survie parasitaire inférieur à celui des
parasites de type sauvage (Späth et al. 2000). Cette observation n’est cependant pas valide
pour toutes les espèces de Leishmania. Les parasites de l’espèce L. mexicana déficients en
LPG possèdent le même taux de survie face à la phagocytose par les macrophages lors que
comparé avec les parasites de type sauvage (Ilg et al. 2001). En plus de modifier la
régulation de la compartimentalisation intracellulaire, le parasite Leishmania est aussi en
mesure de modifier certains patrons de signalisation intracellulaire de ça cellule hôte. Le
meilleur exemple de cette modification est l’inhibition spécifique de la production d’IL-12.
Cela se produit par l’inhibition de la signalisation de la voie JAK/STAT menant
habituellement à l’activation du promoteur de l’IL-12p40 (McDowell MA and Sacks
1999). L. donovani, mais pas L. major affecte aussi la production d’IL-12p70 par les
cellules dendritiques (Mcdowell et al. 2002). D’un point de vue symptomatique, cette
découverte semble logique du fait que les cellules dendritiques sont activées dans le cas
23
d’une infection avec L. major ; participant ainsi à restreindre l’infection à une zone locale,
ce qui n’est cependant pas le cas lors d’une infection avec L. donovani.
Neutrophiles et Leishmania
Comme mentionné précédemment, les neutrophiles sont parmi les premières cellules à être
mobilisées au site d’infection suite à l’injection de parasites Leishmania. Ces neutrophiles
seront en mesure de phagocyter et de tuer un fort pourcentage des parasites présents au site
d’infection. Il a cependant aussi été démontré qu’un faible pourcentage des parasites
internalisés à l’intérieur des neutrophiles peut survivre plusieurs heures (Helmut Laufs et
al. 2002). Cela a mené à l’élaboration de l’hypothèse du cheval de Troie (Figure 9). Selon
ce modèle, l’infection et la survie de parasites à l’intérieur des neutrophiles auraient comme
effet d’occasionner un délai dans l’apoptose spontanée de ceux-ci. Ce délai permet aux
monocytes recrutés au site d’infection de se transformer en macrophages qui vont pouvoir
phagocyter les neutrophiles alors devenus apoptotiques. Cela va alors permettre aux
parasites toujours présents à l’intérieur des neutrophiles de pouvoir infecter plus
efficacement le macrophage qui ne s’attend pas a faire face à une cellule pathogène (Tamás
Laskay et al. 2003).
Figure 9: Représentation imagée de la théorie du cheval de Troie impliquant le neutrophile et le macrophage lors
de l'infection avec Leishmania.
24
Cependant, il faudrait mettre un certain bémol sur cette théorie. Les résultats obtenus au
sein de notre laboratoire tendent plutôt à démontrer l’importance des neutrophiles dans la
réponse immunitaire contre le parasite Leishmania. Nous avons en effet observé que les
neutrophiles avaient une excellente capacité à phagocyter et à tuer les parasites. De plus,
l’utilisation, pré-infection, d’anticorps afin d’éradiquer les neutrophiles à eu comme effet
d’aggraver l’infection par l’augmentation de la charge parasitaire mesurée après 24h
(Bhaumik et al. 2012).
Les neutrophiles sont plus que de simples éboueurs entrant en apoptose après avoir fait leur
travail de nettoyage (phagocytose des parasites). Ils participent aussi à l’organisation de la
réponse immunitaire. Il a entre autres été démonté que les neutrophiles sécrètent de l’IL-8
suite à leur exposition à des parasites in vitro (G Van Zandbergen et al. 2002). Ils sont donc
susceptibles de participer à une cascade d’amplification de leur propre recrutement au site
d’infection. Des cytokines comme l’IL-17 (Lopez Kostka et al. 2009) et le TNF-α (Q.
Vieira et al. 1996) jouent aussi un rôle dans le recrutement des neutrophiles et le contrôle
du développement de la maladie à plus long terme.
Macrophages et Leishmania
Les macrophages sont la principale cellule hôte des amastigotes. Selon leur type
d’activation, ils seront plus ou moins permissifs à l’infection. Alors que les macrophages
activés selon la voie classique (M1) sont en mesure de tuer efficacement les parasites, les
macrophages activés selon la voie alternative sont permissifs à l’infection (Martinez et al.
2009) (Hölscher 2006) (B. H. W. Murray & Nathan 1999). Ce sont les intermédiaires
oxygénés et nitrogénés réactifs qui participent à l’élimination des parasites (B. H. W.
Murray & Nathan 1999). Les parasites du genre Leishmania ont développé des différentes
tactiques afin de pouvoir survivre dans leur hôte, celles-ci passent principalement par
l’inhibition ainsi que la modulation des gènes de leurs cellules hôtes : les macrophages
(Buates & Matlashewski 2001; M. C. De Almeida et al. 2003; Hawn et al. 2002). Cette
évasion de la réponse immune sera discutée plus en détail dans la section « Évasion de la
réponse immunitaire » débutant à la page 26.
25
Lymphocytes T et Leishmania
Figure 10: Les souris C57BL/6 et BALB/c ont des réactions immunitaires différentes face au parasite Leishmania;
la maladie progresse aussi différemment chez ces deux souches de souris.
Du point de vue de l’immunité médiée par les lymphocytes T auxiliaires, les expériences
d’infection avec L. major réalisées chez différentes souches de souris (Figure 10) ont
permis de mettre en évidence l’importance d’une réponse immunitaire de type Th1 dans le
contrôle de la charge parasitaire et éventuellement dans la guérison de la maladie (P
Launois et al. 1997) (Himmelrich et al. 2000). Ce résultat est logique parce que la réponse
immunitaire de type Th1 est connue pour être particulièrement efficace contre les
pathogènes intracellulaires. Dans le cas du parasite Leishmania, cela se fait premièrement
par la production d’IFN-γ par les lymphocytes T auxiliaires Th1 ainsi que par les
lymphocytes cytotoxiques présents au site d’infection. L’IFN-γ est alors en mesure
d’activer les macrophages afin qu’ils puissent produire des intermédiaires oxygénés et
nitrogénés réactifs utilisés afin d’éliminer les parasites préalablement phagocytés (Liew et
al. 1990) (Evans & Thai 1993). La susceptibilité aux infections avec L. major peut donc
être associée à une réponse de type Th-2 impliquant la production de cytokines telles l’IL4, IL-12, IL-10, toutes des signes de réponse Th-2 et antagonistes à la réponse Th-1
contribuant à l’inhibition de l’activation des macrophages (David Sacks & Noben-Trauth
2002). Bien que le modèle d’infection murin soit assez représentatif de ce qui se passe chez
l’humain, la polarisation de la réponse immunitaire n’est cependant pas aussi franche chez
l’humain. L’analyse de la réponse immunitaire par l’étude de la réponse cytokinaire des
26
lymphocytes T périphériques humains a démontré une réponse immunitaire mixte Th-1 et
Th-2 (Barral et al. 2001). Comme pour le modèle murin, il a cependant été démontré chez
l’homme que la résolution de la leishmaniose cutanée était liée à une réponse immunitaire
de type Th-1 médiée par l’IFN-γ (Rogers et al. 2002).
Évasion de la réponse immunitaire
Les parasites protozoaires ont évolué afin de pouvoir évader la réponse immunitaire de leur
hôte et ainsi pouvoir provoquer des infections chroniques chez celui-ci. Le parasite
Leishmania ne fait pas exception et a lui aussi quelques moyens à sa disposition afin
d’avoir un cycle infectieux le plus efficace possible (David Sacks & Sher 2002).
Le LPG du parasite à un grand rôle à jouer dans ces processus d’évasion du système
immunitaire de l’hôte. Il a précédemment été démontré que les promastigotes sous leur
forme métacyclique étaient plus résistants au système du complément que les
promastigotes sous leur forme procyclique (Puentes & R. Da Silva 1990). Ce phénomène
corrèle avec le fait que les chaines latérales du LPG sont plus longues lorsque le parasite
est sous ça forme métacyclique (McConville et al. 1992) ; cela pourrait empêcher la
formation du complexe d’attaque membranaire (MAC) par les protéines du complément.
Bien que le parasite Leishmania n’engendre pas de remodelage significatif du phagosome,
(Courret et al. 2002) il semble qu’il soit à l’origine d’une inhibition transitoire de la
maturation de celui-ci (Dermine et al. 2000). Cela permettrait au parasite de se différencier
de sa forme promastigote à sa forme amastigote ; cette dernière étant plus résistante au pH
acide ainsi qu’aux différentes enzymes hydrolytiques présentes dans le phagolysosome.
Le parasite Leishmania est aussi capable d’influencer la production de cytokines de son
hôte à son avantage. Il est en mesure de diminuer l’efficacité de la réponse immunitaire par
l’inhibition de la transcription du gène de l’IL-12p40 (McDowell & DL Sacks 1999).
Sachant que l’IL-12 induit la production d’IFN-γ, une molécule particulièrement
27
importante dans le développement d’une immunité efficace contre les pathogènes
intracellulaire, on comprend mieux pourquoi cette inhibition est favorable au parasite.
Traitements et prévention de la leishmaniose
Leishmania étant un eucaryote unicellulaire, les infections qu’il cause sont assez difficiles à
traiter du fait qu’il est phylogénétiquement plus proche des cellules humaines (comparé aux
procaryotes, comme les bactéries par exemple). Les drogues traditionnellement utilisées
pour le traitement de la leishmaniose sont l’antimoine pentavalent (dont le développement
remonte à 1945), la pentamidine et l’amphotéricine B. Probablement due aux retombées
financières peu encourageantes, le développement et l’étude de ces molécules ne semble
pas être une priorité pour la plupart des entreprises pharmaceutiques. C’est probablement
aussi ce qui explique le peu de nouvelles avancées dans ce champ d’étude ainsi que le fait
que les mécanismes d’action des drogues préalablement mentionnées ne sont pas
totalement identifiés. Il semble cependant que l‘antimoine pentavalent agit sur le
métabolisme des purines, molécules essentielles composant l’ADN et l’ARN (Frézard et al.
2009). L’amphotéricine B fonctionne quant à elle par la formation d’un pore membranaire
chez le parasite; déstabilisant ainsi le contenu ionique de son cytoplasme pour finalement
mener à sa mort (Baginski & Czub 2009). Même si ces drogues sont acceptablement
efficaces, elles ont de nombreux défauts dont la voie d’administration (intraveineuse), la
durée du traitement (souvent de plusieurs semaines) ainsi que les effets secondaires
néfastes pour l’organisme (fatigue, problèmes rénaux, cardiaques et pancréatiques)
(Herwaldt 1999). Il est aussi important de noter que des cas de résistance à ces différentes
molécules ont été observés en clinique (Croft et al. 2006) (Ouellette et al. 2004).
D’un point de vue vaccinal, aucune solution vraiment efficace n’a encore été mise au point.
Sachant qu’une infection cutanée guérie confère à son hôte une protection contre les
infections subséquentes du même type, il est possible de croire qu’une préparation
vaccinale efficace pourrait avoir les mêmes effets protecteurs. Différentes stratégies
vaccinales sont présentement au stade de développement et se basent sur différents
28
principes. Certains croient que l’induction d’une forte réponse immunitaire contre la salive
de l’insecte pourrait engendrée une forte réponse immunitaire au site de la piqûre et ainsi
contraindre le parasite. D’autres croient plutôt à une approche vaccinale plus classique
composée de parasites tués et d’ADN du parasite; cette dernière composante servant à
l’activation des lymphocytes T CD8+, cellules importantes dans la résistance aux infections
causées par des parasites intracellulaires (Okwor & Uzonna 2009) (P. M. Kaye &
Aebischer 2011).
