Le stress oxydatif et les antioxydants

Le stress oxydatif et les antioxydants
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Définitions
Le rôle de l’oxygène
Les radicaux libres
Les systèmes de défenses antioxydants
Le stress oxydatif et ses pathologies
Systèmes de mesures des antioxydants
Dr. Philippe Tacchini, EDEL THERAPEUTICS, PSE-B, 1015 LAUSANNE
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Définitions
• Stress oxydatif: déséquilibre entre les oxydants et les
antioxydants, en faveur des oxydants, potentiellement
conduisant à des dégâts structuraux et fonctionnels.
• Radical libre: espèce chimique possédant un électron
célibataire sur sa couche périphérique.
• Antioxydant: toute substance présente en faible
concentration relative à un substrat oxydable et qui
diminue ou prévient l’oxydation de ce substrat.
2
Rôle de l’oxygène
Production d’oxygène à partir de l’eau par les cyanobactéries (-1500 millions): O2=1%
Formation de la couche d’ozone qui réduit les Ultra-Violets et favorise le
développement de la vie sur terre (-500 millions): O2=10%
Apparition de l’homme (-5 millions): O2
Respiration
Systèmes
antioxydants
= 21%
ROS
Energie
Protection
et
Régulation
Dégâts
3
Métabolisme de l’oxygène
O2 + 4 e- + 4 H+
O2 + 1 eO2.- + O2.-
2 H2 O
O2
.-
2-5% « fuite » qui produit des
superoxydes
+ 2H+
SOD
H2O2 + O2
Production de peroxyde
d’hydrogène catalysée par la SOD
H2O2 + Fe2+
.
H2O2 + H2O2
2 H2O + O2
H2O2 + 2GSH
CAT
GPx
Réduction de l’oxygène,
respiration
OH + Fe 3+ + -OH
H2O + 2GSSH
Production d’hydroxyle
par la réaction de Fenton
Dismutation catalysée par la
CAT
Réduction par le Glutathion
et la Glutathion peroxydase
4
Principaux radicaux libres du stress
oxydant
O2.- =
radical superoxyde
HO2. =
radical perhydroxyde
.
OH =
radical hydroxyle
RO2. =
radical peroxyle, R= substrat organique
RO. =
radical alkoxyle
5
Structures des atomes d’oxygène des
intermédiaires réduits de l’oxygène
Oxygène
Formes
déprotonées
.
.
O -- O
Formes
protonées
Degrés
D’oxydation
(0) (0)
Radical
superoxyde
-
O--O
.
Preoxyde
d’hydrogène
-
O--O
Radical
hydroxyle
-
.
O
-
Eau
O
2-
HO--O
.
HO--OH
.
OH
HOH
(-1) (0)
(-1) (-1)
(-1)
(-2)
6
.
Le radical hydroxyle: OH
• Potentiel standard d’oxydoréduction très élevé
(E.o OH/H2O =2.34 V à pH7) = pouvoir oxydant
très élevé = avide d’électrons.
• Constante de vitesse élevée (k = 1010 mol-1L s-1)
= forte réactivité = réagissent sur leur lieu de
production de façon non spécifique (diffusion:10
nm et faible durée de vie:10-6 s).
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Mode d’action du radical hydroxyle
Le radical hydroxyle peut oxyder un substrat selon 3 modes d’action
différents:
1. Arrachement d’un électron:
.
2+
OH + Fe
Fe
3+
-
+ OH
2. Arrachement d’un atome d’hydrogène sur un substrat organique RH:
.
.
(R. + O2
RO2.= radical peroxyle
OH + RH
R + H2O
3. Addition sur une double liaison
.
.
C-C(OH)
OH + C=C
qui initie la
peroxydation lipidique =
réactions en chaîne =
dégradation membraire)
8
Dégâts des radicaux libres
Cibles
Effets
Résultats
Protéines
Diminution de l’
activité enzymatique
Lipides
Dégâtes membranaires
& oxydation
Aldéhydes
ADN
Mutation
Hydrates de
carbone
Modification des
récepteurs
Altération
de la structure et
des fonctions
cellulaires
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Sources de radicaux libres
Endogène
• Mitochondries
• Phagocytoses
• Xanthine oxydase
• Métaux de transition
• Peroxysomes
• Exercice
• Inflammation
• Choc
ischiémique/reperfusion
Exogène
• Cigarette
• Radiation ionisantes
• Pollutions diverses
• Rayonnement UV
• Produits chimiques &
médicaments
• Ozone
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Systèmes de défenses antioxydants
Exogène
Endogène
• Enzymes antioxydants
– Détoxification des radicaux
libres
• Différentes molécules
– Glutathion
– Acide urique
– Protéines (ex. transferrin)
• Systèmes indirects
• Antioxydants
– Donneurs d’électrons
pour neutraliser les
radicaux libres
– Activateur de gènes
antioxydants et/ou de
systèmes de réparation
– Systèmes enzymatiques
induits (ARE)
– Système de réparation
(ADN)
11
Système enzymatique antioxydants
2 O2.- + 2 H+
2 H 2 O2
H2O2 + 2 GSH
SUPEROXYDE DISMUTASE
SOD
CATALASE
CAT
O2 +2 H2O2
GLUTHATION PEROXYDASE
GSH PEROXYDASE
H2O2 + O2
2 H2O + GSSG
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Rôle du système enzymatique dans
le vieillissement et le cancer
•
La surexpression (50x) du géne humain CAT dans la souris
(mitochondrie) est responsable pour l’augmentation de la
longévité (20%). (Schriner et al., science 2005, 1106653).
