Techniques d`ionisation et analyseurs

Questions – Mesure de masse
1673.72
1674.72
Substance P(âques)
Séquence:
THREE EASTER EGGS
0.17 m/z
1670
1672
1674
1676
1678
1680
• Quelle serait la masse approx. en se basant sur le rapport isotopique?
• La masse indiquée est-elle nominale, moyenne ou exacte?
• Quelle est la resolution si la largeur de a 50% est de 0.17 m/z?
• Si la form. emp. est C64H103N23O30, combien d’atome
l’ion a 1674.72?
12C
contient
Règle de l’azote: Masse moléculaire paire pour un # pair d’atome d’azote
CHM 2971 H06
1
Spectrométrie de masse
Technique
d’ionisation
Principe
Analytes
Limite de
detection
Commentaires
Impact electronique
(EI)
Impact d’électron
de 70eV avec
molécules
neutres gazeuse
Molecules volatiles <
1000 Da et
thermiquement
stables
Bas pg
Gain significatif
d’energie interne
(> 10eV) i.e. ion
fragments
Ionisation chimique
(CI)
Addition (+) ou
abstraction (-)
electrophile avec
gas ionisant
Molecules volatiles <
1000 Da, depend de
l’affinite protonique
(PA)
~10-50 pg
Gas ionisants (CH4 ,
AP:552 kJ/mol) NH3,
AP: 854 kJ/mol) – Eint.
Ionisation/
désorption par
champ élect. (FI/FD)
Cationisation
(+H, Na) avec sel
Polymères jusqu’a
3.5 kDa
~50-100 pg
Champ de 2V/Ǻ,
analyte depose sur
emetteur de graphite
Bomb. d’atomes
rapides (FAB) ou
d’ions rapides
(LSIMS)
Echange de
proton (ou adduit
d’alkalin) avec
matrice
Biopolymeres
jusque’a 20 kDa
~ng (pmols)
FAB: Xe: ~8 keV,
LSIMS: Cs+: ~30 keV,
Matrice: glycérol,
thioglycérol, DTT/ET
Nébulisation
électrostatique (ESI)
Nebulisation
d’especes ionique
en solution sous
un champ elect.
Biopolymeres
jusque’a 1MDa
~1 fmole
Peu de fragmentation.
Ions multiplement
chargés
Désorption laser
avec matrice
(MALDI)
Desorption/ionisa
tion avec matrice
absorbant UV
Biopolymeres
jusque’a 300kDa
~1 fmole
Peu de fragmentation,
ions simplement
chargés
CHM 2971 H06
2
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Impulsion laser de 4 ns (λ337 nm , N2, 106-107 W/cm-2)
Zone d’irradiation
de 0.05-0.2 mm
[M+H]+
To MS
± 30 kV
Échantillon + matrice
10000
m/z
15000
Caractéristiques:
Analytes:
Sensibilité:
Précision:
Résolution:
Purete de l’ech.:
Matrice:
CHM 2971 H06
Biomolecules jusqu’à - 500 kDa
1-10 pg (-1-10 fmoles)
Avec TOF ± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)
Avec TOF 15,000 (<10kDa), <1000 @ >20 kDa
Moindre susceptibilité à la présence de sels (mM)
Absorbe en UV, dépend de l’analyte, peut causer un
bruit de fond < 800 Da
3
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Impulsion laser de 4 ns
106 W/cm2 (λ337 nm , N2)
Echantillon + matrice (1:5000)
Co-crystallisation
International Journal of Mass Spectrometry 200 (2000) 71–77
Mass Spectrometry Reviews, 17 (1998), 337–366
CHM 2971 H06
4
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
λ
UV/visible regions
Excimer gaz rares:
ArF
KrF
XeCl
XeF
Azote
193
248
307
351
nm
nm
nm
nm
337 nm
Infrarouge
Er:YAG
CO2
fondamentale
2.94 µm
9.6 nm, 10.6 µm
Plus communs
Laser Science Inc. VSL-337ND nitrogen laser. Specifications : 250µJ/impulsion, 3 ns
temps d’impulsion. Duree de vie ~ 2-4 ans.
CHM 2971 H06
5
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Aspects mécanistiques
Impulsion laser
± 30 kV
Un faisceau moléculaire
supersonique occasionne la
sublimation de l’analyte/matrice
Analyte + matrice
Modèle de désorption avec matrice
‰ La matrice absorbe la radiation dans la gamme d’émission du laser.