La prévention n’est pas non plus à négliger. C’est un moyen efficace et peu couteux de
ralentir la propagation de la maladie. Cette prévention passe essentiellement par le contrôle
du vecteur (la mouche des sables) ainsi que des réservoirs animaux. Le contrôle du vecteur
est entre autres effectué par l’usage d’insecticides dans les endroits les plus à risque (Clive
R Davies et al. 2003) ainsi que par l’emploi de filets recouvrant le lit et la personne qui s’y
trouve. Une étude réalisée au Népal a prouvé l’efficacité de cette dernière méthode en
démontrant une réduction des incidences de leishmaniose viscérale de 70% (Bern et al.
2000). Pour ce qui est du contrôle des réservoirs animaux, une étude réalisée au Brésil à
démontré des résultats prometteurs qui ont cependant été remis en perspective dans une
seconde étude (Ashford et al. 1998) (Gavgani et al. 2002). Des études utilisant des
insecticides directement sur les chiens ont aussi été réalisées. Bien qu’elles ont démontré
des résultats intéressants, il est à se questionner au niveau de la mise en application
quotidienne de ce genre de mesures préventives.
29
Glycobiologie
Chez les mammifères, les sucres recouvrent la surface de toutes les cellules (Figure 11).
Parce qu’ils sont les éléments situés principalement aux extrémités des cellules, ces sucres
formant le glycocalyx sont impliqués dans plusieurs mécanismes cellulaires.
Figure 11: Photographie en microscopie électronique d'un marquage spécifique du glycocalyx.
C’est dans l’appareil de Golgi qu’a lieu le processus de glycosylation des protéines. Cela se
produit grâce à de nombreuses enzymes ; entre autres les glycosyltransférases qui
catalysent le transfert des saccarides de la molécule donneuse vers la protéine à glycosyler
ainsi que les glycosidases qui catalysent l’hydrolyse des liens glycosidiques au sein d’une
structure de sucres complexes (Van Kooyk & Gabriel a Rabinovich 2008) (Ohtsubo &
Marth 2006). Il existe deux types de glycosylation chez les mammifères ; leur
différenciation est principalement basée sur la séquence protéique sur laquelle la
glycosylation est amorcée.
Figure 12: N-glycosylation et O-glycosylation chez les eucaryotes.
30
Les sucres N-liés sont reconnaissables par leur séquence riche en résidus mannose et par le
fait qu’ils sont liés à la protéine par le biais d’un résidu asparagine présent dans la séquence
ASN-X-Ser/Thr où le X représente un acide aminé quelconque. Les sucres O-liés sont
quant à eux reliés à des résidus sérine, thréonine ou hydroxylysine sans regard aux
séquences adjacentes (Figure 12).
La formation des glycans cellulaires peut être régulée de multiples façons (Figure 13)
(Ohtsubo & Marth 2006) que ce soit par : (i) le contrôle de la transcription des gènes des
glycosyltransférases et des glycosidases, (ii) la synthèse et le transport des nucléotides de
sucres qui agissent comme donneurs de sucres, (iii) la modulation par phosphorylation des
enzymes impliquées dans les processus de glycosylation, (iv) la compétition
enzyme/substrat à l’intérieur du Golgi, (v) la modulation du transport intracellulaire des
enzymes, (vi) la protéolyse des enzymes pouvant avoir lieu dans le Golgi ainsi que par (vii)
le renouvèlement des glycoprotéines par endocytose à la surface cellulaire.
Figure 13: Le contrôle de la glycosylation chez les mammifères.
31
Galectines
Les galectines sont des protéines retrouvées chez un large spectre d’êtres vivants en passant
des vertébrés (poissons, oiseaux, amphibiens et animaux) jusqu’aux
protistes
(champignons) sans oublier les invertébrés comme les insectes et les vers (D. N. W.
Cooper & Barondes 1999). Quinze galectines sont jusqu’ici connues chez les animaux
(Figure 14). D’un point de vue structural, elles possèdent toutes un domaine de
reconnaissance des sucres (CRD). Selon leur structure, les galectines sont classées en 3
familles distinctes. Les galectines 1, 2, 7, 11, 13 et 14 sont classées dans la famille des
prototypes, car elles ne sont composées que d’un seul ou de deux CRD sans aucune autre
structure protéique. La Gal-3 est quant à elle le seul membre de la famille des galectines
chimériques. Elle a la particularité de posséder une queue protéique N-terminale lui
permettant, suite à la liaison à son ligand, de former des oligomères. Finalement, les
galectines 6, 8, 9 et 12 sont classés dans la famille des tandems répétés, car elles sont
composées de 2 CRD (pas toujours identiques) liés ensemble par une région peptidique
(Nieminen et al. 2007).
Figure 14: Les 3 familles de galectines et leurs membres respectifs.
Les galectines sont des lectines c’est-à-dire qu’elles sont des protéines ayant une affinité
pour les sucres. Les galectines ont une affinité spécifique pour les saccarides de type β-
32
galactoside. C’est-à-dire une molécule composée d’une molécule de galactose liée en bêta
avec un autre monosaccaride. La liaison des galectines aux oligosaccharides est cependant
d’une affinité relativement faible (Kd d’environ10-6) lorsque comparée à une liaison
typique entre deux protéines (Kd d’environ10-8). À la manière des IgM, certaines galectines
peuvent s’oligomériser afin d’augmenter l’avidité de leur liaison à plusieurs ligands à la
fois. La Gal-3 est un bon exemple de cette possibilité par ça capacité à former des
pentamères suite à la liaison de multiples molécules de Gal-3 à leurs ligands (Gabriel a
Rabinovich et al. 2007). Cette capacité à former des oligomères et ainsi augmenter l’avidité
de liaison de certaines galectines à leurs ligands peut être démontrée par un autre exemple :
en comparant la capacité de liaison de la Gal-3 entière avec la capacité de liaison du CRD
de la Gal-3 avec le LPG de L. major. En incubant à 37°C, la fluidité des membranes fait
que seulement la Gal-3 entière et non son CRD seul peut lier de manière relativement
stable le LPG. Cela s’explique par le fait que la partie N-terminale de la Gal-3 entière lui
permet de former des oligomères ; ce qui n’est évidemment pas le cas en utilisant le CRD
seulement. Il ne faut cependant pas tenir pour acquis que toutes les galectines peuvent lier
avec la même affinité tous les ligands de type β-galactoside. En effet, les CRD de chaque
galectines ne sont pas identiques et possèdent des affinités particulières pour certains
ligands (Jun Hirabayashi et al. 2002). Il faut aussi prendre en compte l’arrangement et la
disponibilité des ligands. La gp120 à la surface du VIH en est un bon exemple où
l’agrégation des sucres à sa surface favorise la liaison de la Gal-1 au détriment de la liaison
de la Gal-3 (Christian St-Pierre et al. 2011). Les galectines sont des protéines cytosoliques
qui ne possèdent pas de peptide signal; ce qui explique le fait qu’elles ne sont pas sécrétées
par la voie de sécrétion traditionnelle. Elles sont synthétisées par des polysomes libres et
s’accumulent dans le cytoplasme jusqu’à leur libération dans l’environnement
extracellulaire pouvant se faire soit par le bris de la cellule ou par un mécanisme de
sécrétion qui est encore inconnu pour le moment (A Varki et al. 1999).
33
Galectines et immunité
Figure 15: Rôles connus de différentes galectines au niveau des cellules immunitaires.
Galectines et immunité : Neutrophiles
Comme mentionné précédemment, le processus de migration des neutrophiles est un
élément clef de la réponse immunitaire innée qui met en jeux plusieurs acteurs dans des
rôles précis. Certaines autres molécules non mentionnées précédemment viennent aussi
participer à ce processus physiologique. Il a en effet été démontré par notre laboratoire que,
bien que la Gal-3 ne soit pas proprement une molécule chimioattractante in vitro, elle a la
34
capacité de lier les neutrophiles ainsi que les cellules de l’endothélium vasculaire ;
participant ainsi au processus de migration cellulaire. Le tout fut démontré in vitro par des
techniques de FRET (Fluorescence resonance energy transfer) (Nieminen et al. 2007) ainsi
qu’in vivo par l’emploi de souris Gal-3 KO infectées selon un modèle de pneumonie à
Streptococcus pneumoniae où la Gal-3 est impliquée dans le recrutement de neutrophiles
aux poumons (Nieminen et al. 2008). N’ayant pas d’influence lors de stimulations
pulmonaires avec le LPS, l’importance de la Gal-3 serait donc dépendante du stimulus
utilisé. À ce sujet, il a aussi été démontré que la migration des neutrophiles induite par S.
pneumoniae est indépendante des molécules de β2-intégrines. Aussi, la Gal-3 a des effets
plutôt pro-inflammatoires sur les neutrophiles. Elle va entre autres induire la flambée
oxydative (Yamaoka et al. 1995), induire la production d’IL-8 (Nieminen et al. 2005) et
inhiber l’apoptose (Farnworth et al. 2008) des neutrophiles. Il a aussi été démontré que
l’élastase produite par les neutrophiles avait la capacité d’inhiber la Gal-3 par le clivage de
sa partie N-terminale (Nieminen et al. 2005). Ce processus pourrait être une sorte de rétro
inhibition permettant de mettre fin au processus d’activation des neutrophiles par la Gal-3.
La Gal-1 semble avoir des effets généralement contraires à ceux de la Gal-3. Il a en effet
été démontré qu’elle est en mesure d’inhiber les interactions entre les neutrophiles et les
cellules endothéliales (La et al. 2003). La Gal-1 est aussi en mesure de provoquer
l’exposition de phosphatidylsérine, un marqueur d’apoptose, chez les neutrophiles activés.
La Gal-1 a aussi une certaine activité pro-inflammatoire chez les neutrophiles en stimulant
la libération de superoxyde par les neutrophiles (S. R. Stowell et al. 2007).
Galectines et immunité : Monocytes et macrophages
Bien que ce résultat soit quelque peu controversé (nous avons été incapables de le
reproduire dans notre laboratoire), il a été publié que la Gal-3 est chimioattractante pour les
macrophages ainsi que pour les monocytes (H Sano et al. 2000). Autre sujet controversé est
la participation de la Gal-3 dans la phagocytose des macrophages. Alors qu’une étude
employant des globules rouges opsonisées ainsi que des thymocytes apoptotiques a
démontrée l’importance de la Gal-3 dans la phagocytose de ces particules (Hideki Sano et
35
al. 2003), d’autres études employant Mycobacterium tuberculosis, (Beatty et al. 2002), S.
pneumoniae (Farnworth et al. 2008) ou L. major (observations non publiées de notre
laboratoire) n’ont pas été en mesure de mettre en évidence une différence du niveau de
phagocytose entre les cellules de type sauvage et les cellules Gal-3 KO. La Gal-3 est aussi
en mesure de médier l’activation alternative des macrophages. Cela a été démontré par le
fait que les macrophages provenant de souris Gal-3 KO sont moins sensibles à l’activation
alternative induite par l’IL-4 et l’IL-13 lorsque comparé aux macrophages provenant de
souris Gal-3 KO. Aucune différence entre les macrophages de type sauvage et les Gal-3
KO n’a cependant été observée lors des essais d’activation classique par le LPS et l’IFN-γ
(MacKinnon et al. 2008). Dans la même étude, les auteurs ont démontré que la stimulation
par de la Gal-3 recombinante de macrophages de type sauvage était suffisante pour que les
cellules s’activent par la voie alternative, activation visible par l’activation de PI3K, une
kinase importante dans la prolifération, la survie ainsi que la régulation génique menant à
l’activation alternative des macrophages. En lien avec l’activation alternative, la Gal-3
semble agir comme molécule anti-inflammatoire pour les macrophages. Il a en effet été
observé que l’absence de Gal-3 augmentait la production de cytokines pro-inflammatoires
telles l’IL-6, l’IL-12 et le TNF-α suite à la stimulation de macrophages avec du LPS (Li et
al. 2008).