•
Les résultats obtenus chez la mouche (Drosophila
transgénique) montrent que l’extension de la longévité par la
SOD est modulée par le sexe et le patrimoine génétique.
(Spencer et al. Aging Cell, 2003).
•
Le polymorphisme génétique de la SOD chez l’homme et la
femme est associé à une augmentation du risque du cancer de
la prostate et du sein respectivement, en relation avec le niveau
du système de défense antioxydant. (Li et al. Cancer Res.2005,
Cai et al. Breast cancer res. 2004).
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Molécules antioxydantes et
systèmes indirects endogènes
•
Glutahtion
•
ARE
– Antioxidant Responsive
Elements = éléments qui
régulent l’expression des
génes red-ox.
•
Systèmes de réparation
– Jusqu’à 500’000 lésions
sur l’ADN par cellule et
par jour (ROS,
radiations, drogues,
mutagènes) .
– Tripeptide: Glu-Cys-Gly
•
Acide urique
– Produit d’oxydation des
purines
•
Protéines
– Transferrin (lie les ions
métalliques)
14
Antioxydants fourni par
l’alimentation
•
•
•
•
Vitamin C
Vitamin E
Carotenoids
Polyphénols
– Flavonoides
– Catechins
– Isoflavones
• Glucosinolates
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Vitamine E and C
• Vitamine E
• Vitamine C
– 4 tocophérols + 4
tocotriénols
– Liposolubles
(membranes)
–
–
–
–
Hydrosoluble (cytosol)
Recycle la vitamine E
Activité oxydante
Instable (lumière et T.)
– Graines céréales,
noix et les huiles
– Agrumes et légumes
verts
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Caroténoides et glucosinolates
• Caroténoides
• Glucosinolates
– Rôle antioxidants
– Présent dans + de
600 plantes (fruits et
légumes colorés)
– Peuvent induire les
ARE
– Plantes crucifères,
Choux, broccolis, etc
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Polyphénols des plantes
• Rôle protecteurs et propriétés antioxydantes
• Flavonoides
– Onions, pommes
• Catéchins
– thés
• Isoflavones
– soya
• Anthocyanes
– Baies, raisins, vin rouge
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Rôle des antioxydants exogènes
• Rôle protecteur des antioxydants contenus dans les
fruits et légumes (cancer, maladies cardiovasculaires).
• Niveau d’antioxydants plus haut dans le plasma
associé à une réduction de risque de développer
certaines maladies.
• Les antioxydants préviennent l’oxydation in-vitro.
• Rôle des antioxydants exogènes in vivo: parfois
positifs, parfois sans effets et parfois négatifs! (trop
d’antioxydants = pro-oxydants! Principalement avec
des antioxydants synthétiques!).
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Exemples de résultats positifs, négatifs ou sans
effets dans le cas d’études cliniques sur la
prévention du cancer
Antioxydants
testés
Etudes
n=
Résultats
B-car, vitE, Se
Linxian CPS
30’000
Réduction
B-car., vitE, Se
ATBC
30’000
Augmentation/
poumon
Réduction
prostate
B-car.
WHS
40’000
Sans effets
B-car, vitE, Se,
vitC, Zn
SUVIMAX
13’000
Réduction
hommes,
sans effets
femmes
B-car.vitE, vitC
HPS
21’000
Sans effets
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Equilibre entre les oxydants et les
antioxydants = pas de stress oxydatif
Oxydants
ROS endogène
+
ROS exogène
Système de défense
antioxydante:
SOD, CAT, GSH-Px
Vit. C/E, caroténoides,
flavonoides
21
Déséquilibre entre les oxydants et
les antioxydants = stress oxydatif
Oxydants
ROS endogène
+
ROS exogène
Système de défense
antioxydante:
SOD, CAT, GSH-Px
Vit C/E, caroténoides,
flavonoides
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Le stress oxydatif joue un rôle clé dans
plusieurs pathologies
Iésions des tissus
Stress
oxydatif
Induction du système
de défense
antioxydant
Stade avancé =
mort cellulaire
Stage précoce avec
réponse inadaptée du
système antioxydant
Effets
négatifs
Neutralisation
du stress
oxydatif
Pas
d’aggravation
Aggravation
de la maladie
Site d’intervention
23
Pathologies associées au stress
oxydatif
•
•
•
•
•
•
•
•
Vieillissement
Système cardio-vasculaires
Cancer
Système nerveux et maladies neurodégénératives
Vision
Troubles rénaux
Maladies respiratoires
Maladies inflammatoires
Plus de 100 pathologies
24
Vieillissement et maladies associées
• Théorie du vieillissement de Hartman (1956) basée
sur le stress oxydatif
– La production de ROS et la réponse des cellules
au stress oxydatif pourrait jouer un rôle crucial
dans le vieillissememt (Balaban et al., Cell, 2005).