‰ L’énergie absorbée occasionne la dissociation de la matrice.
‰ La zone irradiée s’etend sur une zone de 300 μm x 600 μm, 25 Å profondeur, et déplète
environ 4.5 x 10-10 cm3 de solide.
‰ La dissociation rapide de la matrice libère des molécules neutres et des analytes en phase
gazeuse et produit une région de plus haute pression dans le voisinage de la surface
irradiée.
‰ Cette haute pression se traduit par une expansion supersonique amenant avec elle les
analytes desorbés.
CHM 2971 H06
6
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Aspects mécanistiques
Photoexcitation
CHM 2971 H06
Excitation par 2
photons
Excitation par 2
photons
simultanement
Mass Spectrometry Reviews, 17 (1998), 337–366
7
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Matrices
OH
COOH
2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB)
1, 2, 3, 4, 5
OH
CN
CH=C
α-cyano-4-hydroxycinnaminic acid (CHCA)
COOH
1, 2
HO
OH
3-hydroxypiconilic acid (HPA)
N
OH
COOH
O
4
OH
Dithranol (non acide)
5
OH O
Sinnapinic acid
HO
C CH 3
2
HO
(1: peptides, 2: protéines, 3: oligosaccharides, 4: acides nucléiques, 5: polymères)
CHM 2971 H06
8
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Préparation de l’échantillon
A. Evaporation
• Désaler l’échantillon (Zip tip). Utiliser au besoin des billes échangeuse d’ions pour réduire la
formation d’adduits alcalins.
• Préparer solution ~ 10 µM de l’échantillon dans une solution aqueuse d’acétonitrile.
• Préparer une solution de 0.1 M solution de matrice (DHB ou CHCA) in 1:1 Acétonitrile:eau.
• Mélanger la solution de matrice et l’echantillon 1:1 (v:v).
• Appliquer 0.5 µL de l’echantillon/matrice sur la plaque et sécher.
S.L. Cohen, B.T. Chait, Anal. Chem. 68, 31-37 (1996)
B. Couche mince
• Dissoudre la matrice dans l’acétone avec 1-2% eau et appliquer sur la plaque.
• Rinser la plaque légerement avec l’eau pour enlever les sels.
• Appliquer l’échantillon.
O. Volm, P. Roepstorff, M. Mann, Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994)
C. Sandwich
• Préparer une couche mince comme decrit en B.
• Appliquer analyte/matrice sur la couche mince celle-ci formant de cristaux de germination.
F. Xiang, R.C. Beavis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 199-204 (1994)
CHM 2971 H06
9
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
„
Application de l’échantillon
CHM 2971 H06
10
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Présence de sels
Compatibles
Procédure pour désaler les echantillons
Bicarbonate d’ammonium
Acetate d’ammonium
Bis-Tris
Tris(≤100 mM)
Hepes(< 100 mM)
Billes échangeuse d’ions
Incompatibles
Lavage:
Tampons phosphates
Tampons sulfates
Tris(> 100 mM)
Hepes(>100 mM)
1. Utiliser 0.1% TFA ou 5% isopropanol pour les detergents nonionique
2. Pipetter 1-5 μl de solvant et appliquer sur l’echantillon/matrice et
laisser reposer 5s
3. Enlever le liquide avec une pipette ou avec un jet d’air.
4. Repeter 2 fois
5. Secher avant l’analyse MALDI.
CHM 2971 H06
1.
2,
3.
4.
5.
6.
Placer ~0.1 mg de billes SCX (200 mesh) sur un parafilm.
Ajouter 5 to 10 μl d’echantillon aux billes.
Pipetter ~ 20 fois.
Laisser reposer 30 s.
Enlever le surnageant et deposer la solution de matrice/solvant
Laisser reposer ~30s et appliquer surnageant sur la plaque MALDI
11
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation - Désorption laser avec matrice
Instrumentation
MALDI-TOF DE STR PerSeptive Biosystems
CHM 2971 H06
12
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
⇑ Champ électrique
↓
↓
↓
↓
↓
Nébulisation des
gouttelettes
↓
↓
Echantillon/
phase mobile
↓
Air
Evaporation du solvant
↓
ESI voltage (5 kV)
↓
Ejection des ions
Caractéristiques:
Analytes:
Sensibilité:
Précision:
Résolution:
Hybride:
CHM 2971 H06
Biomolécules jusqu’à - 500 kDa
1-10 pg (-1-10 fmoles pour 1000 Da)
± 0.02% (ext.), ± 0.005% (int.)