La Gal-1 semble encore ici avoir des effets anti-inflammatoires visibles par le fait qu’elle
induise une maturation des macrophages vers la voie alternative visible via une diminution
de la synthèse d’oxyde nitrique (Silvia G Correa et al. 2003) ainsi que par une inhibition
libération d’acide arachidonique, (G. Rabinovich et al. 2000) un précurseur des molécules
pro-inflammatoires de la famille des éicosanoides.
Finalement, la Gal-9 a démontré des effets pro-apoptotiques sur la lignée cellulaire THP-1
(Kashio et al. 2003). Elle a aussi effets au niveau intracellulaire. Cela a été proposé par le
fait qu’un vecteur permettant la surexpression intracellulaire de Gal-9 à l’intérieur de
cellules THP-1 permettait d’observer une transcription accrue des gènes de IL-1α, IL-1β,
ainsi que de l’IFN-γ, ce que l’ajout extracellulaire de Gal-9 était incapable de provoquer.
36
Galectines et immunité : Cellules dendritiques
L’exposition de cellules dendritiques à la Gal-1 a comme effet d’induire leur maturation
vers des cellules démontrant une augmentation de la migration à travers la matrice de
Matrigel ou à travers un modèle in vitro de matrice extracellulaire lorsque comparé à des
cellules dendritiques maturées avec du LPS (Fulcher & Hashimi 2006). Il a aussi été
démontré que la Gal-1 est en mesure d’induire la tolérance chez les cellules dendritiques.
En effet, lorsque mis en contact avec la Gal-1, les cellules dendritiques vont acquérir un
phénotype de type régulatoire. Celui-ci se caractérise par une expression diminuée de
CD11c ainsi que par une expression augmentée du CD45RB à la surface des cellules
dendritiques incubées en présence de Gal-1. Ces cellules ont aussi démontré une sécrétion
d’IL-27 augmentée (Ilarregui et al. 2009). Cela est particulièrement intéressent dû au fait
que l’IL-27 a déjà été mise en lumière comme étant importante au niveau de la régulation
de la balance entre l’immunité et la pathologie chez L. major (C. F. Anderson et al. 2009).
Les cellules dendritiques ayant été incubées avec la Gal-1 sont aussi en mesure
d’influencer les cellules T CD4+ vers le phénotype Th2 en diminuant leur prolifération,
leur sécrétion d’IFN-γ et d’IL-17, mais en augmentant leur sécrétion d’IL-10 (Ilarregui et
al. 2009).
L’emploi de cellules dendritiques déficientes en Gal-3 a permis de découvrir qu’elles
produisaient des niveaux d’IL-12 supérieurs à ceux mesurés chez les cellules de type
sauvage ; laissant présager que la Gal-3 aurait un effet inhibiteur sur la production de cette
cytokine (Bernardes et al. 2006). Ce résultat laisse aussi présager que la Gal-3 altèrerait la
maturation des lymphocytes T auxiliaires Th1 par des niveaux d’IL-12 moindres. Il
semblerait aussi que la Gal-3 ait un rôle à jouer au niveau de la migration (Daniel K Hsu et
al. 2009) et de l’adhésion (Vray et al. 2004) des cellules dendritiques.
La galectine-9 a aussi un effet sur la maturation des cellules dendritiques. Les cellules
dendritiques ayant été maturés en présence de Gal-9 ont une meilleure capacité à sécréter
de l’IL-12. Cela va par le fait même profiter aux lymphocytes T CD4+ qui vont alors
préférentiellement se différencier en cellules du sous-type Th1. Il est cependant à noter que
les effets de la Gal-9 sur les cellules dendritiques ne soient pas associés au CRD de la Gal9 (Yamauchi et al. 2005).
37
Galectines et immunité : Lymphocytes T
Continuant sur les rôles généralement immunorégulateurs et anti-inflammatoires de la Gal1, il a premièrement été découvert qu’elle avait une action pro-apoptotique sur les
lymphocytes T (Perillo et al. 1995). Il semble cependant que cette fonction pro-apoptotique
soit spécifique aux sous-types Th1 et Th17 et non aux cellules Th2 qui possèdent une
glycosylation de leurs protéines de surface différente (M. a Toscano et al. 2007). Fait
intéressant, ces cellules de type Th2 sécrètent aussi de la Gal-1 qui peut alors provoquer
l’apoptose des autres types cellulaires (Motran et al. 2008). La Gal-1 est aussi en mesure
d’influencer l’activité des lymphocytes T en ayant une action immunorégulatrice sur ceuxci. Elle est en mesure de lier le TCR (seule ou conjointement avec un antigène) et de
modifier la phosphorylation de celui-ci et ainsi réguler à la baisse l’activation du
lymphocyte T. Elle est aussi en mesure d’influencer le seuil d’activation nécessaire à la
stimulation du TCR (C. D. Chung et al. 2000). La Gal-1 fait pencher la balance cytokinaire
des lympohocytes T vers la voie Th2 par l’induction de la production de cytokines telles
l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 ainsi que l’IL-13 tout en diminuant la production des cytokines Th1
classique que sont l’IFN-γ, le TNF-α ainsi que l’IL-2 (Motran et al. 2008). D’un point de
vue dynamique, la Gal-1 semble avoir des effets inhibiteurs sur le roulement, sur
l’adhésion des lymphocytes T aux cellules endothéliales ainsi qu’aux cellules de la matrice
extracellulaire (G a Rabinovich et al. 1999) en plus de diminuer la capacité des
lymphocytes T à capter les antigènes (Norling et al. 2008). Il est cependant important de
porter une attention particulière à la préparation de la Gal-1, alors que nous utilisons de la
Gal-1 préparée au sein même de notre laboratoire, certaines autres équipes utilisent des
préparations commerciales de Gal-1 pouvant contenir certains agents préservatifs comme le
DTT. Une solution de Gal-1 préparée sans DTT perd sa capacité à moduler la viabilité
cellulaire des lymphocytes T, mais conserve toujours sa capacité à moduler la sécrétion des
cytokines par ces cellules (S. R. Stowell et al. 2008).
Pour ce qui est de la Gal-3, elle a démontré une capacité à engendrer la production d’IL-2
chez les lymphocytes T (D K Hsu et al. 1996). Elle aussi démontré un fort potentiel (plus
important que celui de la Gal-1) à induire l’apoptose des lymphocytes T (Fukumori et al.
2003) (Stillman et al. 2006). Contrairement à la Gal-1, cette action pro-apoptotique est
38
valable à la fois sur les lymphocytes T de type Th1 et Th2. Cette action pro-apoptotique de
la Gal-3 est valable pour la Gal-3 exogène donc extracellulaire. La surexpression de Gal-3
à l’intérieur des cellules a cependant l’effet inverse ; c’est-à-dire qu’elle retarde le
processus de mort cellulaire en contribuant à maintenir un potentiel mitochondrial adéquat
ainsi qu’en retardant la libération de cytochrome c par la mitochondrie (Matarrese et al.
2000) (F. Yu et al. 2002).
La Gal-9 est reconnue pour lier la molécule Tim-3 qui est retrouvée spécifiquement à la
surface des lymphocytes Th1. Le lien de la Gal-9 à Tim-3 entre un efflux de calcium à
l’intérieur des cellules, menant ainsi à leur agrégation, puis à leur mort. Des résultats
obtenus in vitro montrent que l’administration de Gal-9 résulte en une diminution de la
production d’IFN-γ en plus de réduire les phénomènes d’auto-immunité liés aux
lymphocytes Th1 (Zhu et al. 2005).
Galectine-7
L’étude de la Gal-7 est relativement récente. Quelques données sont disponibles quant aux
rôles possibles qu’elle peut avoir. Les études effectuées sont pour le moment plutôt du
niveau systémique que cellulaire. Il a premièrement été découvert que la Gal-7 était surtout
exprimée dans les tissus de la peau, de l’estomac et de l’œsophage (M. M. Sato et al. 2002).
Une surexpression de Gal-7 a aussi été observée lors de certains cancers comme les
carcinomes et les lymphomes (Demers et al. 2009). La Gal-7 semble aussi avoir des rôles à
jouer au niveau de l’homéostasie épithéliale; entre autres au niveau de la migration et de la
prolifération des kératinocytes (Gendronneau & Sidhu 2008).
Galectines et Leishmania
Comme ultérieurement mentionné, la Gal-3 est en mesure de lier le parasite Leishmania
major par la molécule de surface nommée lipophosphoglycan (LPG). Il est aussi à noter
que la Gal-9, mais pas la Gal-1, lie le LPG de L. major (Pelletier et al. 2003).
39
Le lien de la Gal-9 au parasite semble aider à la phagocytose des parasites par les
macrophages, ce qui n’est cependant pas le cas pour la Gal-3.
40
Objectifs de recherche
Les études préalablement effectuées au sein de notre laboratoire et publiées par d’autres
équipes de recherche nous ont permis de savoir que:




Les galectines-3, -7 et -9 ont différents rôles dans la réponse immunitaire.
Les galectines-3 et -9 lient L. major.
La galectine-3 est clivée par la GP63 de L. major.
La galectine-3 est impliquée dans la réponse immunitaire innée contre L. major.
En tenant compte de ces points, nous nous sommes fixé les objectifs suivants :


Déterminer comment la galectine-3 participe à la régulation de la réponse immune
contre le parasite L. major.
Déterminer si les galectines-7 et -9 pourraient avoir un rôle à jouer dans la réponse
immune contre le parasite L. major
41
Matériel et méthodes
Souris
Les souris Gal-3 KO et Gal-9 KO ont été obtenues par le « Consortium of Functional
Glycomics » et sont issues de souris de type C57BL/6. Les souris Gal-7 KO ont été
obtenues du Dr Yves St-Pierre, chercheur à l’INRS Armand Frappier. Elles sont toutes
maintenues en reproduction dans des conditions normales à l’intérieur de notre animalerie.
Les souris WT C57BL/6 sont quant à elles achetées chez les laboratoires Charles River.
Les souris utilisées pour les protocoles sont toutes des femelles âgées entre 8 et 10
semaines. Les groupes expérimentaux comptèrent entre 5 à 7 souris chacun. Tous les
protocoles ont été approuvés par le Comité de Protection des Animaux (CPA) de
l’Université Laval.
Galectine-3 recombinante
La Gal-3 recombinante utilisée au cours de ses expériences est produite dans notre
laboratoire. En résumé, la souche JM109 de E. coli fut transformée avec un plasmide lui
permettant d’exprimer la Gal-3 humaine sous l’expression d’un promoteur inductible. Six
erlenmeyers de 1 litre furent ensemencés avec ce stock de bactéries et laissés incubés à
37°C pour la nuit. Le lendemain matin, une induction de 3h à 37°C avec 1mM isopropyl βD-thiogalactoside fut performée. Les bactéries furent ensuite culotées et resuspendues dans
un tampon contenant 20mM Tris-HCl pH 7.5, 0.15M NaCl, 5mM EDTA, 1mM DTT, ainsi
qu’une mixture d’inhibiteurs de protéases procaryotes (Sigma). Le mélange obtenu fut
ensuite soniqué et ultracentrifugé afin de recueillir uniquement la fraction soluble
contenant la Gal-3. Cette fraction est alors passée sur une colonne de lactose-agarose
(Sigma). La colonne est ensuite lavée avec du PBS et éluée avec 150mM de lactose.
