PM3 - gdr-Miv
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MiFoBio2016 Les sources de lumière en microscopie Quentin Beaufils & Sébastien Marais Sommaire - Rappels sur les propriétés de la lumière - La microscopie plein champ et ses sources - Rappel du principe d’un microscope plein champ - Les différentes sources - La microscopie à balayage et ses sources - Rappel du principe d’un microscope confocal - Principe de fonctionnement d’un laser - Les différents types de laser - La microscopie non-linéaire et ses sources - Rappel du principe d’un microscope multi-photon - Les différents types de laser pulsés Rappels sur les propriétés de la lumière L’optique Optique quantique : Définition rigoureuse du photon. Applications futures en imagerie? Photonique : Introduction de l’aspect corpusculaire de la lumière : optique statistique. Détection de photon unique (TCSPC). Electromagnétisme : Onde électromagnétique : spectre, Interaction lumière – matière. Laser, fluorescence, microscopie non-linéaire. Optique ondulatoire : Lumière modélisée par des ondes : diffraction, interférences, polarisation… Interféromètre, microscope à contraste de phase… Optique géométrique : Lumière modélisée par des rayons : lois de la réflexion et réfraction. Systèmes optiques simples (lentille, microscope, télescope…). La puissance / l’intensité optique • La puissance (en watt) d’une source lumineuse est la quantité d’énergie délivrée en une seconde. • L’intensité (W/m2) est la puissance par unité de surface perpendiculaire à la direction de propagation. • Par exemple, allumer un feu avec une loupe : Intensité au sol de la lumière provenant du soleil : ≈ 100W/m2 Puissance récupérée sur une loupe de surface 0.075 m2 : 7,5W. Focalisée sur une surface de 10-6 m2 : 7,5MW/m2 • Un pointeur laser : typiquement 1 à 10 mW, intensité au centre : 1000 W/m2 . Mesure : Œil (très mauvais). Puissance-mètre (penser à préciser longueur d’onde) La longueur d’onde / fréquence Longueur d’onde λ Célérité c Période T=λ/c Fréquence : ν=1/T=c/λ Limite du pouvoir de résolution d’un microscope de l’ordre de λ/2 (diffraction) Unité utilisée en spectroscopie moléculaire : le nombre d’onde, le plus souvent exprimé en cm-1 = nombre d’oscillations contenues dans 1 cm : (cm-1) Mesure : Œil, Lambda-mètre, spectromètre. (cm) La polarisation La polarisation est l’orientation transverse de ce qui oscille (le champ électrique pour la lumière). Polarisation circulaire • Modifie la façon dont l’onde interagit avec un milieu ou une autre onde. • Peut être contrôlée : Lame à retard : modifie la polarisation sans changer l’intensité Polariseur : Filtre une polarisation spécifique Mesure : Polariseur La cohérence Capacité d’une onde à interférer avec elle-même : Homogénéité spatiale et temporelle du flux de photons. • Cohérence spectrale / temporelle : monochromatisme/impulsions courtes. ∆t ∆ν ≥1 • Cohérence spatiale : focalisation / collimation. ∆x ∆k ≥ 1 Mesure : interféromètre, mesure du M² (voir partie 3) La microscopie plein champ et ses sources La microscopie plein champ Le microscope plein champ est le microscope à fluorescence le plus simple optiquement et le moins coûteux. La source doit avoir les propriétés suivantes : - Large spectre - Puissante (excitation efficace des molécules fluorescentes) - Non cohérente (pour éviter interférences) - Non polarisée (non nécessaire) - Illumination du champ entier Lampe Tungstène-Halogène - Lampes à incandescence utilisées par la microscopie en transmission Filament en Tungstène chauffé (à 2500-3000°C) par un courant électrique le traversant -> Lumière émise par incandescence En présence d’halogènes (Brome et iode) et d’O2, une réaction chimique à lieu afin de redéposer les vapeurs de Tungstène sur le filament : Augmente durée de vie de la lampe Permet de conserver une intensité d’illumination constante dans le temps Lampe Tungstène-Halogène + Spectre large -> lumière blanche + Ampoule à faible coût - Puissance faible dans la partie visible du spectre -> ne convient pas pour la microscopie de fluorescence Fonctionnement des lampes à décharge - Lampes plus intenses que les lampes à incandescence Bulbe (ampoule) composé de quartz, qui peut résister aux fortes pressions (jusqu’à 50 atm) et températures de fonctionnement Ampoule remplie d’un gaz rare et éventuellement d’autres composés Fonctionnement des lampes à décharge 1) Envoi d’une décharge électrique à travers un gaz, permettant de l’ioniser (plasma) - généralement Argon ou Xénon 2) Vaporisation d’autres composés peut avoir lieu -> enrichissement du spectre d’émission 3) Le courant électrique déplace des électrons qui entrent en collision avec les molécules du plasma 4) Des électrons des atomes excités changent d’orbitales. En se désexcitant, l’électron redescend à une orbitale inférieure et un photon est émis, dont la longueur d’onde dépend de la molécule. Gr Gr +V Gr Me Me -V Fonctionnement des lampes à décharge Un ballast permet de générer la tension de départ, puis de maintenir un courant constant au sein de la lampe (résistance négative de l’arc électrique). Tension électrique nécessaire : Allumage – 5 à 30 kV En opération – 20 à 100 V Photo d’un ballast Fonctionnement des lampes à décharge Anode - Cathode L’usure des lampes est liée : - aux attaques chimiques des composés (sur le quartz et les électrodes) aux variations de température aux vibrations aux fortes tensions appliquées Lampes HBO 50W et 103W - La pression interne élevée (>50psi) rend ces lampes dangereuses en cas de rupture de l’enveloppe de quartz - L’usure des électrodes (cathode) peut entraîner une instabilité de l’arc Lampe à vapeur de mercure - Source historique pour la microscopie de fluorescence Le mercure (Hg) génère une lumière composée de longueurs d’onde principalement dans l’UV, mais également dans le bleu/vert. Le verre en quartz peut être dopé pour couper l’UV (200-300 nm, génération d’ozone) et pour couper/amplifier certaines longueurs d’onde visibles HBO : H pour « Hg » ; B pour « Brightness », O pour « unforced cooling » Lampe à vapeur de mercure - Le mercure génère une lumière composée de longueurs d’onde principalement dans l’UV, mais également dans le bleu/vert. Le verre en quartz peut être dopé pour couper l’UV (200-300 nm, génération d’ozone) et pour couper/amplifier certaines longueurs d’onde visibles Ar Ar +V Ar Hg Hg -V Lampe à vapeur de mercure - Spectre composé de pics d’intensité importants Pics d’intensité correspondant aux longueurs d ’onde de sondes utilisées Avantages : forte puissance Inconvénients : durée de vie courte (DC, pas de cycle halogène), risque à l’utilisation, spectre non homogène Lampe à vapeur de mercure Puissance : importante pour certaines longueurs d’onde. Décroit rapidement avec l’âge. Durée de vie : courte (300 heures), décroit ensuite jusqu’à extinction Spectre : peu linéaire avec pics de plus forte intensité Stabilité : Décroît rapidement en puissance dans le temps (80% après 100h) Cohérence : lumière non cohérente Polarisation : lumière non polarisée Modulabilité : source non modulable Entretien : Remplacement de l’ampoule + alignement Risque : Explosion (forte pression), Hg très toxique Lampe à Xénon (Xe) - Spectre visible homogène proche de la lumière du soleil (CRI > 90) CRI = Color Rendering Index Permet des études de quantification Puissances importantes dans l’IR (développement de sondes fluo IR ?) Puissance inférieure au mercure dans le bleu et le vert XBO : X pour « Xe » ; B pour « Brightness », O pour « unforced