Avec TOF 15,000, >100,000 avec FTMS
Couplage en ligne avec EC, CLHP, infusion
13
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
o La nébulisation électrostatique est obtenue
suite a l’application du voltage (~1-3 kV) a
l’extremité de l’émetteur (capillaire couvert
d’une couche métallique, tube d’acier inox,
jonction liquide).
o Un fin pinceau de gouttelettes chargées est
observé à l’extremité de l’émetteur.
o Les goutellettes chargées sont rapidement
dispersées avec l’évaporation du solvant.
o Pour les débits > 1 μL/min l’evaporation est
accélerée avec l’utilisation d’un nébuliseur coaxial ou de jets d’air chaud.
o L’ émission des gouttelettes chargées
dépend du voltage appliqué ainsi que du
débit de l’ échantillon
www.newobjective.com
CHM 2971 H06
14
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Caractéristiques du spectre de masse ESI
8+
9+
1112.1
1251.0
+H
10+
7+
Protéine de 10,000 Da
1429.6
6+
1667.7
1001.0
1500
1000
m/z
‰ Apparition d’ions multiplement chargés ie [M-nH]n- ou [M+nH]n+
‰ Espacement entre deux série d’ion multiplement chargés correspond a
l’ajout ou l’abstraction d’un proton de la molécule.
‰ Comment peux t’on determiner la masse moléculaire?
m / z1 =
[M + nH]
z
CHM 2971 H06
et
m / z2 =
[M + nH + 1]
z +1
et
m / z 2 < m / z1
15
Spectrométrie de masse
† Nébulisation électrostatique (ESI) calcul de masse
M = m / z1 (z ) − ( z )H et m / z2 =
m / z2 (z + 1) = m / z1(z ) − H
(m / z1 (z ) − ( z )H + [z + 1]H)
z +1
donc
z =
m / z2 − H
m / z1 − m / z2
Dans l’exemple précédent:
z=
1251.0 − 1.0078
= 7 et M = 7 × 1429.6 − (7 × 1.0078) = 10000Da
1429.6 − 1251.0
CHM 2971 H06
16
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Ions multiplement chargés et charge
M: 1000.5 Da
1001.5
1 m/z
Simplement chargé
0.5 m/z
501.3
Doublement chargé
0.33 m/z
Triplement chargé
334.5
m/z
CHM 2971 H06
17
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Aspect mécanistique
‰ Production de gouttelettes chargées à partir de l’analyte
dissout en solution
‰ Evaporation du solvant, diminution de la taille des
gouttelettes, desintégration de celles-ci donnant lieu à des
micro-gouttelettes plus chargées.
‰ Production d’ions en phase gazeuse.
‰ Phénomènes secondaires tels oxidation de l’analyte.
CHM 2971 H06
18
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Gouttelettes chargées. La solution à l’extrémité du nébuliseur
électrostatique est soumis à une tension électrique elevée. L’évaporation
du solvant et la collision avec les molécules environnantes a pression
atmospherique occasionne une réduction de la taille des gouttelettes.
Une explosion Coulombique (fission) survient lorsque la micro-gouttelette
atteint la limite de Rayleigh ou l’ampleur du champ électrostatique est
plus grand que la tension de surface Anal. Chem. 65, 972A (1993).