L’éluat recueilli est alors passé dans une colonne de chromatographie d’exclusion PD-10
(GE Healtcare) afin de recueillir la Gal-3 sans lactose. Cette Gal-3 purifiée est alors passée
42
dans une colonne d’Acticlean Etox (Sterogène) afin de retirer les endotoxines restantes. La
concentration protéique de la solution ainsi obtenue est déterminée par Bradford (Bio-Rad).
Le niveau d’endotoxines est ensuite testé par LAL (Limulus amebocyte lysate) (Lonza). Le
niveau d’endotoxines des Gal-3 utilisées se situait sous la barre des 10EU/mL. Finalement,
des tests sont effectués pour chaque lot de Gal-3 produits afin de s’assurer de la qualité de
la préparation. Deux tests sont effectués de façon routinière : la mise sur gel SDS-Page
permet d’évaluer la taille moléculaire des protéines produites et d’avoir une idée du niveau
de dégradation de la partie N-terminale s’il y a lieu et le test d’hémaglutination des
globules rouges nous permet d’évaluer l’activité lectine de la Gal-3 produite. Ce test
d’hémaglutination est effectué en ajoutant 5l d’une préparation de globules rouges
(préalablement calibrée) à une concentration décroissante de Gal-3. Il a été déterminé au
laboratoire qu’un lot standard de Gal-3 est en mesure d’hémagglutiner les globules rouges
jusqu’à une concentration de 1.5μM (Figure 16).
Figure 16: Test d'hémaglutination des globules rouges effectué comme contrôle qualité des galectines produites
dans notre laboratoire.
A : Avant l’incubation
B : Après l’incubation
C : Concentration de galectine utilisée dans les colonnes 2 et 3 des Figures A et B.
Colonne 1 : Calibration des globules rouges (de 5μl (A) à 40μl (H) par puits).
Colonne 2 : Test d’hémaglutination employant la Gal-3 et 5μl de globules rouges.
Colonne 3 : Mêmes conditions que la colonne 2 + 150mM de lactose.
43
Parasites et cellules
Les souches de Leishmania sont maintenues en croissance dans un milieu SDM modifié et
supplémenté avec 10% de FBS (Thermo Scientific), 5g/ml d’hémine (Sigma) ainsi que
100g/ml de pénicilline (Gibco), 100g/ml de streptomycine (Gibco) et 2M de glutamine
(Fisher Scientific). Ils sont cultivés à température de la pièce dans flasques de 25cm2
(Corning) placés dans un agitateur rotatif. Sauf avis contraire, les parasites utilisés sont des
promastigotes en phase de croissance stationnaire ; c’est-à-dire qu’ils sont en culture depuis
environ 7 jours. Les expériences effectuées in vivo sont réalisées avec des promastigotes
fraichement issus d’amastigotes. Les amastigotes sont obtenus suite à l’injection de
promastigotes en phase stationnaire dans le coussinet plantaire de souris BALB/c. Environ
5 à 7 semaines post infection, les souris sont sacrifiées et les coussinets plantaires sont
récupérés afin d’isoler les amastigotes. L’isolation débute par le bris mécanique des tissus
par l’emploi d’un pilon et d’un treillis métallique (Sigma). Les macrophages (contenant les
amastigotes) sont ensuite lysés dans un homogénisateur à tissus (Pyrex) et les amastigotes
recueillis sont lavés avec du PBS puis cultivés à température de la pièce comme mentionné
précédemment afin qu’ils se transforment en promastigotes. Afin de s’assurer qu’ils
conservent un maximum de virulence, ces promastigotes sont utilisés suite à un maximum
de trois passages dans les cas des expériences faites chez la souris.
Résumé des souches de parasites utilisées :
 L. major LV39
 L. major Friedlin
 L. major Friedlin Spok (déficient en β-galactosyltransférase)
 L. donovani
Les fibroblastes murins sont obtenus à partir du modèle de la poche d’air. Brièvement, une
cavité d’air stérile est gonflée sur le dos des souris aux jours 0 et 3. Au jour 7, 2ml de
trypsine 5x (Gibco) est injecté dans la poche d’air et est récupéré 5 minutes plus tard. Cette
44
étape est ensuite répétée deux autres fois afin d’augmenter le taux de recouvrement des
fibroblastes. Les cellules sont ensuite lavées dans du DMEM (Gibco) supplémenté avec
10% FBS. 5E5 cellules par puits sont ensuite mises en culture dans une plaque 24 puits
(Corning). La stimulation d’une durée de 3 heures est faite le lendemain en utilisant 2 E6
parasites (ratio de 1 fibroblaste pour 4 parasites). Les surnageants de culture sont ensuite
récoltés et congelés à -80°C pour analyses ultérieures.
Les macrophages murins sont issus des monocytes de la moelle osseuse des souris. Les
souris sont donc sacrifiées afin de récupérer les fémurs et les tibias des pattes arrière. La
moelle est ensuite expulsée des os à l’aide d’une seringue remplie de PBS. Les monocytes
sont ensuite isolés par gradient de Ficoll (GE Healtcare) puis lavés. 6E5 monocytes par
puits (plaque 24 puits) sont ensuite mis en culture. Durant une semaine, ils sont différenciés
en macrophages par l’ajout de 10ng/ml de GM-CSF (Peprotech). La stimulation d’une
durée de 3 heures est faite suite à cette semaine de différenciation en utilisant 3E6 parasites
(ratio de 1 fibroblaste pour 5 parasites). Les surnageants de culture sont ensuite récoltés et
congelés à -80°C pour analyses ultérieures.
Modèle d’infection du coussinet plantaire
Les souris ont été infectées avec 3E6 parasites en phase stationnaire. Ces parasites,
resuspendus dans 50l de PBS, furent injectés de manière sous-cutanée dans je coussinet
plantaire gauche des souris. Le coussinet plantaire droit (non infecté) a servi de contrôle
tout au long de l’expérience. Le suivi de l’infection s’est fait de manière hebdomadaire par
la mesure de la longueur, de l’épaisseur et de la largeur de la région inflammée afin
d’obtenir une mesure de volume. Cette mesure de volume de la patte inflammée fut ensuite
soustraire par la mesure équivalente de la patte non inflammée. Les graphiques ainsi
produits illustrent le suivi hebdomadaire de la mesure suivante : (Volume du coussinet
plantaire infecté) – (Volume du coussinet plantaire non infecté).
45
Modèle de la poche d’air
Au jour 0, les souris sont rasées sur une petite surface de leur dos et 3ml d’air stérile leur
est injecté de manière sous-cutanée afin de former la poche d’air dorsale. Au jour 3, une
seconde injection de 3ml d’air stérile a lieu afin de consolider la formation de la poche
d’air. Le jour 7 est le jour de la stimulation. Au temps 0, 1ml de stimulant est injecté dans
la poche d’air. Dans le cas des parasites Leishmania, 3E6 parasites sous la forme
promastigote en phase stationnaire de croissance et resuspendus dans 1ml de PBS ont été
injectés. Des lavages (3 lavages de 1ml chaque) sont ensuite performés à différents temps
d’incubation afin de recueillir les molécules ayant été sécrétées dans la poche d’air ainsi
que les cellules y ayant migré. Le premier lavage est recueilli séparément des deux autres
afin de pouvoir y mesurer le sécrétome. Les cellules provenant des trois lavages sont
ensuite mixées ensemble afin de pouvoir faire leur décompte au bleu acétique. Les types
cellulaires sont ensuite déterminés à l’aide d’une coloration Diff Quick (Dare Behring).
Détection de la Gal-3 par Western Blot
Ayant découvert que l’ÉLISA dosant la Gal-3 de chez R&D (DY1197) n’est pas
spécifique, tous mes dosages de Gal-3 furent effectués par Western Blot. Suite au gel SDSPAGE et au transfert sur membrane de nitrocellulose, la membrane fut colorée au ponceau
(Sigma) afin d’avoir une idée de la qualité du transfert. La membrane fût ensuite bloquée
en utilisant une solution de 5% de lait en poudre dans du TBST. La détection de la forme
complète de la Gal-3 s’est faite par l’emploi de l’anticorps monoclonal anti-Mac-2 produit
dans notre laboratoire à partir de l’hybridome M3/38.1.2.8 HL.2 (ATCC) dilué 1 :300
tandis que la détection de la forme clivée de la Gal-3 s’est faite par l’emploi de l’anticorps
polyclonal anti-CRD 1 :1000 aussi produit dans notre laboratoire par l’injection de CRD de
Gal-3 à des lapins. Ces deux préparations d’anticorps furent biotinylés à l’aide de
l’ensemble EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) selon les directives du manufacturier.
Suite à une incubation avec de la Streptavidine-HRP (R&D Systems) la révélation s’est
46
faite avec les réactifs de western blot Lightning (PerkinElmer) en exposant sur des films
(GE Healtcare).
Analyse des cytokines des échantillons de lavages de poche d’air par ELISA
Comme mentionné précédemment, la partie soluble des lavages de poche d’air fut congelée
à -80°C le jour même de l’expérience pour analyse subséquente. Les niveaux de cytokines
dans ces échantillons furent déterminés par ELISA (R&D Systems) en suivant les
instructions du manufacturier. Brièvement, l’anticorps de capture dilué dans du PBS à été
déposé dans la plaque 96 puits (Nunc) à raison de 100l par puits ; le tout a ensuite été
incubé durant la nuit à 4°C. Le lendemain matin, suivant un cycle de lavage, la plaque a été
bloquée avec 200 l de PBS-5% BSA (Sigma) pour 2 heures. Suivant un cycle de lavage,
les échantillons ainsi que les standards composants la courbe standard ont ensuite été
déposés dans la plaque à raison de 50l d’échantillon ou de standard dilué avec 50l de
PBS-2% BSA. Le tout a été incubé durant 2 heures à TP. Suivant un cycle de lavage,
l’anticorps de détection a ensuite été ajouté dans la dilution appropriée dans du PBS-2%
BSA à raison de 100 l par puits et incubé durant 1 heure à TP. Suivant un cycle de
lavage, la streptavidine HRP diluée dans du PBS-2% BSA a ensuite été ajoutée à raison de
100l par puits. Suivant un dernier cycle de lavage, la révélation s’est faite avec du 100 l
de TMBS (Fitzgerald) par puits, puis stoppée avec 50 l par puits de 0.18M H2SO4. La
lecture s’est ensuite faite avec un spectrophotomètre (Victor v2, PerkinElmer) à 450nm à
raison d’une seconde par puits.
Analyses statistiques
Les analyses statistiques furent performées à l’aide du logiciel Prism (GraphPad). La
comparaison de deux variables s’est faite à l’aide de test t-student tandis que la
comparaison de plusieurs variables entre elles s’est faite à l’aide d’ANOVA. Les
comparaisons pour lesquelles les valeurs calculées de p étaient inférieures à 0.05 furent
considérée comme statistiquement significativement différentes.
