Partie II Propriétés optiques des tissus Fluorescence Fluorophores
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Partie II Propriétés optiques des tissus Fluorescence Fluorophores intrinsèques dans les tissus biologiques ? Biomedical optics, Lihong V.W Wiley Ed 2007 68 Partie II Propriétés optiques des tissus Fluorescence Pourquoi observet-on des spectres d’émission continus? Distribution de probabilité des électrons dans les états vibratoires des niveaux S1 et S0 Les probabilités de transition d’un état vibratoire de l’état So vers un état vibratoire de l’état S1 suivent le principe de Franck-Condon Spectre d’émission de la fluorescence = histogramme des probabilités de transition de l’état basal de S1 vers les différents états 69 vibratoires de S0 Partie II Propriétés optiques des tissus Fluorescence Pourquoi les spectres d’absorption et d’émission sont ils symétriques? La structure des niveaux d’énergie autorisés pour les deux états S0 et S1 est identique pour de nombreux fluorophores, par conséquent comme les même règles gouvernent les probabilités de passage de l’état basal s0 vers un état excité ou le retour de S1 vers un des états vibratoires de S0 les spectres d’absorption est d’émission sont globalement symétriques 70 Partie II Propriétés optiques des tissus Contrôle des propriétés optiques des tissus ? Enjeu principal: augmenter la transparence des tissus - Possibilité d’augmenter la transmission de la lumière par compression ou étirement des tissus (Mécanisme = diffusion du sang et de l’eau hors de la zone comprimée) - Application locale de glucose, propylene glycol, polyethylene glycol, Verografin….(Mécanisme = diminution de la diffusion par adaptation d’indice entre le milieu et les diffuseurs) - Effets thermiques :si T°C augmente la taille et la forme des diffuseurs peut etre modifiée; si changement non uniforme de température on peut observer des changements d’indice locaux - Adaptation d’indice par injection sous cutanée d’eau /glucose pour favoriser la pénétration de la lumière à l’interface air/peau Méthodes encore très prospectives 71 Partie II Propriétés optiques des tissus Résumé et Conclusions Propriétés optiques des tissus : points clés 1- Les tissus biologiques = milieu très diffusant et absorbant. 2- Les principales sources d’absorption sont l’eau, le sang, la mélanine. Les principales sources de diffusion sont les membranes (lipides), les mitochondries, les noyaux des cellules, les fibres de collagènes. 3- Les propriétés optiques des tissus sont fortement dépendantes de la longueur d’onde. 4- L’absorption dans les tissus est la plus faible dans une fenêtre spectrale entre 450 et 850 nm. 5- Dans les tissus certains molécules sont naturellement fluorescentes et donne lieu au phénomène d’autofluorescence 6- Certaines structures ordonnées (fibres) des tissus peuvent modifier la polarisation de la lumière. 7- La propagation des photons lumineux dans les tissus est très anisotropique. 72 Partie II Propriétés optiques des tissus Résumé et Conclusions Propriétés optiques des tissus : implications pour l’imagerie et la spectroscopie 1- Les techniques optiques sont limitées en pénétration et en résolution spatiale par l’absorption et la diffusion 2- Les propriétés optiques des tissus sont des sources de contraste pour les techniques d’imagerie. La variétés des différentes sources de contraste a conduit à l’émergence de très nombreuses techniques optiques in vitro et in vivo ( microscopies, imageries 2D et 3D, spectroscopies). 3- Connaitre les propriétés optiques des tissus est essentiel pour comprendre les différentes contributions à la formation des images / spectres par les différentes techniques optiques 4- La pénétration dans les tissus est maximale entre 400 et 850 nm. La peau est un cas Particulier car elle contient de la mélanine 5- Différentes méthodes ont été développées pour les mesures in vitro et in vivo des coefficients optiques…ce que nous verrons au prochain cours… 73 Partie III Dispositifs de mesure des propriétés optiques des tissus : 74 Partie Partie III III Mesure des propriétés optiques des tissus Position du pb Problème : Comment obtenir µa, µs et g (ou p(θ θ)) à partir de mesures expérimentales sur un tissu biologique - Méthodes in vitro ou in vivo - Mesure à une longueur d’onde ou sur une bande spectrale étendue Mesures expérimentales µa (λ), µ’s(λ) Ou µa(λ), µs(λ), g(λ) 75 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesures in vitro Méthodes in vitro : I mesure de la transmission collimatée mesure directe de µt(λ) Echantillon Source lumineuse détecteur d diaphragmes Cf TP 76 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vitro Méthodes in vitro : I mesure de la transmission collimatée Étape 1 : mesure de l’intensité de référence Eau Io(λ) Source lumineuse détecteur d diaphragmes Echantillon de référence = eau (indice= 1.33 proche de celui des tissus : élimine les différences aux interfaces ) Mesure de Io(λ) 77 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vitro Méthodes in vitro : I mesure de la transmission collimatée Etape 2 : Mesure de It : photons transmis sans diffusion à travers l’échantillon Tissu It(λ) θ Source lumineuse détecteur x diaphragmes 78 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesures in vitro Méthodes in vitro : I mesure de la transmission collimatée Hypothèse : les photons détectés sont essentiellement des photons balistiques qui n’ont pas subi de diffusion 3 paramètres expérimentaux déterminent la validité de cette hypothèse : - l’épaisseur de diffusion de l’échantillon µs*d - la fonction de phase de l’échantillon - l’angle d’acceptance θ du système de détection Le premier paramètre détermine, après traversée de l’échantillon, le rapport du nombre de photons diffusés sur le nombre de photons balistiques Les deux derniers paramètres déterminent la proportion χ des photons diffusés qui seront détectés Question : comment peut on obtenir µt sur une gamme spectrale étendue ? 79 Partie III Méthode de la transmission collimatée Domaine de validité (1) Les photons ayant subit une diffusion et qui sont détectés constituent un bruit pour la méthode. Evaluons quantitativement l’erreur induite Distribution des photons diffusés dans un échantillon sans diffusion spéculaire avec g=1 Photons transmis sans diffusion N 0 = N in exp(− µt d ) Nombre de photons transmis qui ont subi i diffusions (loi Poissonienne de paramètre µsd) ( µs d ) i N i = N in exp(− µt d ) × i! Distribution des photons diffusés En intégrant la fonction de phase de Henyey Greenstein sur l’angle d’acceptance du détecteur, en tenant compte de la diffusion spéculaire à l’interface échantillon/air on obtient une approximation de la fraction détectée de la lumière ayant subit une diffusion unique. χ= θ '² 2(1 − g )² Approximation valable si g proche de1 et θ’ proche de 0° 80 Partie III Méthode de la transmission collimatée Domaine de validité (2) Les photons ayant subit une diffusion et qui sont détectés constituent un bruit pour la méthode Lorsque µsd<1 la probabilité d’avoir une multidiffusion dans l’épaisseur d est négligeable Lorsque g est proche de 1, on peut estimer le nombre de photons diffusés une fois : ( µs d )1 N1 = N in exp(− µt d ) × = N in exp(− µt d ) × ( µs d ) 1! L’erreur relative due à la détection des photons diffusée est : εr = χ N1 θ '² = χµs d = µs d No 2(1 − g ) Épaisseur limite de l’échantillon Exemple : nechantillon= 1.33, g = 0.94, θ = 3mrad, hypothèse µs=400cm-1 Pour obtenir ε < 1% il faut d <0.354mm 81 Partie III Mesure directe de la fonction de phase Goniomètre Mesure de la fonction de phase p(θ θ) Echantillon Source lumineuse θ Détecteur mobile Mesure uniquement in vitro Nécessité d’un détecteur avec un petit angle d’acceptance 82 Partie III Méthode par sphère intégrante Principe Méthodes in vitro : II Méthode de la sphère intégrante Méthode de mesure indirecte : 1) on mesure la transmittance totale T(λ) et la réflexion diffuse R(λ) 2) on en déduit µa, µs’ (ou µa, µs, g si on mesure également la transmitance collimatée Tc(λ)) T(λ) Spectrophotomètre fibré Source lumineuse Sphère intégrante échantillon Mesure de T(λ) 83 Partie III Méthode par sphère intégrante Principe Méthodes in vitro : II Méthode de la sphère intégrante R(λ) Spectrophotomètre fibré Source lumineuse Sphère intégrante échantillon Mesure de R(λ) = photons réfléchis spéculairement +photons transmis après diffusion dans le tissu 84 Partie III Principe Méthode par sphère intégrante Principe Principe et intérêts d’une sphère intégrante -Sphère recouverte sur sa surface interne d’un matériau hautement diffusant ( dans le visible BaSO4) -Les faisceaux lumineux provenant de n'importe quel point de la surface interne de la sphère, sont distribués, en raison des multiples réflexions diffuses, de façon égale à tous les autres points de la sphère et ceci indépendamment de la direction originale de la lumière. Une sphère