eAlimentation
haut voltage
R: 0.945 um
N: 51250
e-
+
- +
462 us
+ ++
+
+
+++
R: 1.5 um
N: 51250
Oxidation
Taylor cone
+
+
+ +
+
+
+++
+
+ +
+
+++
+
++
+
+ +
++ +
++
+
+
+
++
+
++
+++
+
+
+
+
+
+
183 us
0.03 um
278
+
+
0.939 um
43560
CHM 2971 H06
Réduction
0.09 um
384
0.003 um
2
+
++
++
++
+
0.03 um
236
19
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Taille de l’émetteur, débit et efficacité d’émission. Les progrès récents dans
la fabrication d’émetteurs de petits diamètres et la disponibilité de pompes
CLHP à faible débit ont permis d’obtenir des gains importants de sensibilité
(Wilm, M.S., Mann, M., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc., 136, 167,
(1994)]. Dans ces conditions un cône de Taylor est obtenu pour des debits
de 25-100 nL/min avec une émetteur de <10 mm. Le rayon d’émission est
definit par:
ρ
⎛
⎜
re = ⎜
⎜
⎝
2
4π γ
⎞
⎡⎛
U ⎞
⎛π
a
⎞⎢
tan
− α ⎜
⎟
⎝2
⎠
U
t⎠
⎢⎣ ⎝
2
⎤⎟
⎟
− 1⎥
⎟
⎥⎦ ⎠
1/ 3
x
⎛ dV ⎞
⎝ dt ⎠
2/3
où γ est la tension de surface du liquide, α l’angle de cone liquide, ρ sa
densité, Ut et Ua le seuil du voltage d’émission et le voltage appliqué, et
dV/dt le débit. Pour un capillaire de dimension donné, le diamètre est
proportionnel au débit (DV/dt)2/3.
CHM 2971 H06
20
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS
Diamètre (mm)
Débit (μL/min)
Qté inj. (pmol)
Facteur de conc.
Rel.
4.6
500-1000
102-105
1
2.1
100-400
50-104
5
1.0
40-100
5-103
20
0.32
1-10
0.5-500
200
0.075
0.05-0.5
0.001-1
3700
CHM 2971 H06
21
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Comparaison de la sensibilité et du débit en LC-MS
CHM 2971 H06
22
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
CHM 2971 H06
23
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
CHM 2971 H06
24
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
‰ Résolution accrue pour l’analyse de
protéines en mode ESI.
‰ MALDI permet par contre une mesure de
masse avec une plus grande sensibilité
pour l’analyse de glycoprotéines, ce qui
n’est pas possible avec ESI car la
protonation de l’analyte ne permet pas
d’obtenir des m/z dans la gamme
accessible du MS.
CHM 2971 H06
25
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Analyse de peptides
et protéines par ESI
Smith et al. Anal. Chem., 62,
882 (1990)
CHM 2971 H06
26
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Analyse LC-MS de digestat trypsique de lectin (PNA)
CHM 2971 H06
27
Spectrométrie de masse
† Techniques d’ionisation – Nébulisation électrostatique (ESI)
Spectre de masse d’oligonucléotide dT10 en présence
d’imidazole et piperidine (échange H/Na)
GreigM., Griffey. R.H., Rapid Commun. Mass Spectrom., 9, 97 (1995)
CHM 2971 H06
28
Spectrométrie de masse
Analyseurs – Généralités
Type
Temps d’envol
Acronyme
TOF
Principe de séparation
Dispersion temporelle d’un fasceau ionique
pulsé; séparation selon le temps d’envol
Secteur
magnétique
B
Dispersion d’un faisceau ionique continu;
séparation selon le momentum des ions dans
un champ magnétique (Forces de Lorentz)
Quadrupole linéaire
Q
Faisceau ionique continu dans un champ
quadrupolaire linéaire de radio-fréquence;
séparation selon la stabilité des trajectoires.
Trappe ionique
quadrupolaire
linéaire
LIT
Faisceau ionique continu et ions piègés;
accumulation et séparation dans un champ
linéaire de radio-fréquence quadrupolaire
Trappe ionique
quadrupolaire
QIT
Ions piègés; separation selon la trajectoire
stables d’ions dans un champ quadrupolaire tridimensionelle de radio-frequence
Résonance ionique
cyclotronique
ICR
Ions piègés; séparation selon la fréquence
cyclotronique (Force de Lorentz) dans un
champ magnétique.
CHM 2971 H06
29
Spectrométrie de masse
Analyseur – Temps d’envol
La séparation temporelle des ions dans un tube de temps d’envol
de longueur D est définie par:
t =
m
•D
2eV
De facon plus génerale nous devons considérer l’espace spatiotemporelle des ions au moment de leur accélération, ceux-ci
étant dispersés sur une distance s entre la grille d’extraction et la
plaque arrière de la source. Ce temps de résidence contribue
également au temps d’envol et peut etre calculé en considérant la
vélocité à chaque position s de la source.