47
Résultats
Résultats connexes précédemment obtenus au laboratoire
Infection expérimentale murine
L’emploi de souris KO pour la Gal-3 nous a permis de déterminer l’importance de la Gal-3
lors d’expériences effectuées in vivo. Il a premièrement été démontré lors d’une infection
expérimentale murine que l’intensité d’inflammation du coussinet plantaire mesurée aux
semaines 2, 3 et 4 était supérieure chez les souris Gal-3 KO (G3KO) lorsque comparé aux
souris WT (Figure 17). Ce niveau d’inflammation supérieur chez les souris G3KO corrélait
bien avec une charge parasitaire supérieure dans les coussinets plantaires des souris G3KO
à 24h post infection (Figure 17). De plus, il a été observé que la migration de neutrophiles
vers le site d’infection ainsi que vers les nœuds lymphatiques drainant cette région était
diminuée chez les souris G3KO (Figure 18).
Figure 17: Résultats obtenus suite à l'infection expérimentale de souris Gal-3 KO et WT avec le parasite
Leishmania.
A : Suivi hebdomadaire de la valeur relative du volume du coussinet plantaire des souris
infectées avec L. major LV39.
B : Charge parasitaire mesurée 24h post-infection.
48
Figure 18: Mesure de la quantité de neutrophiles dans le coussinet plantaire et dans le nœud lymphatique le
drainant. Mesures effectuées à 12h et 24h post infection chez les souris Gal-3 KO et WT.
A : Mesure de activité myéloperoxidase (représentative de la quantité de neutrophiles) dans
des homogénats de coussinets plantaires.
B : Mesure du pourcentage de neutrophile (par rapport aux leucocytes totaux) dans des
homogénats de nœuds lymphatique.
Modèle de la poche d’air
Ce modèle expérimental nous a permis d’observer les évènements de la réponse
immunitaire innée se déroulants dans les premières suivant la stimulation dans un
environnement plus circonscrit que celui du coussinet plantaire. Ce modèle nous a aussi
permis d’observer une diminution de la migration des neutrophiles dans la poche d’air suite
à une stimulation par L. major LV39 à 6h post stimulation. Ce défaut dans la migration des
neutrophiles dans les souris G3KO semblait cependant être dépendant du stimulus utilisé.
En effet, l’injection de LPS induisait une migration de neutrophiles équivalente pour les
souris G3KO et WT (Figure 19). Finalement, il semblait que l’injection de Gal-3
directement dans la poche d’air de souris WT était suffisante pour induire une migration de
neutrophiles dans la poche d’air des souris (Figure 20).
49
Figure 19: Recrutement cellulaire mesuré après 6h de stimulation lors d'une expérience de la poche d'air en
utilisant L. major LV39 ou le LPS comme stimulant.
Figure 20: Lors d'une expérience de la poche d'air, la seule injection de Gal-3 est suffisante pour induire un
recrutement significatif après 6h.
Résultats obtenus au cours de ce mémoire de maîtrise
Implication de la Gal-3 dans la réponse immunitaire contre les souches LV39
et Friedlin du parasite Leishmania major
Afin de mieux comprendre la réponse immunitaire innée engendrée par les souches
Friedlin et LV39 de L. major, le modèle de la poche d’air a été utilisé (Figure 21). À 6h
post stimulation, L. major LV39 induisait un recrutement de cellules immunitaires (1,6E6
c/ml; p=0,03) significativement supérieur à celui observé suite à l’injection de L. major
Friedlin (5,4E5 c/ml; p= 0,7) en comparaison avec le groupe contrôle injecté avec du PBS. Il
50
est aussi à noter que la majorité des cellules recrutées par l’injection de L. major LV39
étaient des neutrophiles (données non montrées). Ce recrutement cellulaire corrélait avec
la sécrétion de Gal-3 (détectée sous ça forme entière) dans la poche d’air mesurée par
western blot à 3h post stimulation (Figure 21). La densité moyenne des bandes obtenues
pour la stimulation avec L. major LV39 (32 000 pixels/bande) était supérieure aux
moyennes obtenues avec le PBS et L. major Friedlin (21 000 et 16 000 pixels/bande
respectivement; p < 0,05).
Figure 21: Comparaison des résultats obtenus lors d'une expérience de la poche d'air obtenus suite à l'injection de
L. major LV39 et L. major Friedlin.
A) Compte à l’hématimètre du nombre de cellules ayant migré dans la poche d’air après
6h.
B) Mesure par Western Blot de la Gal-3 libérée et non clivée (anticorps Mac-2) dans la
poche d’air après 3h.
Afin de tenter de trouver la provenance de cette Gal-3 sécrétée, des macrophages
(provenant de la différenciation de monocytes de moelle osseuse) et des fibroblastes (issues
de la poche d’air) ont été mis en culture et stimulés par l’addition de parasite. Les résultats
n’ont cependant pas été concluants, car aucune différence de sécrétion de Gal-3 n’a été
observée par la stimulation de ces deux types cellulaires (Figure 22).
51
Figure 22: Mesure, par Western blot, de la libération de Gal-3 de taille complète (anticorps Mac-2) par les
macrophages (A) et les fibroblastes (B) suite à une stimulation in vitro de 3h par le parasite Leishmania.
Clivage de la Gal-3 par les souches LV39 et Friedlin du parasite Leishmania
major
Afin de déterminer la capacité de L. major Friedlin et de L. major LV39 à cliver la Gal-3,
des essais in vitro ont été effectués. Un premier essai a été effectué dans des conditions
d’incubation sans sérum ou en ajoutant 10% de FBS (Figure 23).
10% FBS
Sans FBS
T
G3
Friedlin
LV39
G3
Friedlin
LV39
1h
2h
4h
Figure 23: Mesure, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L. major LV39 dans des
conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection de la forme non clivée de la Gal-3 avec l’anticorps Mac-2).
Il est possible de tirer deux conclusions principales suite à cette expérience. La première est
que L. major LV39 était plus efficace que L. major Friedlin pour cliver la Gal-3. La
seconde est que le FBS semblait ralentir la cinétique de clivage de la Gal-3 par L. major
LV39. En effet, en l’absence de FBS, la presque totalité de la Gal-3 était clivée dès la
première heure d’incubation tandis que, lorsque 10% de FBS est ajouté au mélange
réactionnel, un clivage équivalent n’était observé qu’après une incubation de 4h. Comme le
52
démontre la Figure 24, la Gal-3 était bel et bien clivée en des fragments de plus faible poids
moléculaire. Il est aussi à noter que le FBS ne semble pas contenir de Gal-3; du moins, s’il
en contient, les anticorps que nous utilisons ne sont pas capables de la détecter (Figure 25).
Figure 24: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major Friedlin et L. major LV39 dans des
conditions d'incubation avec ou sans sérum (détection du CRD de la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD).
Figure 25: Contrôles utilisés pour les expériences de clivage de la Gal-3.
A) Détection de la forme entière de la Gal-3 avec l’anticorps Mac-2.
B) Détection du CRD de la Gal-3 avec l’anticorps anti-CRD.
53
Afin de se rapprocher encore plus des conditions retrouvées in vivo, d’autres essais de
clivage ont été effectués in vitro, en utilisant des lavages de poches d’air murines comme
milieu d’incubation (Figures 26-27). Les lavages PBS représentent un milieu non inflammé
tandis que les lavages suite à une injection de LPS représentent un milieu inflammé
pouvant se rapprocher de celui obtenu lors de l’injection de L. major LV39 dans la poche
d’air. Il est donc possible d’observer que L. major LV39 pouvait cliver la Gal-3 dans ce
type de milieu d’incubation, mais que, similaire à ce qui a été observé par l’ajout de FBS,
le fait de procéder à l’expérience dans les lavages des poches d’air ayant été stimulées avec
du LPS semblait ralentir la cinétique de clivage de la Gal-3. En effet, après une heure
d’incubation, il restait une plus grande quantité de Gal-3 non clivée dans le milieu
d’incubation provenant des poches d’air stimulées au LPS que dans les poches d’air non
stimulées (PBS). Il est cependant à noter que l’effet inhibiteur observé pour les lavages
LPS (la totalité de la Gal-3 était clivée après 2h d’incubation) était inférieur à l’effet
inhibiteur de l’ajout de 10% sérum au milieu d’incubation (il restait encore une quantité
significative de Gal-3 après 2h d’incubation). La Figure 27 démontre bien le clivage de la
Gal-3 par les bandes de plus faible poids moléculaire visibles en employant l’anticorps
anti-CRD.
54
Figure 26: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un milieu d'incubation
constitué de lavages de poches d’air murines (détection de la forme entière de la Gal-3 avec l'anticorps Mac-2).
55
Figure 27: Détection, par Western blot, du clivage de la Gal-3 par L. major LV39 dans un milieu d'incubation
constitué de lavage de poches d’air murines (détection du CRD de la Gal-3 avec l'anticorps anti-CRD).
56
Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le
parasite Leishmania : Expérience de la poche d’air
Figure 28: Comptes à l'hémacimètre des leucocytes ayant migré dans la poche d'air suite à une stimulation de 6h.
Afin de tester l’effet des Gal-7 et Gal-9 lors d’une infection avec le parasite Leishmania
major, des souris KO pour ces galectines ont été utilisées. Après une stimulation d’une
durée de 6h, les poches ont été lavées et les cellules recueillies ont été dénombrées (Figure
28).
Comparaison des différentes stimulations sur une même lignée de souris
Il a précédemment été discuté des résultats obtenus pour les souris WT (pages 47-48), je ne
reviendrai donc pas sur ceux-ci dans cette section. Pour ce qui est des souris Gal-7 KO,
bien qu’il semble à première vue avoir une différence entre le groupe injecté avec du PBS
57
et les deux groupes injectés avec des parasites, cette différence ne s’était pas montrée
significative (PBS vs LV39, p = 0.207 et PBS vs Friedlin, p = 0.116). Les résultats obtenus
pour les souris Gal-9 KO n’étaient pas non plus significativement différents entre eux (PBS
vs LV39, p = 0.884 et PBS vs Friedlin, p = 0.263).
Comparaison des différentes lignées de souris pour une même stimulation
Les souris Gal-7 KO ont réagi différemment à la stimulation avec le parasite L. major
Friedlin (Figure 29). En effet, alors que L. major Friedlin n’a induit qu’un recrutement
cellulaire très faible (5.4x105 cellules/ml équivalent au 5.0 x105 cellules/ml du groupe PBS)
chez les souris WT, le recrutement induit chez les souris Gal-7 KO était significativement
supérieur (1.6 x106 cellules/ml, p = 0.029). Il est à noter que les recrutements cellulaires
induits par la stimulation PBS (p = 0.360) et par la stimulation LV39 (p = 0.875) étaient
équivalents pour les souris WT et Gal-7 KO.
Figure 29: Implication de la Gal-7 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air après une stimulation de
6h.
58
Les souris Gal-9 KO (Figure 30) ont eu une réaction assez similaire aux souris Gal-7 KO.
C’est aussi pour la stimulation faite avec le parasite L. major Friedlin qu’une différence
significative fut observée entre les souris WT et les souris Gal-9 KO. Le recrutement
cellulaire était plus important (p = 0.020) chez les souris Gal-9 KO (1.9 x106 cellules/ml)
comparé aux souris WT (5.4 x105 cellules/ml). Il est aussi à noter que la différence de
recrutement cellulaire visible entre les souris WT et Gal-9 KO pour les groupes PBS (p =
0.055) et LV39 (p = 0.431) n’était pas significative.
Figure 30: Implication de la Gal-9 dans la migration des leucocytes dans la poche d'air après une stimulation de
6h.