intégrante = diffuseur qui conserve la puissance mais détruit l'information spatiale. Intérêts - Mesure de la reflectance totale - Elimination des biais liés à l’inhomogénéité des échantillons - Detection isotropique de la reflectance - Limitation des effets de polarisation 85 Partie III Méthode par sphère intégrante Principe A votre avis quelle est la mesure la plus délicate ? Dispositif de mesure utilisé en TP Position A : Mesure de la TRANSMITTANCE T(λ) Position B : Mesure de la Réflectance R(λ) Position C : Mesure de la Transmission collimatée 86 Partie III ? Mesure des Propriétés optiques des tissus T(λ λ), R(λ λ) µa, µs g ? Comment obtient on les paramètres optiques µa, µs et g à partir de la mesure de T(λ), R(λ) et Tc(λ) ? Ou Comment résoudre le « problème inverse » 1) On utilise un des modèles de la propagation de la lumière dans les tissus ( MC, Modèle de la diffusion …) 2) Soit on a une expression littérale de T(λ), R(λ) et Tc(λ) en fonction des propriétés optiques µa, µs et g et on évalue ces propriétés à partir des grandeurs mesurées 2bis) Soit on simule la géométrie de l’échantillon et de la source lumineuse pour lesquelles on va calculer successivement pour différents jeu de paramètres µa, µs et g les grandeurs mesurées T(λ), R(λ) et Tc(λ). On identifie les propriétés optiques du tissue avec celles qui donne les valeurs simulées de T(λ), R(λ) et Tc(λ) les plus proches des mesures expérimentales 87 Partie III Méthode Monte Carlo Tirage aléatoire sur une distribution Modèles propagation des photons : méthode Monte Carlo tirage aléatoire sur une distribution de probabilité L Wang, SL Jacques, L Zheng, MCML - Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues, Computer Methods and Programs in Biomedicine 47:131-146, 1995. L Wang, SL Jacques, "Monte Carlo Modeling of Light Transport in Multi-layered Tissues in Standard C," 1992-1998. 88 Partie III Méthode Monte Carlo Tirage aléatoire sur une distribution Exemple de tirage aléatoire Longueur du parcours s d’un photon avant interaction (absorption ou diffusion) dans un milieu décrit par µt=µa+µs F = fonction de probabilités cumulées p = fonction de densité de probabilité (distribution de probabilité définie sur un intervalle) F ( s ≥ s1 ) = exp(− µt s1 ) F ( s < s1 ) = 1 − exp(− µt s1 ) dF ( s < s1 ) densité de probabilité p ( s1 ) = = µt exp(− µt s1 ) ds1 Pour tirer aléatoirement s sur la distribution p(s) 1) Tirage de ζ sur [0 1] 2) Egalisation de ζ et F(s<s1) 3) Inversion de F(s<s1) pour obtenir s = f(ζ) ici s = ln(1- ζ) / µt = ln(ζ) / µt 89 Partie III Méthode Monte Carlo Propagation 1 Propagation des photons dans les tissus 2 « HOPS, DROPS, SPINS, CHECKS » Etape 1 : tirage d’un paquet de photons : coordonnées et direction . Poids W=1 Etape 2 : tirage aléatoire de la longueur s d’un pas sur la base des propriétés optiques du milieu (µt) et déplacement du photon HOPS 90 Partie III Méthode Monte Carlo Etape 3 : L’absorption d’une partie du paquet de photon se traduit par une diminution du poids dépendante des propriétés optiques du milieu Etape 4 :Diffusion du photon Propagation DROPS SPINS Tirage aléatoire de l’angle θ de diffusion ( Henyey Greenstein), de l’angle azimuthal φ et calcul des nouveaux cosinus de direction 91 Partie III Méthode Monte Carlo Terminaison Etape 5 : Terminaison du photon Si W< à une valeur fixée par l’utilisateur ( ex 0.1), on joue la vie ou la mort du paquet à la roulette Russe par un tirage aléatoire. CHECKS Conservation de l’énergie 92 Partie III Méthode Monte Carlo Propagation 1) A partir de la méthode MC, on peut constituer des tables de T(λ), Tc(λ) et R(λ) simulées pour des paramètres optiques donnés et des géométries données. 2) On peut alors résoudre le problème inverse par itérations en parcourant les tables et déterminer les paramètres µa, µs et g qui reproduisent le mieux les données expérimentales mesurées T(λ), Tc(λ) et R(λ). Méthode précise …mais nécessite de longs temps de calculs ( une simulation par géométrie et par longueur d’onde). 