CHM 2971 H06
30
Spectrométrie de masse
Analyseur – Temps d’envol
Detecteur
Temps d’envol linéaire (MCP)
Cible +
echan.
Temps
Laser
Detecteur
(MCP)
Temps d’envol avec Reflectron
Temps
CHM 2971 H06
31
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Extraction retardée (Time-lag focussing)*
†
†
†
Lors de l’ionisation les ions ont une distribution d’énergie
cinétique causant un élargissement de pic et une perte de
résolution.
En formant les ions dans un champ électrique faible et en
appliquant le potentiel d’accéleration après un délai on peut
minimiser la dispersion d’énergie cinétique des ions.
La période d’attente entre l’ionisation et l’extraction des ions
(delai) et le champ electrique entre la source d’ionisation et
l’électrode d’extraction sont ajustés séparement pour
maximiser la resolution à une masse donnée.
Source
V
Grille
d’extraction
0
ΔV faible, ↓Δ énergie cinétique, focalisation spatiale
ΔV élevée, extraction des ions
20k
Temps
CHM 2971 H06
*WC Wiley, IH McLaren, Rev. Sci.. Instrum., 26, 1150, (1955) 32
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Extraction retardée (Time-lag focusing)*
0V
Ions de même m/z,
vitesse différente
+
+
Détecteur
+
1: Aucun champ électrique. Dispersion des ions durant le délai.
+20 kV
+
+
+
+18 kV
2: Champ électrique. Gradient de voltage accélère davantage les ions plus près de la source.
+
0V
+
+
3: Ions de faible vitesse rejoignent les plus rapides et sont focalisés au détecteur.
Source
CHM 2971 H06
Grille à
voltage
variable
33
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Extraction retardée (Time-lag focussing)*
Angiotensine I
m/z 1296
CHM 2971 H06
34
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Reflectron
Reflectron à champ uniforme. Un reseau de resistance entre
l’entrée de la grille et la fin du reflectron forme un champ électrique de
croissance linéaire.
R.J. Cotter, Time of flight mass spectrometry, ACS, 1997
CHM 2971 H06
35
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Avantages reflectron et extraction retardée
Longueur du
tube d’envol
Lineaire/reflectron
1.3/2.0 m
2.0/3.0 m
4.2/6.6 m
CHM 2971 H06
36
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Injection orthogonale*
†
†
†
†
†
L’analyse du temps d’envol des ions est discontinue.
Les analyseurs à temps d’envol requièrent que les ions soient
produits par paquets successifs.
Ces analyseurs sont compatibles avec les sources d’ionisation
pulsée tel MALDI.
Les sources d’ionisation continues telles IE, nébulisation
électrostatique requièrent des modifications afin d’être
compatibles avec le TOF (e.g. pulser la source, échantillonnage
discontinu du faisceau ionique).
L’échantillonnage discontinu peut être effectué efficacement en
déflechissant les ions dans une direction orthogonale à leur
parcours initial, une approche développée par la compagnie
Bendix en 1964**.
*M. Guilhaus, D. Selby, V. Mlynski, Mass Spectrometry Reviews, 19, 65 (2000)
**O'Halloran GJ, Fluegge RA, Betts JF, Everett WJ. 1964. Report No.ASD-TDR-62-644
CHM 2971 H06
37
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Injection orthogonale
Avec réflectron
Électrodes avec
champ répulsif
et attractif
(impulsion de
10-100ns)
CHM 2971 H06
Θ = tan−1
VTOF
Vbeam
*M. Guilhaus, D. Selby, V. Mlynski, Mass Spectrometry Reviews, 19, 65 (2000) 38
Spectrométrie de masse
† Temps d’envol
„ Injection orthogonale
L’injection orthogonale apporte de
nombreux avantages tels:
† La possibilité de réduire la dispersion de
vitesse du faisceau ionique incident dans la
direction orthogonale du TOF.
† Le contrôle indépendant de l’échantillonage
discontinu et des voltages d’extraction et de
répulsion permet de maximiser le partage du
faisceau entre le temps pris pour le
remplissage de la zone d’extraction et son
accélération dans le TOF.