Implication de la Gal-7 et de la Gal-9 dans la réponse immunitaire contre le
parasite Leishmania : Expérience d’infection du coussinet plantaire
L’expérience d’infection du coussinet plantaire nous a permis de suivre la progression de la
maladie à travers les différentes étapes de celle-ci. Encore ici, l’emploi des souris Gal-7
KO et Gal-9 KO nous a permis d’évaluer l’effet de la perte de ces galectines sur le
59
développement à plus long terme de la maladie. Les mesures présentées dans ces
graphiques représentent la différence de volume entre la patte infectée et celle qui ne l’est
pas (les mesures ont été faites en millimètres).
À la fois pour les souris Gal-7 KO et Gal-9 KO et pour les parasites L. major Friedlin et L.
major LV39, aucune différence significative entre les lignées de souris KO n’a pu être
observée dans la première moitié de l’expérience qui représente la phase de croissance de
la lésion (semaines 1 à 4).
Souris Gal-7 KO
Les souris Gal-7 ont démontré une tendance à avoir une phase de guérison plus rapide lors
de l’infection avec le parasite L. major Friedlin. Cette tendance fut cependant mesurée de
manière significative uniquement à la semaine 9 où le volume moyen du coussinet
plantaire des souris WT était de 119.3mm3 comparé à 56.2mm3 pour les souris WT (p =
0.034). Du à la grande variation des mesures prises chez les souris Gal-7 KO pour les
semaines 7 et aucune autre différence significative n’a été mesurée pour cette expérience.
Aucune différence significative n’a non plus été obtenue par l’infection employant L.
major LV39 (Figure 31).
Figure 31: Implication de la Gal-7 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des souris infectées dans le
coussinet plantaire avec L. major Friedlin ou L. major LV39 (suivi hebdomadaire de la différence de volume entre
la patte infectée et la patte non-infectée, en mm3).
60
Souris Gal-9 KO
Globalement, les souris Gal-9 KO ont réagi de manière similaire aux souris WT. Pour
l’infection utilisant le parasite L. major Friedlin, aucune différence significative n’a été
mesurée entre les souris Gal-9 KO et les souris WT au cours des 12 semaines d’expérience.
L’emploi du parasite L. major LV39 a cependant révélé des différences significatives pour
les semaines 7 (p= 0.035) et 9 (p = 0.043) où les pattes des souris WT étaient plus
inflammées que celles des souris Gal-9 KO. Chez les souris WT, les différences de
volumes entre les pattes infectées et non-infectées étaient de 98.3mm3 et de 90.7mm3 pour
les semaines 7 et 9, respectivement. Les pattes des souris Gal-9 KO avaient quant à elles
des différences de volume de 56.6mm3 et de 48.5mm3 pour ces deux mêmes semaines
(Figure 32).
Figure 32: Implication de la Gal-9 lors du suivi de la réponse inflammatoire locale des souris infectées dans le
coussinet plantaire avec L. major Friedlin et L. major LV39 (suivi hebdomadaire de la différence de volume entre
la patte infectée et la patte non-infectée, en mm3).
61
Discussion
Implication de la Gal-3 dans le recrutement de neutrophiles lors d’infections
avec le parasite L. major LV39.
Les conclusions obtenues à propos de la Gal-3 lors de cette étude impliquant le parasite L.
major LV39 s’apparentent à celles précédemment obtenues au laboratoire lors de l’étude de
la pneumonie causée par Streptococcus pneumoniae. Les résultats obtenus pour le modèle
de poche d’air ont démontré un déficit de recrutement de neutrophiles dans les souris Gal-3
KO lors d’une stimulation avec L. major LV39. Ce déficit du recrutement cellulaire a été
dépendant du stimulant utilisé, car l’injection de LPS dans la poche d’air a occasionné un
recrutement cellulaire similaire dans les souris WT et Gal-3 KO. Un résultat semblable
avait en effet été obtenu avec le modèle de pneumonie où le recrutement de neutrophiles
dans les poumons était grandement diminué chez les souris Gal-3 KO lors d’une infection
avec S. pneumoniae. Le recrutement de neutrophiles était cependant similaire pour les
souris Gal-3 KO et WT lors d’une infection avec. E. coli (Nieminen et al. 2008). Il est aussi
à noter que seule la souche LV39 de L. major a été en mesure d’induite un recrutement de
cellulaire lors de l’expérience de la poche d’air. L’injection du parasite L. major Friedlin a
induit un faible recrutement cellulaire qui est semblable à celui qui a été induit par
l’injection de PBS ; correspondant donc à un niveau de base. Bien que les deux souches de
parasite induisent des manifestations cliniques similaires (ces parasites causant la forme
cutanée de la leishmaniose), il a bien semblé y avoir une différence entre la réponse
immunitaire innée engendrée par ces deux souches de parasites. Comme cette différence
réactionnelle de l’hôte est survenue assez rapidement (dans les premières heures suivant
l’infection), il est possible de croire que des variations au niveau des molécules présentes à
la surface de ces deux souches de parasite puissent expliquer cette différence. Il a
récemment été publié que le LPG présent à la surface des souches LV39 et Friedlin de L.
major est différent (Dobson et al. 2010). D’un point de vue général, les chaines latérales du
LPG de L. major (toutes les souches) possèdent des répétitions de Galβ1-3 alors que celles
de L. donovani n’en possèdent pas. Il y a cependant une différence au niveau du nombre de
répétitions de Galβ1-3 présentes sur les chaines latérales du LPG de L. major LV39 lorsque
62
comparé au nombre présent sur le LPG de L. major Friedlin (Figure 33). En effet, plus de
75% du LPG de L. major Friedlin possède aucune ou une seule répétition de Galβ1-3 sur
les chaines latérales de son LPG. Celui de L. major LV39, possède par contre un nombre
de répétitions beaucoup plus élevé; où plus de 75% des chaines latérales possèdent au
moins 2 répétitions de Galβ1-3.
Figure 33: Illustration du pourcentage de LPG comportant le nombre de répétitions de Galβ1-3 spécifié sus ses
chaines latérales.
En possédant un plus grand nombre de répétitions de Galβ1-3, le LPG de L. major LV39
offre un ligand de plus grande avidité à la Gal-3 (Pelletier et al. 2003). Celle-ci à donc la
possibilité s’oligomériser et de former un plus grand nombre de liens avec le LPG de L.
major LV39 qu’avec le LPG de L. major Friedlin. En théorie, cela lui permet de pouvoir
exercer ses effets physiologiques de manière plus efficace. Finalement, le fait que la Gal-3
soit en mesure de lier les parasites L. major pourrait lui attribuer le qualificatif de récepteur
des PAMPs. Les conséquences physiologiques de cette reconnaissance n’ont pour le
moment pas encore été mises en évidence. En lien avec ce dernier point, des essais réalisés
dans notre laboratoire n’ont pas été en mesure de mettre en évidence de défaut dans la
capacité des macrophages et neutrophiles Gal-3 KO à phagocyter les parasites.
63
Libération de Gal-3 dans la poche d’air lors de stimulations avec L. major
LV39
Le recrutement de neutrophiles qui a été mesuré à 6h post stimulation dans la poche d’air
stimulée avec le parasite L. major LV39 corrèle bien avec la détection de Gal-3 libérée
dans la poche d’air à 3h post stimulation. En effet, la mesure de la Gal-3 de taille complète
dans les lavages de poche d’air a indiqué qu’il y a une augmentation d’environ 50% de la
Gal-3 sécrétée détectée dans les poches d’air stimulées avec L. major LV39, lorsque
comparé avec les poches d’air stimulées avec L. major Friedlin ou avec le PBS. Encore ici,
ces résultats s’apparentent à ceux précédemment obtenus au laboratoire dans le modèle de
pneumonie à pneumocoque où le niveau de Gal-3 retrouvée dans les lavages bronchoalvéolaires des souris infectées avec S. pneumoniae étaient supérieurs aux niveaux
retrouvés chez les souris infectées avec E. coli ou traités au PBS (S. Sato et al. 2002).
Comme il a précédemment été démontré que la Gal-3 pouvait lier à la fois les cellules
endothéliales et les neutrophiles afin de faciliter la migration de ces derniers (Nieminen et
al. 2007), il est possible de penser que la Gal-3 relâchée pourrait avoir le même effet dans
le cas d’infection avec le parasite L. major LV39. Le fait d’avoir une quantité plus
importante de Gal-3 de libérée dans le milieu extracellulaire pourrait donc expliquer le
nombre plus élevé de neutrophiles retrouvés dans les poches d’air stimulées avec L. major
LV39. Il est aussi possible d’élargir ces résultats à l’expérience d’infection du coussinet
plantaire effectuée chez les souris Gal-3 KO et WT. Lors de cette expérience, les niveaux
d’inflammation des coussinets plantaires des souris Gal-3 KO étaient supérieurs aux
niveaux mesurés chez les souris WT suite à l’infection avec le parasite L. major LV39. Les
niveaux de neutrophiles ayant migré à la fois vers le coussinet plantaire et vers les nœuds
lymphatiques drainant cette région étaient aussi inférieurs chez les souris Gal-3 KO ;
laissant penser que, tout comme dans la poche d’air et dans le modèle de pneumonie, la
Gal-3 a un rôle à jouer dans le recrutement de neutrophiles au coussinet plantaire des souris
infectées avec L. major LV39. Dans le cas des souris Gal-3 KO, l’absence de Gal-3
engendre un niveau d’inflammation supérieur qui corrèle avec un nombre de neutrophiles
inférieur ainsi qu’avec une charge parasitaire supérieure dans ces souris. Cette expérience
montre du même coup l’implication des neutrophiles dans l’éradication des parasites. Les
64
niveaux de Gal-3 extracellulaires n’ont cependant pas été mesurés dans les coussinets
plantaires ou dans les nœuds lymphatiques des souris WT infectés ou non infectés (pour
voir si, comme dans le cas de la pneumonie à S. pneumoniae, l’infection avec L. major
provoque une libération de Gal-3 similaire à ce qui a été observé dans l’expérience de la
poche d’air). Cette mesure serait cependant difficilement réalisable. Il ne serait pas
pertinent de procéder par une homogénéisation des tissus, car cela occasionnerait un bris
cellulaire; entrainant ainsi la libération de la Gal-3 initialement contenue à l’intérieur des
cellules. Cela fausserait nos données, car nous ne voulons mesurer que la Gal-3
extracellulaire ; soit celle qui peut potentiellement jouer un rôle dans la réponse
immunitaire. Des études histologiques pourraient cependant être effectuées. Il serait alors
possible d’effectuer un marquage de la Gal-3 et il suffirait alors d’identifier et de compiler
uniquement la Gal-3 se retrouvant dans le milieu extracellulaire. Reste cependant à voir la
faisabilité de cette technique de marquage.
Il est aussi à noter que la présence de Gal-3 extracellulaire est à elle seule suffisante
pour induire un recrutement de neutrophiles. Des expériences menées au sein de notre
laboratoire ont en effet démontré un pouvoir pro-inflammatoire à la Gal-3 qui pourrait alors
être considérée comme un DMAP (Milot et al., en préparation). Bien que la Gal-3 ne soit
pas chimioattractante in vitro (Nieminen et al. 2008), son injection dans la poche d’air des
souris est suffisante pour induire un recrutement de neutrophiles significatif à 6h post
stimulation. Ce pouvoir pro-inflammatoire semble provenir de la capacité de la Gal-3 à
induire la sécrétion de certaines cytokines et chimiokines.
