Cours de Mécanique cellulaire Tronc commun du Master Biophysique Moléculaire et Cellulaire UE UMBSR310 Gladys Massiera Laboratoire des Colloïdes Verres et Nanomatériaux (LCVN- UMR5587) [email protected] Brefs rappels sur la structure du cytosquelette - les trois réseaux de biopolymères - les protéines réticulantes - les moteurs moléculaires Plan du cours Cours de Mécanique cellulaire Intérêt de la mécanique cellulaire Exemples de forces subies ou exercées par les cellules: - surfaces souples ridées par des cellules - mobilité des macrophages - comportement sous flux d'un leukocyte Quelques définitions de mécanique - Définitions: contraintes, déformations, modules élastiques, viscosité - Types de sollicitation: cisaillement, élongation... Méthodes de mesure des propriétés mécaniques de la cellule - Mesure à l'échelle cellulaire (étirement entre deux plaques, micropipettes) - Mesure à partir d'une sonde locale extra-cellulaire (AFM, pincettes optiques et magnétiques) - Mesure à partir d'une sonde locale intra-cellulaire (sondes magnétiques, microrhéologie à deux points) - Microscopie de force de traction (Mesure des forces exercées par les cellules sur une surface) - Microfluidique (Comportement sous écoulement et/ou confinement) Modèles de la mécanique cellulaire (Résultats et Interprétations) - Modèle sol-gel - Modèle de tenségrité - Modèle du milieu vitreux mou - autres modèles... Lien avec l'adhésion 1. Intérêt de la mécanique cellulaire La cellule est un objet très dynamique. Les contraintes et les déformations mécaniques qui résultent de cette dynamique (polymérisation des filaments d'actine, des microtubules, phénomènes de catastrophes, dynamique des moteurs moléculaires...) jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques: - contraction cellulaire - étalement - migration - 'wound healing' - division - adhésion (transduction mécanique) - passage au travers une constriction - résistance au flux hydrodynamique dans les capillaires sanguins - ... L'environement mécanique agit également sur la régulation de l'expression de certaines protéines et gènes, et sur la différentiation. 1. Intérêt de la mécanique cellulaire A. Motilité des cellules Rappel: Principe de l'action et de la réaction Pour se déplacer, la cellule exerce donc des forces. La réaction du support lui permet d'avancer. 1. Intérêt de la mécanique cellulaire B. Forces exercées par la cellule: mise en évidence Cellules (chick heart fibroblasts) sur des substrats de silicone (couche mince et déformable) Harris, A. K., Science, 208, p.177 (1980) 1. Intérêt de la mécanique cellulaire C. Forces subies par la cellule: cas du flux hydrodynamique 1. Intérêt de la mécanique cellulaire D. Questions soulevées par ces observations expérimentales Qu'est ce qui permet de sentir, de transmettre, et d'exercer ces forces? Comment les forces cellulaires sont elles régulées? Comment les mesurer? 2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette A. Les trois réseaux de biopolymères Lp ~ 10 µm Lp ~ 1 µm Lp ~ 1 mm 2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette B. Les protéines réticulantes Leur rôle: associer les filaments entre eux pour former des réseaux structurés et interconnectés qui procurent à la cellule une résistance mécanique, un cytosquelette, et donc la possibilité de générer des forces. Fagots de filaments (fimbrin, fascin, α-actinine...) Arp 2/3: Filamine: 2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette C. Les moteurs moléculaires Les moteurs associés aux filaments du cytosquelette: Myosi nes associées aux filaments d'actine Dynéine, et Kinésines associées aux microtubules Autres moteurs (Cf cours Andréa Parmeggiani) Les enzymes (polymérases...) Les pompes à ions 3. Quelques définitions de grandeurs mécaniques Remarque sur le module d'Young: Le module d'Young décrit le module élastique en volume du corps considéré (il ne tient pas compte de la géométrie de l'objet déformé (fléchissement d'une poutre, cisaillement d'un cube...) Dans le cas d'une élongation pure, le module d'Young est directement donné par le rapport entre la contrainte et la déformation. Dans le cas de déformation plus complexe et pour des solides isotropes, le module d'Young peut être exprimé en fonction des modules de compression et de cisaillement. 