CHM 2971 H06
39
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Temps d’envol
CHM 2971 H06
40
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
Caractéristiques
Gamme de masse: m/z 10-4000
Résolution: ~ 1000 (unitaire) mais peut
etre de 6000 dans certains cas
Précision: ~m/z 0.1-0.2
Vitesse de balayage: Jusqu’à 5000
m/z par s
Le temps de vie d’un ion de sa formation a sa
detection est d’environ 40-100 μs.
CHM 2971 H06
41
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
‰
‰
y
z
x
-(VDC + VRFcosωt)
‰
‰
+(VDC + VRFcosωt)
‰
Deux paires d’électrodes métalliques.
Application d’un voltage + à une paire
et – à l’autre.
Une combinaison de voltage direct (VDC)
et alternatif (VRF) de fréquence ω est
appliqué à chaque paire.
Les ions oscillent entre les électrodes dû
aux forces électriques alternatives
(attractives et répulsives).
Les électrodes maintenues à voltage +
filtrent les ions de haute masse alors
que celles de voltage – filtrent les ions
de basse masse.
Pour une amplitude donnée des voltages DC et RF, seuls les ions ayant d’un m/z
spécifique auront une trajectoire stable et seront transmis par le quadrîpole alors que les
autres seront déstabilisés et n’auront pas de trajectoires stables.
Revue generale de l’opération du quadrîpole:
P.E. Miller, M. Bonner Denton, J. Chem. Educ., 7, 617 (1986)
CHM 2971 H06
42
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
‰
Un voltage DC+ est appliqué aux paires d’électrodes dans le plan x-z et Un
voltage DC- est appliqué aux paires d’électrodes dans le plan y-z.
‰
Le potentiel moyen appliqué aux paires d’électrodes dans le plan x-z est
déplacé vers un voltage positif.
‰
Le potentiel moyen appliqué aux paires d’électrodes dans le plan y-z est
déplacé vers un voltage négatif.
-(VDC + VRFcosωt)
Voltage RF (-V)
Voltage DC (+V)
Temps
Voltage DC (-V)
+(VDC + VRFcosωt)
Voltage RF (+V)
CHM 2971 H06
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
Action du filtre quadrîpolaire
y
y
z
z
Transm.
m/z
Dans le plan y-z, les ions de
m/z faibles subissent l’effet
du voltage RF les empêchant
de toucher les électrodes.
CHM 2971 H06
z
x
Transm.
x
Transm.
x
y
m/z
Dans le plan x-z, les ions de
m/z élevés sont stabilisés à
cause de leur grande inertie
m/z
La combinaison de ces deux
actions permet une bande de
transmission étroite de m/z.
44
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
‰
En augmentant l’amplitude du voltage RF tout en maintenant le rapport
RF/DC constant on peut transmettre des ions de différents m/z.
CHM 2971 H06
45
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrîpole
Diagramme de stabilité
ax = − ay =
8eVDC
mr 2ω 2
qx = −qy =
4eVRF
mr 2ω 2
xy
a
instable
0.3
Plus de
résolution
m1 < m 2 < m 3
a 2VDC
=
= cst
q
VRF
0.2
y stable
0.1
m2
m3
Moins de
résolution
x stable
m1
0.2
xy
stable
0.4
0.6
∆q
où:
m: masse de l’ion
e: charge
r: rayon entre les électrodes
ω: fréquence
0.8
Détermine la
résolution
q
Les voltage VDC et VRF sont balayés simultanément mais en maintenant leur rapport constant
La gamme passante d’ion est définie par l’intersection de la pente a/q a l’intérieur de la région
de stabilité
CHM 2971 H06
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrupole
a
Résolution
a 2VDC
=
= cst
q
VRF
0.3
‰
0.2
‰
y stable
x stable
0.1
xy
stable
0.4
0.6
0.8
q
‰
Intensité
0.2
‰
La résolution est determinee par la
gamme ∆q.
La résolution n’est pas
nécessairement uniforme avec m/z
et nécessite un ajustement de la
pente a/q.
L’augmentation de résolution se
manifeste également par une
diminution de sensibilité.
Un compromis est nécessaire pour
transmettre les ions d’intérêt avec
une sensibilité et une résolution
adéquate.
m/z
CHM 2971 H06
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrupole
Que se passe t’il lorsque VDC = 0 et que l’on varie VRF?
a
0.3
q
0.2
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
q
‰ Lorsqu’on fixe VDC a 0, le quadrupole transmet une large bande d’ions et pert son
avantage de filtre de masse.