cooling » Lampe à Xénon - Spectre visible homogène proche de la lumière du soleil (CRI > 90) CRI = Color Rendering Index Permet des études de quantification Puissances importantes dans l’IR (développement de sondes fluo IR ?) Puissance inférieure au mercure dans le bleu et le vert Xe +V Xe Xe -V Lampe à Xénon Puissance homogène sur l’ensemble du spectre visible : Lampe à Xénon Puissance : relativement faible sur l’ensemble du spectre (correcte entre 450 et 550 nm) Durée de vie : environ 1200 heures Spectre : linéaire (permet des quantifications de fluorescence) Stabilité : Décroît lentement en puissance dans le temps Cohérence : lumière non cohérente Polarisation : lumière non polarisée Modulabilité : source non modulable Entretien : Remplacement de l’ampoule + alignement Risque : Explosion (forte pression) Lampe Metal-halide La lampe Metal-Halide (halogénures métalliques) est la source de référence sur les microscopes actuels Basé sur une lampe à mercure à laquelle on ajoute des halides métalliques : atomes d’halogènes (fluorine, chlorine, bromine, iodine, astatine) liés à un métal (lanthanides) et formant les sels. Ces halides, sous l’effet de l’arc électrique, émettent des photons dont la longueur d’onde dépend de leur formule. Lampe Metal-halide Le spectre d’émission d’une lampe Metal-Halide est composé de la superposition du spectre du mercure et des spectres des halides métalliques présents. Le fonctionnement d’une lampe Metal-halide est très proche d’une lampe à mercure. Utilisation d’un ballast numérique (AC) : Réduction du bruit de fonctionnement et de l’usure des électrodes Ar Ar +V Ar Hg Hal -V Lampe Metal-halide Le spectre d’émission d’une lampe Metal-Halide est composé de la superposition du spectre du mercure et des spectres des halides métalliques présents. Ces halides, sous l’effet de l’arc électrique, émettent des photons dont la longueurs d’onde dépend de leur formule. Lampe Metal-halide Les lampes Metal-Halide (Ref HXP chez OSRAM par exemple) possèdent un réflecteur elliptique permettant de focaliser la lumière dans une direction. Permet d’injecter la lumière dans une fibre optique : + Pas d’alignement nécessaire / moins de pertes + Lampe déportée du microscope (moins de perturbation thermique) Lampe Metal-halide Les lampes Metal-Halide (Ref HXP chez OSRAM par exemple) possèdent un réflecteur elliptique permettant de focaliser la lumière dans une direction. Permet d’injecter la lumière dans une fibre optique : + Pas d’alignement nécessaire / moins de pertes + Lampe déportée du microscope (moins de perturbation thermique) - Détérioration de la fibre optique « Consommable » à ≈ 900€ Durée de vie de 4000-6000 heures Lampe Metal-halide Puissance : relativement élevée sur l’ensemble du spectre Durée de vie : 2000 heures Spectre : plus linéaire que le mercure (plus de puissance entre 450 et 550 nm) Stabilité : Décroît lentement en puissance dans le temps (80% après 1000h) Cohérence : lumière non cohérente Polarisation : lumière non polarisée Modulabilité : source non modulable (boitiers équipés de filtres de densité neutre) Entretien : Remplacement de l’ampoule Risque : Explosion (forte pression), Hg très toxique LEDs - LED = Light-Emitting Diode Basé sur un matériau semi-conducteur Dopage avec impuretés (P (n-type) ; B (p-type)) Recombinaison de paire électron/trou Dispositif de petite taille Mécanisme d’allumage (ON/OFF) + rapidité LEDs Conceptual Understanding of Semiconductor Basics: Holes, Doping, and P-N Junctions (YouTube) LEDs Conceptual Understanding of Semiconductor Basics: Holes, Doping, and P-N Junctions (YouTube) LEDs LEDs - Le matériau semi-conducteur utilisé pour la fabrication d’une LED lui confèrera des propriétés spectrales particulières : Ex : GaN (Gallium