Diagnostic Update Juillet 2009

Juillet 09
Diagnostic
Update
Au cœur du diagnostic…
Les tests IDEXX RealPCR™
Des réponses définitives avec la PCR en temps réel
Le laboratoire de diagnostic moléculaire d’IDEXX vous propose des tests de PCR (Polymerase Chain Reaction) en temps
réel pour un accès facile et abordable de la technologie PCR
en routine. Vos résultats sont disponibles en 2 à 4 jours.
Avec les tests IDEXX RealPCR™, vous pouvez compter sur :
 La dernière innovation de la technologie PCR. La
PCR en temps réel est réalisée dans un système clos
avec des temps d’analyse courts, ce qui permet ainsi
de limiter le nombre de faux positifs.
 Des réponses rapides. Vos résultats sont disponibles
en 2 à 4 jours afin d’avancer rapidement dans votre
diagnostic différentiel.
 Des prix abordables et un tarif dégressif en fonction du
nombre de tests PCR et de leur association en bilans.
Qu’est-ce que la PCR ?
La PCR est une technique de laboratoire au cours de laquelle des molécules d’ADN ou d’ARN sont extraites du
spécimen d’un patient, incorporées dans un milieu réactionnel et soumises à plusieurs cycles de chauffage et de
refroidissement. Si le spécimen contient de l’ARN, l’ARN est
dans un premier temps converti en ADN complémentaire
avant la PCR. A chaque cycle, la quantité d’ADN cible de
séquence connue – s’il est bien présent dans le spécimen
de départ – est doublée; au final, on obtient de l’ADN amplifié avec un facteur de multiplication de l’ordre du milliard.
Un test PCR diagnostique indique la présence de virus, de
rickettsie, de bactérie, de parasite ou de champignon en
détectant l’ADN amplifié de l’organisme concerné dans le
spécimen du patient.
PCR
Polymerase Chain Reaction
Extraction
Leucocytes
Ici Spécimen = sang EDTA
ADN

Amplification
Séparation de l’ADN double hélice
en 2 monobrins complémentaires
(dénaturation)
A
Cycles d’amplification
{