93 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique On peut approximer un incident anisotrope sur source intra-tissulaire profondeur pinceau lumineux un tissu par une isotrope à une l’t=1/µt’ Pour un pinceau lumineux en incidence oblique les lois de Descartes donnent : sin α i = n rel sin α t Le barycentre de la lumière réfléchie à la surface est attendu à la position sin α t xs = µ's + µa 94 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique Dispositif expérimental Points critiques - précision angulaire -Sensibilité du détecteur (pour les mesures sur milieux très absorbants) -Homogénéité et épaisseur de l’échantillon 95 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique On mesure expérimentalement deux paramètres : xs et la distribution de l’intensité de la lumière réfléchie Mesure expérimentale sur fantôme (n = 1.33, µa= 0.25cm-1, µs= 20 cm-1 g = 0.853) xs = 0.167 cm Simulation Monte Carlo (n = 1.33, µa= 0.25cm-1, µs= 20 cm-1 g = 0.853) xs= 0.174 cm 96 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique Lorsque µa est « grand », le barycentre de la lumière réfléchie à la surface est prévue empiriquement par la relation : sin α t xs = = 3 D sin α t µ ' s + 0 .35 µ a 1 D= 3( µ ' s + 0 .35 µ a ) Pour les données expérimentales de la diapositive précédente on obtient alors xs = 0.176cm en bon accord avec la simulation Monte Carlo 97 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique On mesure expérimentalement xs et la distribution d’intensité de la lumière réfléchie en surface. Pour obtenir µa et µ’s on a besoin d’une relation supplémentaire donnée par l’approximation de la diffusion qui fait l’analogie du transport de la lumière dans les tissus avec les loi de Diffusion de Fick et Fourier. Approx valide pour µa<<µ’s Expression de l’intensité réfléchie en fonction de la position x a’=µa/µa+µ’s x = distance entre le point de pénétration de la lumière et le point considéré ρ1 et ρ2 = distances du point d’incidence et de la « source image » au point considéré x µeff= coefficient d’atténuation effectif ( définit par la théorie de la diffusion) z’s= profondeur de la source isotropique équivalente = xs cos(αt) zb=coefficient qui prend en compte les dimensions de l’échantillon 98 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : I Méthode de Reflectometrie en incidence oblique A partir des mesures et des différentes relations on peut cacluler µa et µ’s Mesure xs D Mesure de Rd(x) donne µeff par fit ( par ex méthodes des moindres carrés) sur l’expression de Rd(x) Or par définitions D= 1 3( µ's +0.35µa ) µeff = µa D La résolution de ce système donne µa et µ’s Avantages de la méthode : rapide, instrumentalement simple, mesure in vivo possible Inconvénient : nécessité d’une source fortement collimatée ( laser), inadaptée 99 pour des échantillons hétérogènes Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : II Spectroscopie en lumière blanche Dispositif expérimental Fibre 1 Réseau dispersif 1 x On utilise le principe de la réfléctométrie en incidence oblique mais dans une géométrie fibrée et en lumière blanche Avantages : on mesure µa(λ) et µ’s(λ) Dispositif mobile utilisable en particulier en champ opératoire in vivo, 9 λ Capteur CCD 2D 100 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : III Détection résolue en temps Principe : Une impulsion laser ultra courte est déformée par son passage dans un milieu diffusant. Les photons transmis ou réfléchis détectés seront détectés à des instants différents selon la nature de leur propagation (balistiques, serpentiles, diffusés) Les photons serpentiles contiennent une information sur les propriétés optiques du milieu ( absorbtion et diffsusion ) et sur d’éventuels objets ( ex : tumeur, vaisseaux) situés dans l’axe de propagation ou aux alentours Les photons diffusés constituent la majorité des photons ( pour un tissu biologique). Ils contiennent des informations sur les propriétés optiques du milieu et sur ses inhomogénéits susceptibles de modifié la forme du spectre des photons diffusés 101 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : III Détection résolue en temps Deux schémas possibles : détection en transmission ( in vitro uniquement), ou en réflexion ( in vitro et in vivo). On réalise un fit sur la forme de la distribution des photons détectés au cours du temps sur la base de la Reflectance ou de la Transmittance en fonction du temps prédite par l’équation de la Diffusion en régime non stationnaire (Approx valide pour µa<<µ’s) 102 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : III Détection résolue en temps Dispositif expérimental pour la mesure in vitro - Impulsion laser ultra courtes (ps) - Détection de simple photon par photomultiplicateur - Mesure du temps par Discriminateur à fraction constante et Convertisseur Temps / Amplitude Avantage : méthode in vivo Inconvénient : basée sur l’approximation de la diffusion, couteuse 