Stratégies de modification d`une voie de signalisation

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O.Lascols / Oct 2006
Strat
Straté égie d gie d’é ’étude tude
des voies de signalisation
des voies de signalisation
Olivier Lascols
Olivier Lascols
Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie
Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie
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O.Lascols / Oct 2006
I.
I. Caract Caracté érisation d risation d’ ’une voie une voie
de transduction d
de transduction d’ ’un signal un signal
Exemple du Signal
Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’EGF de l’EGF
1. Quel récepteur ?
1. Quel récepteur ?
2.
2. Quels relais intracellulaires ? Quels relais intracellulaires ?
3
3. . Spécificité de ces relais intracellulaires ? Spécificité de ces relais intracellulaires ?
1. Interactions et transducteurs
1. Interactions et transducteurs
2.
2. Pléïotropie Pléïotropie d’un signal d’un signal
3
3. . Intégration de signaux par la cellule Intégration de signaux par la cellule
II. Le r
II. Le ré éseau de la signalisation cellulaire seau de la signalisation cellulaire

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O.Lascols / Oct 2006
?
La transduction des signaux: g
La transduction des signaux: gé én né éralit ralité és s
¾
¾Début des années 1980 Début des années 1980
membrane R
ligand
Cibles cellulaires
Système d’amplification
Système d’amplification
arrivée du signal
transduction par récepteur
émission intracellulaire
du signal
•quels seconds messagers ?
•quels relais ?
effets biologiques
effets biologiques
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La transduction des signaux aujourd
La transduction des signaux aujourd’ ’hui hui
R
ligand 2
NOYAU
R
ligand 3
Transports
Métabolisme
Etablissement de réseaux
complexes par les progrès
en biologie cellulaire et
moléculaire :
Directe : ligand 1
Modèles cellulaires :
•Modification
d’expression de
protéines
•Mutagénèse
dirigée
Modèles animaux :
•Souris Knock-out
•Souris Knock-in
ligand 1
R
Stratégie de signalisation :
Clonage de gènes
Indirecte:
ligand 2 ou 3

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O.Lascols / Oct 2006
I.
I. Caract Caracté érisation d risation d’ ’une voie une voie
de transduction d
de transduction d’ ’un signal un signal
Exemple du Signal
Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’ de l’EGF EGF ( (Epidermal Epidermal Growth Growth Factor Factor) )
1. Quel récepteur ?
1. Quel récepteur ?
Méthodologie d’étude des récepteurs
Méthodologie d’étude des récepteurs
localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/
localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonction fonction
2.
2. Quels relais intracellulaires ? Quels relais intracellulaires ?
a. Méthodes d’étude
a. Méthodes d’étude
test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation
b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF
b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF
3
3. . Spécificité de ces relais intracellulaires ? Spécificité de ces relais intracellulaires ?
a. Méthodes d’étude
a. Méthodes d’étude
inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens,
inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèse transgénèse
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps
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O.Lascols / Oct 2006
M
Mé éthodologie d thodologie d’é ’étude des r tude des ré écepteurs cepteurs
ETAPE
ETAPE MATERIEL MATERIEL METHODES METHODES RESULTATS RESULTATS
Localisation . tissus . Test de liaison
. cellules -autoradiographie
- microscopie prolifération
électronique différenciation
. Effets biologiques apoptose …
Localisation .membranes . fractionnement
Cellulaire . cytosol subcellulaire capacité
. test de liaison spécificité
Sélection . récepteurs . chromatographie
purifiés d’affinité (Ab, ligand)
. test de liaison
Clonage . ADNc . Criblage de banque . Séquence protéique
. Domaines spécialisés
. Expression du récepteur cystéine
transmb
TK
tyrosines
Caractérisation protéines . solubilisation . Structure . Activité
solubilisées . test de liaison nature, taille enzyme…
. électrophorèse
. immunoprécipitation
. test d’activité
Structure / . récepteurs . Mutagénèse dirigée . Mode de transduction
Fonction mutés . transfection
. cellules

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Interaction Ligand
Interaction Ligand• •R Ré écepteur cepteur
¾Réversible
¾Saturable : nombre de site récepteur défini = Ro
L + R LR
*L + R *LR
fixation spécifique
LR
¾Spécificité
*L : ligand radioactif
*L + R + X *LR + *LX
*L + L + X *LX + LX
L : excès de ligand « froid »
fixation totale
totale
spécifique
fixation non spécifique
non spécifique
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O.Lascols / Oct 2006
Etude de la structure du r
Etude de la structure du ré écepteur cepteur
¾Structure fixant l’EGF
•liaison de 125I-EGF
125I-EGF + R 125I-EGF/R
•pontage covalent
125I-EGF + R 125I-EGF/R
DSS
•électrophorèse en SDS
•autoradiographie
¾Identification par Western blot

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Western Blot
Western Blot
protéines
1. Electrophorèse
(SDS-PAGE)
2. Transfert
sur membrane
Y
Y
Y
Y
Y
Y
3. Immunoblot
avec anticorps
spécifique
Y
E
Y
E
Y
E
Y
E
Y
E
Y
E
Y
Y
Y
4. 2ème anticorps
couplé
à enzyme
5. Révélation
(luminescence…)
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Séquence I en aa
de la protéine Expression de la protéine Mutagénèse dirigée
Production d’anticorps
Clonage d
Clonage d’ ’une prot une proté éine ine
ARNm
ADNc
vecteur recombinant
Banque d’ADNc
Protéine purifiée
séquence nucléotidique
AAGTCCTGCGGTGACAACGGTCG
= SONDE
séquence partielle
en acides aminés
Lys-prol-trp-tyr-asp-ser-cys-ala
Criblage de la banque
ADNc du gène
Séquence nucléotidique complète
cellule