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques Cellule entière Tsai, M. A. (1993) La réponse mécanique est fonction des échelles: Desprat, N. (2005) Fernandez, P. (2006) Sonde externe Alcaraz, J. (2003) Kas, J. (2004) Fredberg, Ingber, Wang (Harvard) Isabey (Créteil) Gallet (SMC) Sondes intracellulaires F Sackman E., Bausch A. Wirtz, D. Crocker, J. C. -- de temps -- de longueur sondée -- des forces appliquées … - zone cellulaire sondée -- type cellulaire -- statistique 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques Biophys. J. (2004) A. Mesure à l'échelle cellulaire Desprat, Fernandez, Biophys. J. (2006) Cas de l'étirement entre deux plaques J(t) = ε(t)/σ0 J(t) =A tα Cas de l'AFM 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques B. Mesure avec une sonde locale extra-cellulaire Cas des pincettes optiques Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A.. F0= 2 π R G(f) h(θ) x0 Balland (2002, 2005) Cas des pincettes optiques: études sur des globules rouges Pincettes magnétiques B = M. ∇ F Magnétorhéometrie Optique: le principe Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A.. (RGD peptide) RGD H Molecular Biology of the Cell, Alberts B. et al. x(t) - adhésion des particules - magnétisation - application du couple diamètre 4.5 µm M Cellule H jusqu’à 15 Gauss, ω: 0.1 to 1000 Hz Filaments d’actine Nos méthodes: (1) Laser tracking microscopy (LTM) Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A.. Particule magnétique 4.5 µm High resolution (0.1-1 nm) High speed (10 µs) ULN Laser Optical isolator P λ/4 Conjugate plane 5mW, λ = 633 nm CO2 37°C control Dark field M ~ 450 Quadrant photodiode Beam stop Specimen plane 100 x oil objective En appliquant un couple oscillatoire: H (t) d (t) x (t) t σ = G * (ω ) γ Mesure directe de la rhéologie dynamique de cellules vivantes G*(ω) Milieu viscoélastique! G * (ω ) = G′ (ω ) élastique + i G′′ (ω ) visqueuse 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques C. Mesure avec une sonde locale intra-cellulaire Traquer des particules intracellulaires? Granules lipidiques! Microscopie à contraste interférentiel Condition de culture (37°C, 5% CO2) 10 µm NIH 3T3 Fibroblaste J774A.1 Macrophage Sondes idéales: - particules endogènes - très réfringentes - quasiment sphériques (a ≈ 0.3 µm) Méthode non-invasive TC7 Endothéliale F9 Carcinoma Mesurer les fluctuations du réseau à l’intérieur d’une cellule Le mouvement des particules endogènes est traqué sous microscopie à contraste interférentiel NIH 3T3 Fibroblast 5 μm 1μm • La cellule est filmée dans son plan médian pendant 30mn (107 positions 2D). • Les cellules sont maintenues dans les conditions de culture (37°C, et 5% CO2) Two-point microrheology (TPM) Standard microrheology ∆ r 2 (ω ) = k BT π ω aG′′ (ω ) G′ (ω ), G′′ (ω ) Phys. Rev. Lett. 85, p. 1774, 2000 Levine A.. et al. Phys. Rev. Lett. 85, p. 888, 2000 Crocker J. C. et al. Two point microrheology ⇒ positive correlation ⇒ no correlation Dα β (r ,τ ) = ∆ r (t ,τ )∆ rβ (t ,τ ) δ (r − R (t )) i α j ij r (τ ) 2 i ≠ j ,t 2 2r = Drr (r ,τ ) a Milieu Continu Drr diminue en 1/r sur des distances interparticules comprises entre 2 et 8 µ m Le cytosquelette peut être considéré comme un milieu continu sur les échelles de longueurs explorées. Two-point microrheology in cells DIC 37°C, pH=7.2 Tracking resolution 5-10 nm Probed length scale ~ 2-8 µm ω ~ 4-2.103 rad.sec-1 10 µm Non-invasive method probing intracellular mechanics tracers ~ 0.3µm 3 a < r (t, τ ) > (µ m ) -2 10 Control -3 10 TPM -4 2 10 quasi-3D continuum on 2-8 µm -5 10 ATP depletion -6 10 -4 10 -2 10 τ (sec.) 10 0 Consensual power law rheology 4 Methods G*(ω) = A ωβ + B ω3/4 Intracellular probe TPM β1 = 0.24 β2 = 0.16 3/4 LTM (phagocytozed bead) Extracellular probe LTM-MTC LTM (RGD externally attached beads) B. D. Hoffman, G. Massiera, et al. (2006), PNAS , 103, p.10259 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques D. Force traction microscopy 