Afin de tenter de déterminer la provenance de cette Gal-3 libérée dans la poche d’air lors
de la stimulation avec L. major LV39, des macrophages obtenus suite à la différenciation
des monocytes de la moelle osseuse ainsi que des fibroblastes obtenus par extraction des
cellules tapissant l’intérieur de la poche d’air des souris ont été mis en culture et stimulés
par l’ajout de parasites. Les résultats obtenus n’ont cependant pas démontré de différences
notables entre l’ensemble des stimulations effectuées (PBS, L. major Friedlin, L. major
LV39). Deux théories peuvent être apportées pour expliquer ces résultats non représentatifs
de ce qui a été obtenu in vivo. Il est premièrement possible que nous n’ayons pas testé les
cellules qui sont véritablement responsables des différences de libération de Gal-3 dans la
65
poche d’air. La Gal-3 a en effet aussi été identifiée comme étant produite chez d’autres
cellules de la peau, comme les kératinocytes (Konstantinov et al. 1994) et les cellules de
Langerhans (Wollenberg & Salle 1993). Il est aussi possible que les conditions reproduites
in vitro ne soient pas adéquates pour observer les mêmes différences obtenues in vivo. Les
cellules utilisées in vitro ne possèdent pas non plus les mêmes caractéristiques que celles
retrouvées in vivo; entre autres par rapport à leur niveau d’activation et de maturation.
L. major LV39 et L. major Friedlin peuvent cliver la Gal -3, mais la cinétique
de clivage est ralentie dans des conditions se rapprochant de ce qui est
rencontré in vivo.
Les études préalablement publiées par notre laboratoire ont démontré la capacité des
neutrophiles (Nieminen et al. 2005) ainsi que des parasites Leishmania (Pelletier & S. Sato
2002) à cliver la Gal-3 et cela de manière assez rapide ; soit en une trentaine de minutes.
Cela m’a donc porté à me questionner à savoir pourquoi des quantités significatives de Gal3 de taille complète étaient toujours détectables dans les lavages de poche d’air où sont
présents des neutrophiles ainsi que des parasites. La première expérience effectuée afin de
répondre à ce questionnement a été de procéder à des tests de clivage de la Gal-3 dans un
milieu d’incubation contenant du FBS afin de se rapprocher quelque peu les conditions
retrouvées in vivo dans la poche d’air ou dans le coussinet plantaire des souris (les
expériences de clivage des articles préalablement mentionnés ayant été effectuées dans un
milieu sans sérum). Suite à l’incubation permettant le clivage de la Gal-3, l’anticorps Mac2, détectant la forme entière de la Gal-3, a été utilisé et les résultats obtenus ont démontré
que la présence de FBS dans le milieu d’incubation avait comme effet de ralentir la
cinétique de clivage de la Gal-3. Cela était visible par le fait que la vitesse de disparition de
la Gal-3 de taille complète était ralentie en présence de FBS. En effet, alors que la grande
majorité de la Gal-3 était clivée après seulement une heure dans le cas d’une incubation
sans FBS, un niveau de clivage équivalent n’est survenu qu’entre 2h et 4h d’incubation
lorsque la réaction s’est faite en présence de FBS. Cette expérience a aussi montré la
capacité accrue de L. major LV39 à cliver la Gal-3 lorsque comparé à L. major Friedlin ; ce
dernier résultat étant en accord avec la publication de I. Pelletier et S. Sato en 2002. Bien
66
que L. major LV39 et L. major Friedlin possèdent tous deux des GP63 fonctionnelles, deux
explications pourraient être amenées pour expliquer le clivage moindre observé dans le cas
de la souche Friedlin. L’explication la plus simple serait le fait que l’activité enzymatique
de la GP63, l’enzyme responsable du clivage de la Gal-3, de L. major LV39 soit plus
élevée que celle de L. major Friedlin. Une autre explication possible a déjà été mentionnée
précédemment et pourrait encore s’appliquer ici : soit le fait que la Gal-3 pourrait avoir une
plus grande affinité pour le LPG de L. major LV39 que pour celui de L. major Friedlin.
Cela influencerait le clivage de la Gal-3, car, pour être clivée, la Gal-3 doit d’abord se lier
au parasite (Figure 34).
Figure 34: Schématisation du lien de la Gal-3 au LPG de L. major, puis de son clivage par la GP63 du parasite.
En utilisant les mêmes échantillons, un second Western blot a été réalisé en employant un
anticorps différent qui reconnait le CRD de la Gal-3 ; permettant ainsi de visualiser les
formes de Gal-3 de plus faible poids moléculaire, dont la partie N-terminale a été clivée,
partiellement ou totalement (Figure 35). Cela nous a permis de confirmer, par la présence
de bandes de plus faible poids moléculaire que le clivage de la Gal-3 a bien eu lieu pour les
deux espèces de parasites en l’absence en en présence de FBS. Cela confirme aussi, par la
présence d’une bande d’une taille moléculaire de 15 kDa l’efficacité accrue de clivage de
L. major LV39 comparé à L. major Friedlin qui n’est pas en mesure de produire une telle
bande.
67
Figure 35: Schématisation du clivage de la Gal-3 par L. major puis de la taille des bandes détectées par Western
blot en employant l'anticorps anti-CRD.
Afin de se rapprocher un peu plus des conditions retrouvées in vivo, des essais de clivage
ont ensuite été réalisés en incubant la Gal-3 et les parasites dans des échantillons de lavages
de poche d’air. Le but de ces essais était de voir si L. major LV39 était en mesure de cliver
la Gal-3 dans un environnement se rapprochant de celui de la poche d’air. Pour cela, deux
conditions ont été employées. La première a été réalisée en utilisant des lavages de poches
d’air de souris WT n’ayant reçu aucun stimulus et représente une condition non
inflammatoire. Dans cette condition, la Gal-3 recombinante qui a été ajoutée au lavage était
complètement clivée après seulement une heure d’incubation. Cela semble logique, car ce
lavage de la poche d’air n’est pas supposé être riche en protéines ou en molécules
sécrétées, le milieu d’incubation pourrait donc se rapprocher du PBS seul là où, comme
observé précédemment, la Gal-3 est facilement clivée par L. major LV39. La seconde
condition d’incubation provient du lavage de poche d’air de souris Gal-3 KO ayant été
stimulées avec du LPS pour 6h. C’est afin d’éviter d’avoir de la Gal-3 endogène sécrétée
dans la poche d’air que des souris Ga-3 KO ont été utilisées. Aussi, comme le but de cette
condition était de recueillir un lavage représentant des conditions inflammatoires, le LPS a
été utilisé comme stimulant au lieu des parasites, car ceux-ci n’induisent pas de
recrutement cellulaire chez les souris Gal-3 KO. Les résultats de clivage obtenus dans cette
condition ont démontré deux choses. Premièrement, qu’il était possible pour le parasite L.
major LV39 de cliver la Gal-3 dans cette condition inflammatoire. Cela est visible par la
disparition de la bande située à 35kDa représentant la Gal-3 de taille native (visible à l’aide
de l’anticorps Mac-2) ainsi que par l’apparition de bandes de plus faible poids moléculaire
(visibles à l’aide de l’anticorps anti-CRD) représentant la Gal-3 clivée. Deuxièmement, il
est possible de constater que l’incubation effectuée dans les lavages de poches d’air
68
stimulées au LPS a ralentie la cinétique de clivage de la Gal-3. Dans cette condition, un
clivage total de la Gal-3 a été observé dès la deuxième heure d’incubation. Le
ralentissement de la cinétique de clivage observé lors de l’incubation dans les lavages de
poches d’air stimulées au LPS donc était inférieur au ralentissement observé lorsque
l’incubation se fait en présence de 10% FBS ; condition dans laquelle une quantité
significative de Gal-3 non clivée a subsisté après 2h d’incubation.
Le fait que L. major LV39 était en mesure de cliver la Gal-3 en deux heures ou moins vient
renforcer la mesure selon laquelle L. major LV39 induirait une libération de Gal-3
significativement plus importante que L. major Friedlin ou que le contrôle PBS à 3h post
stimulation dans l’expérience de poche d’air préalablement présentée dans ce mémoire.
Cela veut en effet dire que la quantité de Gal-3 mesurée à l’aide de l’anticorps Mac-2 dans
la condition L. major LV39 est sous-estimée par rapport aux deux autres du fait que la Gal3 libérée est rapidement clivée par les parasites et, probablement aussi par les neutrophiles
présents en plus grand nombre dans les poches d’air de ce groupe expérimental.
La Gal-7 inhibe le recrutement cellulaire induit lors de la stimulation avec L.
major Friedlin
La Gal-7 est entre autres localisée dans les cellules de l’épithélium stratifié,
particulièrement dans l’épiderme. Elle est contenue à l’intérieur des kératinocytes, mais il
est connu qu’elle est aussi retrouvée liée à la membrane cellulaire des cellules de
Langerhans (Wollenberg & Salle 1993). Elle est aussi connue comme étant associée au
contrôle de l’homéostasie de l’épithélium en modulant l’apoptose, la prolifération ainsi que
la migration des kératinocytes suite à une blessure (Gendronneau & Sidhu 2008). Au
moment d’écrire ces lignes, aucune donnée n’est publiée quant aux rôles possibles de la
Gal-7 lors d’infections avec le parasite Leishmania. Comme L. major cause une maladie
touchant la peau, cela nous a mené à nous interroger sur les rôles potentiels de la Gal-7 lors
de cette infection.
Une expérience de poche d’air a premièrement été réalisée afin d’évaluer la réponse
immunitaire innée des souris Gal-7 KO lors d’une stimulation avec le parasite Leishmania.
69
Les souris Gal-7 KO ont réagi de la même façon que les souris WT lors de la stimulation
avec L. major LV39 ainsi que pour le contrôle non stimulé (PBS). C’est cependant lors de
la stimulation avec L. major Friedlin qu’une différence significative a pu être observée.
L’absence de la Gal-7 a comme effet d’induire un recrutement cellulaire similaire à celui
observé lors de l’injection de L. major LV39. Cela voudrait donc dire que la présence de
Gal-7 aurait un effet inhibiteur sur le recrutement de neutrophiles lors de la stimulation
avec L. major Friedlin. Comme mentionné précédemment, la Gal-7 peut avoir des effets
immunorégulatoires; par exemple, en induisant l’apoptose des kératinocytes par la
stabilisation de la molécule P53 lors de dommages provoqués à l’épithélium (Bernerd et al.
1999). La leishmaniose a aussi un impact sur l’apoptose des kératinocytes (I. Becker 2003)
(Eidsmo et al. 2005). Les kératinocytes sont connus comme des acteurs clefs dans la
réponse immunitaire innée cutanée (Nestle et al. 2009); entre autres par le fait qu’ils ont
des PRRs à leur surface (dont le TLR-2 qui est en mesure de reconnaître le LPG de L.
major MHOM/SU/73/5-ASKH) et qu’ils sont en mesure de sécréter des cytokines (Pivarcsi
et al. 2004). Il est aussi connu que les kératinocytes sont en mesure de produire des
cytokines de type Th1 qui ont un rôle favorable dans la cure de la maladie (Ehrchen et al.
2010).