C
B
Séquence cible
spécifique
Les amorces se lient
à une séquence
cible spécifique
(hybridation)
Séquences
cibles doublées
PCR conventionelle: visualisation des produits PCR après migration électrophorétique sur gel d'agarose
PCR en temps réel: mesure de la fluorescence pour la détection des
produits PCR positifs
Quels sont les avantages de la PCR en temps réel ?
Au cours d’une PCR en temps réel, le produit réactionnel
contient des sondes fluorescentes marquées qui vont se lier
avec l’ADN amplifié, ce qui entraine une libération de florescence au fur et à mesure que l’ADN amplifié s’accumule.
Puisque l’ADN amplifié ne quitte jamais le milieu réactionnel, les résultats sont disponibles rapidement et les risques
de contamination sont diminués.
La PCR en temps réel est considérée comme un outil diagnostique de biologie moléculaire très sensible et très précis. IDEXX vous propose des tests PCR, individuels ou associés dans des bilans, sur un seul et même spécimen. Les
résultats des tests IDEXX RealPCR™, sont disponibles en 2
à 4 jours.
La réalisation de toutes les réactions en système clos (un
seul tube réactionnel) combinée à des contrôles rigoureux,
un équipement ultramoderne et une évaluation constante
de la qualité vous garantit des résultats fiables en toute
confiance.
Quand dois-je utiliser la technique PCR comme outil
diagnostique ?
La technique PCR est un excellent outil diagnostique pour
confirmer une infection en détectant la présence d’agents
pathogènes chez des animaux malades.
Comme pour tout examen complémentaire, la PCR doit
néanmoins être associée à d’autres outils diagnostiques et
les résultats doivent toujours être interprétés à la lumière des
signes cliniques et des autres résultats de laboratoire.
å
 Dénaturation
La sonde spécifique de la séquence
cible contient un fluorophore émetteur
et un fluorophore supresseur; la sonde
n'est pas encore liée à l'ADN. Le supres-
ç
seur (gris) à côté de l'émetteur (rouge)
Les tests PCR permettent-ils de différencier les germes vaccinaux et infectieux ?
Pour la plupart des vaccins inactivés, la PCR en temps
réel fait la différence entre une vaccination et une
infection.
Elle ne détecte pas la présence d’anticorps, mais directement celle de l’agent pathogène. La détection d’ADN/ARN
viral est possible durant quelques semaines après la vaccination avec un vaccin vivant modifié pendant que le virus
vaccinal se réplique. Nous recommandons un intervalle de 3
semaines après la dernière vaccination pour éviter la détection d’ADN vaccinal. En outre dans le cas de la parvovirose
canine, nos protocoles différencient directement et spécifiquement les ADN des souches vaccinale et infectieuses.
empêche l'apparition d'une fluorescence
mesurable.
 Hybridation
é
L'amorce et la sonde se lient à l'ADN; le
supresseur (gris) à côté de l'émetteur
(rouge) empêche toujours l'apparition
d'une fluorescence mesurable.
+ Elongation
è
L'activité 5'-3' exonucléase de la Taq polymérase entraîne l'hydrolyse de la sonde; les 2 fluorophores sont séparés l'un
de l'autre; la fluorescence de l'émetteur
peut maintenant être mesurée.
PCR en temps réel: les différentes étapes
Que signifient un résultat positif et négatif ?
Un résultat positif confirme la présence de l’agent pathogène dans le spécimen analysé. Un résultat négatif peut avoir
plusieurs significations :
• l’agent pathogène est absent
• l’agent pathogène est présent en quantité inférieure
à la limite de détection du test
•l’agent pathogène ne peut être détecté par le
protocole PCR utilisé
•la qualité du spécimen est mauvaise.
Quelle est la limite de détection des tests PCR?
La limite de détection d’une méthode varie en fonction du
protocole utilisé. La définition la plus communément acceptée est une concentration d’acide nucléique cible ou un
nombre de molécules qui peut encore être amplifié dans
95% des expériences.
Que signifient la sensibilité et la spécificité diagnostiques?
La sensibilité diagnostique est la probabilité d’obtenir un résultat positif au sein d’une population infectée. En d’autres
termes, plus la sensibilité est élevée, plus la probabilité
d’identifier correctement tous les spécimens positifs et de
ne pas manquer le diagnostic est élevée. La spécificité diagnostique est la probabilité d’un vrai résultat négatif quand
le tests PCR sont réalisés dans une population non infectée.
Une spécificité élevée indique que le test ne détecte vraiment que ce que l’on recherche. Ainsi une forte spécificité
augmente la probabilité qu’un résultat positif soit bien dû à
l’agent pathogène recherché.
Si le test revient négatif, mais que l’infection est toujours
suspectée, quand dois-je tester à nouveau ?
Cela dépend de la présence ou de l’absence de signes cliniques, de la nature de l’agent pathogène suspecté et du
test utilisé. Il est généralement recommandé d’attendre une
période entre 2 et 4 semaines.
Comment doit-on envoyer les prélèvements ?
Il est préférable d’utiliser le service coursier en respectant
les conditions d’envoi. Envoyer les prélèvements dans un
deuxième emballage à l’intérieur du colis en cas de dommage durant le transport. Du matériel absorbant doit être
inclus dans l’emballage secondaire en cas de fuites ou de
bris dans l’emballage primaire.
Quel prélèvement dois-je envoyer ?
La nature du prélèvement varie en fonction de l’agent pathogène et des symptômes observés. En cas de doute, il
est préférable de contacter le conseil médical du Laboratoire IDEXX Alfort au 0 810 433 99 (01 43 53 83 00).
Qui dois-je contacter pour toutes mes questions ?
Contacter le conseil médical du Laboratoire IDEXX Alfort au
0 810 433 99 (01 43 53 83 00).
Est-il possible d’effectuer d’autres tests PCR sur le prélèvement déjà envoyé ?
Les spécimens originaux sont conservés une dizaine de
jours, mais l’ADN extrait est conservé plus longtemps.
D’autres tests additionnels peuvent ainsi être requis sur demande à partir de l’ADN conservé.
Dois-je lancer d'autres tests de laboratoire en dehors du test
PCR ?
Généralement, oui. Car la PCR est un examen complémentaire qui s’inscrit dans la démarche diagnostique comme
tout autre examen complémentaire ; il doit donc être lancé
en parallèle avec d’autres tests diagnostiques : en fonction
de l’infection recherchée, il peut s’agir d’une NFS, d’une sérologie, d’un examen urinaire, etc.
Comment et combien de temps les spécimens doivent-ils
être conservés ?
Les liquides biologiques (péritonéaux, pleuraux, sang EDTA,
fèces) et les écouvillons peuvent être conservés 3 jours au
réfrigérateur (4°C).
Si aucun examen histologique n’est prévu, les tissus frais
peuvent être conservés au congélateur à – 20 °C jusqu'à
une semaine et envoyés congelés. Les tissus inclus dans la
paraffine sont acceptés.
La transition entre les tests PCR conventionnels et en
temps réel, ainsi que la création de nouveaux bilans va
optimiser votre démarche diagnostique avec :
1/ Un niveau élevé
d’information
La recherche simultanée de
plusieurs agents pathogènes
augmente la probabilité de
détecter les infections.
2/ Des résultats plus rapides
Grâce à des délais techniques
plus courts.
3/ Des économies réalisées
La technologie PCR en temps
réel nous permet de vous
proposer des bilans
plus économiques.
Diagnostic
Update
Bilans PCR
Bilan Diarrhées Chiots
• Parvovirus canin PCR
• Paramyxovirus canin PCR (Maladie de Carré)
• Coronavirus canin PCR
• Bilan Diarrhée C (Giardia ELISA + bactériologie)
Bilan Coryza Chats
• Chlamydophila felis PCR
• Herpesvirus félin 1 PCR
• Calicivirus félin PCR
• Mycoplasma felis PCR
Bilan " Maladies à tiques "
• Babesia canis PCR
• Ehrlichia/Anaplasma PCR
• Ehrlichia canis sérologie (IF)
• Borrelia (C6 qualitatif)
Franck Guetta, DVM
Directeur de la publication
Laboratoire IDEXX Alfort
Laboratoire IDEXX Alfort
Parc d‘activité du Val de Seine
17 Allée Jean-Baptiste Preux
94 140 Alfortville
Tél : 0 810 433 999 (01 43 53 83 00)
Fax: 0 810 433 990
[email protected] · www.idexx.fr
FR-090-0609