nitride) – SiC (Silicon carbide) – ZnSe (Zinc selenide) – etc… LEDs - Le matériau semi-conducteur utilisé pour la fabrication d’une LED lui confèrera des propriétés spectrales particulières : Ex : GaN (Gallium nitride) – SiC (Silicon carbide) – ZnSe (Zinc selenide) – etc… LEDs - Allumage / Extinction rapide et possible en fonctionnement Puissance maximale atteinte immédiatement (pas de temps de chauffe) Couplage possible en direct ou par fibre optique Mécanisme d’allumage (ON/OFF) + rapidité (quelques µs) Pas de filtres UV / IR Moins de génération de chaleur LEDs - Possibilité d’obtenir des LEDs blanches de 2 manières : - Utilisation d’une LED UV qui excite un phosphore capable d’émettre une lumière blanche Combinaison de plusieurs LEDs dans une même enveloppe spectrale LEDs - Longue durée de vie Grande stabilité dans le temps - Faible consommation LEDs Puissance : dépendant de la longueur d’onde (du semi-conducteur utilisé) Durée de vie : > 10 000 heures Spectre : Bande spectrale fine, couplage de plusieurs LEDs pour obtenir une lumière blanche Stabilité : Stable pendant toute la durée de vie (< 100 000 heures) Cohérence : lumière non cohérente Polarisation : lumière non polarisée Modulabilité : source modulable en puissance. Allumage/Extinction rapide Entretien : Aucun Risque : Aucun Fournisseurs : Excelitas (X-Cite LED), CoolLED, Lumencor, Sutter Instrument, Prior, etc … LEDs - Fournisseurs Fournisseurs : Excelitas (X-Cite LED), CoolLED, Lumencor, Sutter Instrument, Prior, etc … CoolLED Excelitas X-Cite 120LED pE 300 X-Cite TURBO pE 4000 Prior Lumen 1600-LED HPX LED Lumen 300-LED Sutter Instrument Lumencor Spectra X Sola TLED LEDs - Fournisseurs Lumencor Spectra X LEDs - Fournisseurs CoolLED pE 4000 Les différentes sources – Comparatif Puissance des différentes sources en fonction de la longueur d’onde : Quelle source choisir ? Quelle source pour votre microscope ? Puissance : Metal-Halide (mais développement important des LEDs) Durée de vie : LEDs Spectre : Metal-halide (spectre large), couplage de plusieurs LEDs Stabilité : LEDs Cohérence : aucune source Polarisation : aucune source Modulabilité : LEDs Risque : LEDs Les différentes sources – Métrologie - Mesure de la puissance au travers d’un filtre - Mesure à l’installation Mesure à intervalle régulier Matériel : puissance-mètre - Mesure de la stabilité dans le temps Mesure de la puissance au cours du temps (se baser sur le temps d’acquisition) Matériel : puissance-mètre - Contrôle de l’alignement de la lampe Pour les lampes HBO et XBO uniquement. Pas nécessaire pour les sources fibrées. Matériel : lame de fluorescéine / lame Chroma Les différentes sources – Recyclage - Les différents lampes utilisées en microscopie, du fait des composés toxiques utilisés pour leurs fonctionnements, doivent être triées pour être recyclées. http://www.recylum.com/ La microscopie à balayage et ses sources La microscopie confocale Le microscope confocal à balayage a pour caractéristique une collecte point par point de l’information sur l’échantillon. - Nécessite une forte focalisation de la lumière > Cohérence - Puissance importante pour collecter suffisamment de photons Le laser Le laser repose sur le phénomène d’émission stimulée : • Un système capable de fluorescer (atome, molécule, semi-conducteur…). • La présence d’un photon à sa longueur d’onde de fluorescence le force à émettre un second photon identique (émission stimulée). Energie de pompage Faisceau laser Milieu amplificateur Miroir semi-réfléchissant Propriétés spatiales TEM00 Optique gaussienne : Les faisceaux gaussiens constituent une base de solutions de l’équation d’onde. La distribution transverse d’intensité est une fonction gaussienne (courbe en cloche de la loi normale) Modes de