‰ On peut tirer avantage de situation lors de l’activation par collision pour la
caractérisation structurale ou un ion est soumis a une dissociation produisant des
fragments caractéristiques pouvant tous etre transmis et détectés simultanément.
CHM 2971 H06
48
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Quadrupole
Q1
q
Q2
Types de balayage
Balayage complet
(spectre conventionnel)
Gaz de collision,
Ar ou N2
Balayage sélectif
(transmission d’ion avec
m/z pré-définis, SIR)
Spectre d’ions fragments
(product ion scan)
Multiples fragmentation
sélectives
(Multiple reaction monitoring)
Spectres de precurseurs
(precursor ion scan)
Perte de neutre spécifique
(Constant neutral loss)
CHM 2971 H06
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Hybride quadrupole/temps d’envol
Reflectron
Q1 en mode selectif (MS-MS)
Q1 en mode RF (Acquisition TOF)
Orifice
d’échantillonnage
MCP
Nébuliseur
électrostatique
Pulseur et lentilles
d’extraction
CHM 2971 H06
q mode RF seul.
(cellule à collision)
q0 mode RF seul.
50
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Hybride quadrupole/temps d’envol
Duty cycle
2s MSMS2
615.4 (1+)
1s survey
2s MSMS1
5.00
6.00
7.00
Survey scan
421.7 (2+) T
583.3 (2+)
537.8 (2+)
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
889.4 (1+)
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
Time (min)
MS-MS scan
m/z 583.3
K
S
F
N
N
N
E
E
9813
157
185.1
86.0
234.1
100 200
m/z 537.8
K
381.2 495.6 609.3
300 400
Q
201.1
I
388.2
yMax
1094.5
500 600 700 800
E
A
852.3
723.4
L
900 1000 1100 1200
S
LD
846.4
229.1
173.1
E
I
Human
Stathmin
yMax
646.3
517.3
759.4
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
CHM 2971 H06
m/z
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
Ion injectés
Electrode
terminale
+Vrescos(ωrest + φres)
z
Voltage RF
Vcos (ωt+φ)
r
r0
Electrode
centrale
Voltage de
résonance AC
-Vrescos(ωrest + φres)
Détecteur
‰ Les ions sont accumulés à l’intérieur de la trappe ionique comportant deux électrodes
terminales et une électrode centrale.
‰ Les ions ont une trajectoire stable en appliquant un voltage RF sur l’électrode centrale.
‰ Pour un maximum d’efficacité, les ions doivent etre concentrés vers le centre de la
trappe où le champ électrique est optimal et moins distortionné.
‰ Ceci est accomplit en utilisant un gaz tampon tel l’helium favorisant un
refroidissement collisionel.
CHM 2971 H06
52
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
En augmentant le voltage RF ou en applicant un voltage
auxilliaire aux electrodes terminales(ou les deux) il est
possible de:
‰ Déstabiliser les ions et les éjecter de la trappe
progressivement.
‰ Accumuler un ion spécifique
‰ Accumuler un ion et enregistrer ses fragments suite à
l’application d’une longueur d’onde d’excitation aux électrodes
terminales (MS-MS in time).
‰ Cette dernière etape peut être répetée successivement de
façon a obtenir des spectres MSn.
CHM 2971 H06
53
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
Diagramme de stabilité
a
q
q=
où:
4eVRF
mr 2ω 2
m: masse de l’ion
e: charge
r: rayon de électrode centrale
VRF: Voltage RF
‰ Pour que les ions aient une trajectoire stable q doit se situer entre 0.3 et 0.9.
‰ Ce paramètre est important particulièrement lors de la fragmentation; les ions
fragments < 1/3 de m/z du précurseur auront une valeur q > 0.9 est ne seront pas
accumulés.
‰ En augmentant VRF il est possible d’extraire un ion (m/z spécifique). Il est également
possible d’ajuster le voltage aux électrodes terminales affectant le paramètre a.
‰ En combinant ces deux actions il est possibles d’éliminer les m/z (hauts et bas) nondésirés (modulation axiale). Ceci est par contre difficile a accomplir lorsque l’ion
d’intérêt est en présence d’un excès d’ion ayant un m/z rapproché.