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques D. Force traction microscopy 4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques E. Microfluidique Development of a measurement technique: Coupled measure of deformation and pressure drop variations Entry of a RBC and a WBC in time Abkarian, Faivre, Stone, PNAS (soumis) (2005) 40 Rapid prototyping with Soft lithography An elastic polymer (PDMS) mold of a relief designed on a Si wafer by photolithography is cured and placed on a substrate to form virtually any shape for channels. Multiphase fluid flow Pressure or Syringe pump High speed camera + Objective http://gmwgroup.harvard.edu/ 5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique A. Modèle sol-gel Ce modèle considère le cytosquelette de filaments d'actine comme analogue à celui d'un gel qui passerait d'un état liquide (sol) à un état gel par une transition liée à la polumérisation induite des filaments. Elle s'appuie sur les travaux de Janmey Stossel (1990) sur le comportement mécanique de solution d'actine reconstituée. B. Modèle de tenségrité Ingber, Wang et al. Harvard. Le principe qui est issu du domaine de l'architecture, est celui d'un équilibre entre des éléments sous compression (microtubules) et des éléments sous tension (F-actine). 5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique C. Modèle du milieu vitreux mou (soft glassy material) PRL, Fabry 2001 PRE, Sollich, 1998 Principe: Les contraintes appliquées sur le milieu sont relaxées par des fluctuations non-thermiques, décrites par une température effective reliée à l'exposant de la loi de puissance obtenue pour les modules élastiques en fonction de la fréquence. Ce modèle correspond à un état figé des éléments mésoscopiques du milieu dans un désordre structural pour lequel les puits de potentiels sont distribués de façon exponentielle. 5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique D. Autres modèles Power-law rheology: very broad distribution of relaxation time Power-law rheology is ATP independent: relaxation modes are thermally activated Ingredients of the model: G', G" (arb. units) Summary of experimental results: 0 10 -1 10 ATP depletion -2 10 -1 10 1 10 10 -1 ω (rad.sec ) 3 In vitro model of crosslink actin: M. L. Gardel, PRL 96 088102 (2006). Rief Science(1997), Furuike FEBS(2001) ? Can we obtain a broad distribution of relaxation times in a sheared network of unfoldable crosslinkers? Network under shear at T=0 Force distribution: γ = 1000 sec-1 γ = 7 sec-1 γ = 1.5 P(τ), relaxation time distribution Maxwell modes superposition weighted with P(τ) ⇒ G’(ω), G’’(ω) B.Hoffman, G. Massiera, J. C. Crocker, to appear in PRE (2007), available on http://arxiv.org/pdf/physics/0504051 6. Lien avec l'adhésion Les adhésions focales permettent à la cellule pour s'ancrer sur la matrice extracellulaire et pour transmettre les forces de l'ECM vers la cellule et vice versa Associées aux fibres de contraintes, les adhésions focales permettent aussi de générer une précontrainte cellulaire qui influence fortement la réponse mécanique cellulaire: elle devient plus rigide sous tension. 6. Lien avec l'adhésion 6. Lien avec l'adhésion Mise en évidence du lien entre précontrainte et module élastique du cytosquelette Articles relatifs au cours de mécanique cellulaire: 1- Etirement entre deux plaques 2- Etirement entre deux plaques (régime non-linéaire) 3- Pincettes optiques et étirement entre deux plaques 4- Pincettes magnétiques (force appliquée) 5-'Magnetic twisting cytometry' (couple appliqué) 6- Microrheologie à deux points 7- Microscopie à traction de force (utilisation des billes fluo) 8- Microscopie à traction de force (fléchissement des plots) 9- Microscopie à traction de force (fléchissement des plots) 10- Microfluidique appliqué à l'étude de la mécanique de globules rouges 11- Modèle sol-gel 12- Modèle de Tenségrité 13- Modèle du milieu vitreux mou 14- Modèle à partir de la dénaturation de protéines réticulant le réseau 15- Rôle de l'environnement mécanique 16- Rôle de l'environnement mécanique (mesure de forces de traction) 17- Transduction mécanique et adhésion