103 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Mesure in vivo Méthodes in vivo ( ou in vitro) : III Détection résolue en temps par streak caméra Avantage : méthode in vivo Inconvénient : basée sur l’approximation de la diffusion, très couteuse 104 Partie III Mesure des Propriétés optiques des tissus Variabilité des mesures Dans la littérature, il existe une grande variabilité dans les valeurs obtenues pour un même type de tissu Sources de cette variabilité : - Différences dans les conditions physiologiques ( hydratation , sang, homogeneité, variation inter et intra espèces, tissus frais/congelé, tissu fixé ou non, interfaces lisses ou rugeuses) - Mesure in vitro ou in vivo - Geométrie de l’illumination - Reflections spéculaires aux interfaces air/ porte echantillon / echantillon - Résolution angulaire des détecteurs - Ouverture numérique des fibres de collection de la lumière - Pour la mesure de la transmission collimatée , la séparation de la lumière diffusée ( bruit) de la lumière non diffusée (signal) -Modèle de propagation des photons utilisé pour résoudre le « problème inverse » 105 Partie IV Imagerie de optique cérébrale in vivo 106 Partie IV Imagerie optique in vivo Activité Imagerie de l’activité cérébrale Activité = traitement par le cerveau de l’information éventuellement consécutive à une stimulation qui se traduit par : • Modification de l’activité électrique • Demande énergétique qui induit Changements du débit sanguin Modification du niveau d’oxygénation local Modification locale de concentration ( sang, chromophores) Ces signaux physiologiques se traduisent par des modifications des propriétés optiques des tissus sources de contraste pour l’imagerie et la spectroscopie 107 Partie IV Imagerie optique in vivo Imagerie de l’Activité : enjeux Enjeux Conditions normales : -compréhension des mécanismes cérébraux ( mémoire , apprentissage, langage repérage spatial….) Conditions pathologiques ( neurodégénérescence , épilepsie, déficit d’oxygénation, tumeurs cérébrale) : - Imagerie des zones hypo ou hyper métabolique pour le diagnostique, le suivi thérapeutique, l’imagerie per-opératoire Imagerie Optique in vivo : instrumentation « simple », légère et peu couteuse MAIS profondeur et résolution spatiale limitée par les propriétés d’absorption et de diffusion des tissus 108 Partie IV Imagerie optique in vivo Imagerie de l’Activation : enjeux Spectroscopie et Imagerie proche infrarouge (1) Intérêts -Imagerie facile a mettre en œuvre chez le nouveau né - Imagerie fonctionnelle ( cartographie oxygénation) Principe(1) Différence des spectres d’absorption de l’hémoglobine oxygénée vs désoxygénée dans le rouge ou l’IR 109 Partie IV Imagerie optique in vivo Imagerie de l’Activation : enjeux Spectroscopie et Imagerie proche infrarouge Loi de Beer Lambert Principe (2) d ln (I/Io)=-ε*c*d Loi de Beer Lambert modifiée ln (I/Io)=-ε*c*DPF +G DPF = chemin optique = f(λ) estimé par simulation MC G = Absorption due à la diffusion non mesurable En pratique on réalise une mesure relative des changements de concentrations ∆ln (I/Io)=ε(λ)*(∆c)*DPF(λ) 110 Partie II Propriétés optiques des tissus Absorption La mesure à au moins deux longueurs d’onde permet de quantifier les changements du compartiment sanguin La mesure de l’absorption à deux longueurs d’onde donne les variations des concentration en hémoglobine oxygénée et déoxygénée. ( soit la concentration en hémoglobine totale cHbtet sa saturation en oxygène S) ∆ ln( I / I 0 ) λ1 = − (ε HbO 2 λ 1∆ c HbO 2 + ε HbR λ 1 ∆ c HbR ) × DPF λ 1 ∆ ln( I / I 0 ) λ 2 = − (ε HbO 2 λ 2 ∆ c HbO 2 + ε HbR λ 2 ∆ c HbR ) × DPF λ 2 c = concentration totale en hémoglobine ( µmol.l-1) εHbR = coefficient d’extinction moléculaire hémoglobine deoxygénée ( mm-1.l.µmol-1) εHbO2 = coefficient d’extinction moléculaire hémoglobine oxygénée Limites de la méthodes : - précision du DPF estimé - On mesure des variations, pas de valeurs absolue sans mesure quantitative au préalable des valeurs de références 111 Partie IV Imagerie optique in vivo Humain vs animal Spectroscopie et Imagerie proche infrarouge + colorants 112 Partie IV Oxymétrie in vivo Humain Topographie vs Tomographie 113 Partie IV Oxymétrie in vivo Humain Couple source /détecteur : propagation en banane 114 Partie IV Oxymétrie in vivo Humain Instrumentation différents domaines : -Eclairage continu -Modulation en fréquence (détection du décalage de phase) -Détection résolue en temps ( cf. cours III) 115