CHM 2971 H06
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
Cycle des fonctions de la trappe ionique pour l’analyse MS-MS
Voltage RF
A
Longueur d’onde
multifrequence
Ionization
B
Ejection > m/z
Longueur d’onde
multifrequence
C
Longueur d’onde
activation par collision
CHM 2971 H06
Activation par collision et
application de longueur d’onde
d’excitation
Accumulation des ions
fragments
VDC
Modulation axiale
Act. Coll.
(cible)
Balayage de m/z
Ejection < m/z
(cible)
55
Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
Analyse du digest trypsique de la
protéine recombinante tPA.
Spectre de masse conventionnel
Isolation du précurseur avec éjection
ascendente puis descendante de VRF
(gauche). Balayage lent permettant
une meilleure résolution isotopique de
m/z 878.4 (droite).
Spectre d’ion fragments de m/z 878.4
obtenu lors de l’application de la
fréquence d’excitation aux électrodes
terminales. La durée d’excitation est de
30 ms (qz: 0.306)
CHM 2971 H06
http://www.abrf.org/ABRFNews/1996/September1996/sep96iontrap.html
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Spectrométrie de masse
† Analyseur – Trappe ionique
Un avantage significatif de la
trappe ionique est la possibilité
d’effectuer l’analyse d’ions
fragments consécutifs
Selection du
precurseur
Dissociation
Analyse des
ions
fragments
Selection
d’ions
fragments
http://www.currentseparations.com/issues/16-3/cs16-3c.pdf
CHM 2971 H06
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Exercises de révision
† Notions de base
Vrai ou Faux?
• Le patron isotopique dépend de la composition élémentaire d’un ion?
• Le patron isotopique dépend de la technique d’ionisation utilisée?
• Le pic monoisotopique est toujours le plus abondant parmi l’enveloppe
isotopique?
• Le pic monoisotopique correspond à l’ion ayant la plus petite valeur
m/z parmi l’enveloppe isotopique?
• La distribution isotopique dépend de la charge d’un ion?
• La charge d’un ion peut être déterminée à partir de la distance entre
deux pics isotopiques?
CHM 2971 H06
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Exercises de révision
† Techniques d’ionisation
{
{
{
Decrivez le mode d’opération et les caractéristiques de la
technique MALDI.
Quelle est le role de la matrice lors de l’ionisation
MALDI?
Decrivez comment les ions sont formés durant
l’ionisation par nébulisation électrostatique
(electrospray)?
CHM 2971 H06
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Exercises de révision
† Techniques d’ionisation
o Le spectre de nébulisation électrostatique (ions positifs) d’une protéine inconnue
obtenu sur un appareil à haute résolution apparaît plus bas. L’ion monoisotopique
correspondant aux espèces ioniques multiplement chargés est indiqué pour
chaque pic ainsi que l’enveloppe isotopique pour l’ion a ~ m/z 1425.
y
x
1200.1
100
1140.1
80
1085.9
1341.2
1036.6
60
991.6
40
1519.8
1628.3
950.3
20
0
500
1424.914
1266.7
1753.5
912.3
700
900
1100
1300
m/z
1500
1700
1900
a) Déterminez la masse moléculaire (monoisotopique) de la protéine et indiquez
directement sur le spectre ci-dessus la charge des différents ions.
b) Quel est l’origine des pics x et y indiqués sur le spectre et quelles seraients
leurs valeurs m/z prévues?
c) Quel type d’analyseur aurait été utilisé pour obtenir ce spectre?
CHM 2971 H06
60
Exercises de révision
† Analyseurs
{
{
{
{
{
{
Quelles sont les différences entre l’analyseur à temps
d’envol linéaire et avec réflectron?
Quelle est la vitesse d’un ion simplement charge de la
Leu-enkephaline m/z 556.5 après son accélération sous
un champ électrique de 10 kV?
Combien de temps prendra cet ion pour franchir une
distance de 1 m sous l’effet du champ électrostatique
avant d’atteindre le détecteur?
Donnez une brève explication du fonctionnement du
quadripole?
Quels sont les avantages du quadrîpole simple et triplequadripole?
Expliquez le fonctionnement de la trappe ionique pour
l’isolation d’ion précurseur et l’analyse des fragments
correspondants?
CHM 2971 H06
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