Hermite-Gauss Modes de Laguerre-Gauss Le mode TEM00 est le mode par défaut d’un laser. La largeur du faisceau est définie par la demi largeur à 1/e² de ce profil d’intensité. Propagation d’un faisceau laser • Un faisceau ne peut pas être concentré en un point infiniment petit. • Un faisceau diverge toujours à l’infini. Un logiciel libre pratique : GaussianBeam Le facteur de qualité du faisceau M² Faisceau multimode : superposition de plusieurs modes = moins bonne cohérence spatiale (divergence supérieure, moins bonne focalisation) Le M² du faisceau est défini par sa divergence par rapport au faisceau monomode TEM00 : M²>1 M²=θ/ θ00 M²=1 Un faisceau de mauvaise qualité peut être filtré au détriment de la puissance. Les Lasers à gaz Le milieu amplificateur est un gaz contenu dans un tube transparent. Le laser Hélium-Néon : le premier laser à gaz. • Longueurs d’onde possibles : 543 (vert), 594(jaune) , 605, 612 (orange), 633(rouge), 1150 et 3390 nm (infrarouge) • Peu utilisé aujourd’hui en microscopie Les lasers à solides Le milieu amplificateur est une matrice cristalline dopée avec des ions. • Milieu amplificateur large bande : accordabilité et/ou impulsions ultra brèves. • Faisceau de très bonne qualité (M² <1.1). • Haute puissance (plusieurs dizaines de Watt). • Très bonne stabilité de puissance. • Instabilité de pointé. • Relativement chers. • Encombrants (refroidissement actif). Exemples : Laser Titane:Saphire, lasers DPSS (Nd:YAG), Lasers à fibre… Laser à fibre : • Potentiellement plus puissant. • Moins bonne qualité de faisceau. • Souvent moins cher. Les lasers DPSS Diode Pumped Solid State Laser • Plusieurs longueurs d’onde possibles pour différents ions • Souvent doublés en fréquence. Exemple : Nd:YAG 1064 nm doublé pour du vert à 532 nm (pointeurs laser verts) Image : photonics.com Les diodes laser Le milieu amplificateur est un semi-conducteur. • Bon marché. • Peu encombrant. • Modulation rapide (plusieurs MHz). • Mauvaise qualité de faisceau. • Limité en puissance (< 100 mW). • Astigmatisme. Exemple pour la microscopie en fluorescence : iChrome MLE-S de Toptica : • 50 mW à 405, 445, 488, 515 et 640 nm. • M² non précisé. La microscopie non-linéaire et ses sources La microscopie multiphoton La microscopie multi-photonique nécessite l’absorption par un même fluorochrome de 2 photons simultanément, et donc l’utilisation d’une source très spéciale. - Source émettant dans l’IR Photons regroupés sous forme d’impulsions Fréquence de répétition suffisamment importante La microscopie non-linéaire Effet non linéaire : l’intensité de fluorescence n’est pas proportionelle à l’intensité laser : résolution 3D. Les lasers à impulsion Délivre un train régulier d’impulsions cohérentes ultra-courtes Powerlite furie de Continuum Grandeurs typiques : • Durée des impulsions quelques 100 fs. • Cadence 50 MHz (20 ns). • Puissance moyenne quelques Watt . Image : LaserSelection Les sources non linéaires : Le laser Ti:Saphir Laser le plus couramment utilisé pour les expériences de microscopie non linéaire. Cristal de saphir dopé au titane. • Large bande de longueur d’onde : 650 – 1100 nm, idéal pour les impulsions courtes. • Doit être pompé par un laser vert. • Très accordable si utilisé en continu. • Exemple : Chameleon de Coherent Les sources non linéaires : Les laser Yb Laser Yb + OPO -> 680-1300 nm + 1040 nm - Spectra Physics Insight DeepSee Cohérent Chameleon Discovery - L’OPO permet d’accorder la longueur d’onde sur plusieurs centaines de nm, ou de produire une deuxième longueur d’onde plus élevée (CARS) Sources documentaires http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/ http://www.microscopyu.com/ http://www.olympusmicro.com/ http://www.osram.fr http://lumencor.com http://www.coolled.com