En combinant toutes ces données, l’hypothèse qu’il serait possible d’amener est
que, seul L. major Friedlin serait en mesure d’induire la synthèse de Gal-7 dans les
kératinocytes. Chez les souris WT, cette Gal-7 induirait l’apoptose de ces kératinocytes qui
ne seraient alors plus en mesure de participer à la réponse immunitaire de manière active;
d’où le faible nombre de neutrophiles retrouvés dans la poche d’air de ces souris. Il est
cependant à noter que les études mentionnées ci haut n’utilisaient pas la même souche de
parasite que celle que j’ai utilisé ; la souche utilisée était la souche L. major
MHOM/IL/81/FE/BNI. Il est aussi à noter que le rôle possible de la Gal-7 sur les
neutrophiles reste inconnu.
Afin de vérifier cette hypothèse, il serait intéressant de vérifier l’effet des parasites
L. major LV39 et L. major Friedlin sur la synthèse de Gal-7 in vitro et aussi vérifier les
niveaux d’apoptose suite à ces stimulations. La comparaison des niveaux d’apoptose de
kératinocytes provenant de souris WT avec ceux provenant de souris Gal-7 KO serait aussi
une proposition intéressante.
70
Les souris Gal-7 KO ont une phase de guérison plus rapide que les souris WT
lors de l’infection du coussinet plantaire avec L. major Friedlin
Comme mentionné précédemment, la Gal-7 est associée à l’homéostasie de l’épithélium.
Lors de l’expérience d’infection du coussinet plantaire effectuée avec L. major Friedlin, les
souris Gal-7 KO ont semblé avoir une réaction plus favorable à l’infection, atteignant un
pic d’inflammation inférieur et ayant une diminution de l’inflammation graduelle débutant
plus tôt.
Peu de données sont cependant disponibles pour le moment quant aux rôles
possibles de la Gal-7 lors d’infections. Une étude pouvant se rapprocher de la nôtre a été
réalisée en provoquant deux types de blessures chez les souris ; soit par irradiation UVB
d’une section du dos des souris ou soit en effectuant une lésion physique sur la queue des
souris. Les auteurs de cette étude ont employé des souris Gal-7 KO qui ont premièrement
réagi en ayant une réépithélisation réduite comparée aux souris WT. Ils attribuent cette
réaction à une réduction de la migration des kératinocytes vers la blessure. Une fois la plaie
refermée, les souris Gal-7 KO ont par contre démontré une augmentation de la prolifération
des kératinocytes (Gendronneau & Sidhu 2008). Il faut cependant se questionner sur ce
dernier résultat à savoir s’il est vraiment lié à l’absence de la Gal-7 ou s’il est plutôt obtenu
en réponse de la migration réduite des kératinocytes préalablement observée. Selon cette
étude, la Gal-7 a donc un rôle à jouer dans la réparation de la peau suite à une blessure.
Comme l’infection du coussinet plantaire produit une blessure évidente au niveau de la
peau, nous avons choisi de tester notre modèle d’infection expérimentale avec le parasite
Leishmania sur les souris Gal-7 KO que nous avons au laboratoire. L’effet de la Gal-7 que
nous avons observé lors de cette expérience est cependant variable selon le stimulus utilisé.
En effet, la courbe d’inflammation mesurée chez les souris Gal-7 KO était similaire à celle
mesurée chez les souris WT dans le cas de l’infection avec L. major LV39 alors que celles
infectées avec L. major Friedlin ont réagi en ayant une guérison accélérée comparée aux
souris WT. Deux hypothèses peuvent être amenées pour expliquer ces résultats. La
première est que la Gal-7 est impliquée dans la réponse immunitaire impliquant
uniquement le parasite L. major Friedlin. Il serait par exemple possible que le nombre de
71
parasites présents au site d’infection au cours des semaines soit inférieur pour les souris
Gal-7 KO. Des différences au niveau des cellules immunitaires présentes au site d’infection
pourraient aussi expliquer cette différence d’inflammation. Il serait alors intéressant de
procéder à nouveau à une expérience de ce genre, afin : 1) de voir si ces résultats sont
reproductibles, 2) de procéder à des sacrifices périodiques afin de mesurer différents
paramètres immunologiques comme la charge parasitaire ainsi que les cellules
immunitaires présentes au site d’infection et 3) de mesurer l’état de prolifération et
d’apoptose des kératinocytes présents dans la région du coussinet plantaire. La seconde
hypothèse s’apparente plus à ce qui a été observé lors des expériences effectuées par
Gendronneau & S. Sidhu et impliquerait une réponse immunitaire semblable pour les
souris Gal-7 KO et WT, mais une régénération plus rapide d’un épithélium sain suite au
travail fait par les cellules immunitaires pour se débarrasser des parasites. Des coupes
histologiques ainsi que des analyses du niveau d’activation et de prolifération des
kératinocytes seraient pertinentes à effectuer afin de valider cette hypothèse.
La Gal-9 a un effet inhibiteur sur le recrutement cellulaire lors d’infection
avec le parasite L. major Friedlin.
La Gal-9 a été identifiée comme étant un ligand de Tim-3, molécule présente à la surface
des lymphocytes Th1. Le lien de la Gal-9 à Tim-3 mène à la mort cellulaire ; à la fois par
apoptose et par nécrose (Zhu et al. 2005). Il a aussi été démontré que des polymorphismes
présents dans la molécule Tim-3 pouvaient donner lieu à des maladies auto-immunes
comme l’asthme (McIntire et al. 2001) et l’arthrite rhumatoïde (Chae et al. 2004). Bien que
ce ne soit qu’une tendance non statistiquement significative, nos résultats tendent à
confirmer un niveau d’activation basal du système immunitaire plus élevé chez les souris
Gal-9 KO que chez les souris WT. En effet, lors de l’expérience de la poche d’air, le
groupe Gal-9 KO contrôle dans lequel seul du PBS a été injecté a semblé réagir plus
fortement que le groupe composé des souris WT (bien que ce ne soit qu’une tendance). En
ce qui à trait aux parasites Leishmania, un article publié précédemment par notre
laboratoire a démontré que la Gal-9 était en mesure de lier le LPG de L. major LV39 et
Friedlin. Vu le nombre plus important de répétitions de Galβ1-3 composant les chaines
72
latérales du LPG de L. major LV39, la Gal-9 possède une plus grande affinité pour ce LPG
lorsque comparé au LPG de L. major Friedlin (Pelletier et al. 2003) Aussi, comme il n’y a
pas de différences significatives entre le recrutement cellulaire mesuré chez les souris Gal9 KO injectées avec du PBS ou avec les parasites L. major LV39 ou Friedlin, il faut
considérer le recrutement cellulaire observé pour tous les groupes comme étant simplement
équivalent au niveau basal de recrutement. La Gal-9 n’a donc pas été impliquée dans le
recrutement cellulaire obtenu avec la stimulation par l’un ou l’autre des parasites.
Cependant, des analyses en cytométrie de flux effectuées sur le sang de souris Gal-9 KO
naïves ont cependant démontré que leur nombre de neutrophiles circulant dans le sang était
normal, mais que leur nombre de lymphocytes T circulatoires était supérieur à celui des
souris WT (ce qui est en accord avec le rôle pro-apoptotique de la Gal-3 sur les
lymphocytes T). Comme l’expérience de la poche d’air se déroule sur une semaine (à partir
du premier gonflement de la poche d’air jusqu’au sacrifice des souris) il n’est pas
impossible que les souris Gal-9 KO développent une certaine réaction immunitaire en
réaction stress causé par le gonflement de la poche d’air sur leur dos pouvant être médiée
par l’abondance de lymphocytes T. Cette réaction immunitaire pourrait ainsi engendrer un
recrutement de neutrophiles dans la poche d’air plus élevé que pour les souris WT et ce,
peu importe la stimulation. Lors de cette expérience, seul un temps de stimulation de 6h a
été effectué, car c’est habituellement le moment où le recrutement cellulaire est le plus
important. Il serait cependant intéressant de vérifier les concentrations de cytokines et de
chimiokines dans la poche d’air aux temps aux temps 1h et 3h post-stimulation, moments
ou leurs concentrations sont habituellement les plus élevées. Une vérification au temps 0h
pourrait aussi être effectuée pour vérifier le niveau d’activation pré-stimulation, due aux
manipulations effectuées durant la semaine précédant cette journée.
L’infection du coussinet plantaire avec L. major ne diffère que très peu d’un
point de vue global entre les souris Gal -9 KO et les souris WT
Même si une tendance semble être observable, aucune différence significative n’a été
observée entre les souris Gal-9 KO et les souris WT lors de l’expérience d’infection du
73
coussinet plantaire en utilisant le parasite L. major Friedlin. Les mesures prises aux
semaines 7 et 9 se sont cependant avérées inférieures pour les souris Gal-9 KO lors de
l’infection avec le parasite L. major LV39. Bien que ces deux mesures prises chez les
souris Gal-9 KO ont été différentes de celles prises chez les souris WT, l’allure globale de
la courbe obtenue pour ces deux groupes fut assez semblable. Les phases de progression
(semaines 1 à 4) et de guérison (semaines 10 à 12) furent en effet quasiment identiques
pour les souris Gal-9 KO et WT. Le pic d’inflammation obtenu entre les semaines 5 et 7
s’est aussi situé à une intensité similaire pour les deux groupes de souris testés. Il semble
donc délicat de dégager une conclusion claire à propos du comportement des souris Gal-9
KO lors de l’infection du coussinet plantaire avec L. major LV39 ou avec L. major
Friedlin. En effet, si la Gal-9 a un effet clair sur le développement de la leishmaniose
cutanée, notre modèle d’étude n’a pas été en mesure de le mettre en évidence.
74
Conclusion
Cette étude a permis de confirmer que la Gal-3 a un rôle lors de l’infection avec le parasite
Leishmania major LV39 et de préciser certains aspects mécanistiques. Le LPG de ce
parasite possède de longues chaines latérales composées de répétitions de Galβ1-3 qui sont,
en plus des autres protéophosphoglycans, un ligand pour la Gal-3. En plus de pouvoir lier
les parasites de l’espèce L. major, la Gal-3 est aussi en mesure de lier les cellules
endothéliales ainsi que les neutrophiles; étant ainsi impliquée dans le recrutement de ces
derniers. Cela pourrait être la raison expliquant que l’absence de Gal-3 a un impact négatif
sur le recrutement de neutrophiles lors d’infection ou de stimulation avec L. major LV39.
Même si elle peut aussi lier L. major Friedlin, la Gal-3 ne semble pas avoir de rôle critique
à jouer lors d’infections avec cette souche de parasite. Un mécanisme de rétro-inhibition
entrainant le clivage de la Gal-3 est aussi présent chez les deux souches, mais LV39 est
plus efficace à effectuer cette réaction. La cinétique de clivage est cependant réduite en
conditions inflammatoires et ce, pour les deux souches de parasites; permettant ainsi à la
Gal-3 libérée lors de l’infection de pouvoir exercer ces différents rôles.
Des études menées parallèlement dans notre laboratoire tendent à montrer que la Gal-3
pourrait être considérée comme un DAMP. Cette étude tend dans la même direction, car la
Gal-3 est libérée lors de stimulations avec L. major LV39 et cela corrèle avec le
recrutement de neutrophiles. La Gal-3 pourrait aussi être considérée comme un PAMP car
elle est en mesure de reconnaitre L. major. Toutefois, les rôles liés à cette reconnaissance
restent pour le moment inconnus.
Les rôles de la Gal-7 et de la Gal-9 ont aussi été vérifiés lors d’infections expérimentales
murines. Alors qu’aucun rôle évident n’a pu être attribué à la Gal-9, la Gal-7 semble
démontrer une implication lors de la phase de guérison; ce qui est conséquent avec ce qui a
précédemment été décrit dans la littérature.
75
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