• Cancer
– L’oxydation de l’ADN cause des mutations
– Observations épidiémologiques et études
cliniques
25
2 exemples du rôle du système
antioxydant dans le cancer
Cancer de la prostate
Chez les porteurs d’une
variation génétique de la
SOD, un niveau
d’antioxydant réduit dans
le plasma est associé à un
risque de développer le
cancer de la prostate 10 x
plus élevé.
Cancer des seins
Une augmentation du
risque du cancer du sein
est associée à un
polymorphisme de la
SOD et un stress
oxydatif élevé ou un
faible système de
défense antioxydant.
Li et al. Cancer Res.2005
Cai et al. Breast cancer res. 2004.
26
Le système antioxydant et les
maladies associées au vieillissement
Maladies cardio-vasculaires
• Hypertension
• Diabètes type II
• Arrêt cardiaque
• Accident coronarien
• Accident vasculaire
cérébral
Maladies dégénératives
• Maladies d’Alzheimer
• Parkinson
• Maladies neurologiques
• Dégénération maculaire
• Cataracte
• Sclérose en plaque
• Arthrite
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Le contrôle du stress oxydatif pourrait jouer un rôle
clé dans le vieillissement et plusieurs maladies
Plusieurs niveaux d’interventions possibles
- Régulation de la génération des radicaux libres
- Contrôle des radicaux libres produits
- Régulation des systèmes de réparation
- Rôle des antioxydants endogènes et exogènes
Importance des systèmes
de mesures des antioxydants
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Systèmes de mesures des
antioxydants = défi analytique
Antioxydants in vitro
Antioxidants présents dans les
aliments = complexe mélange
d’antioxydants = effets de
synergie
Antioxydants in vivo
Multiples et complexes
systèmes antioxydants =
multiples rôles et forte
régulation du système
Test de l’activité antioxydante
totale d’un échantillon au lieu
d’isoler chaque antioxydant
séparément
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Exemples de tests de la capacité
antioxydant totale
•
Définir une activité antioxydant totale n’est pas réaliste, sans spécifier
les conditions de mesures telles que par exemple, la pression, la
température, le pH et tous les paramètres de la mesure.
•
Plusieurs tests permettent de mesurer la capacité antioxydant
présente dans l’échantillon, en fonction des conditions pour la mesurer.
•
La majorité des méthodes de tests peuvent être divisées en 2
catégories:
– Basées sur le transfert d’un atome d’hydrogène (HAT)
• Mesure cinétique en présence d’un générateur de radical, un substrat oxydable
et la substance à tester, exemples: ORAC, TRAP
– Basées sur le transfert d’un électron (ET)
• Une seule réaction d’oxydoréduction avec la mesure de l’oxydant sous forme
réduite comme indicateur: exemples: TEAC, FRAP, DPPH
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Exemples de tests antioxydants
• ORAC = Oxygen Radical Absorbance Capacity
• TRAP = Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter
• TEAC = Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
• FRAP = Ferric ion Reducing Antioxidant Parameter
• DPPH = 2, 2-di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl
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Développement d’un nouveau test de la capacité
antioxydante par électrochimie
Systèmes HAT et ET
• Utilisation de plusieurs
réactifs.
• Relativement long et
laborieux.
• Risques de
contamination élevé.
Mesure électrochimique
• Mesure directe, sans
utilisation de réactifs.
• Rapide, le résultat est
obtenu en moins de 20
secondes en une seule
manipulation.
• Pas de contamination
croisée, grâce à
l’utilisation d’électrodes
jetables.
32
Validation du test par électrochimie
en cours
600x10
-9
Green tea extract
160
500
Current / A
Cranberry juice
Green tea drink
Orange juice
300
Apple juice
200
Orange juice,
5x diluted
100
PBS
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Potential / V
Mesure de la capacité antioxydant de
plusieurs échantillons de boissons
1.0
PAOx / nW
140
400
120
100
80
60
70
75
80
85
90
95
100
105
Age/years
Mesure de la capacité antioxydante
d’échantillons de sang en fonction de
l’âge (patients sous traitement)
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Prochain développements
•
Mesure par électrochimie du niveau du système de défense
antioxydant comme bio-indicateur du stade de développement
de plusieurs maladies associées au stress oxydatif.
– Le système de défense antioxydant varie avant, pendant et
après plusieurs maladies et conditions pathologiques.
– Rôle des antioxydants dans la prévention des maladies et le
suivi de leur traitement.
– Analyse des conditions qui modifie le niveau du stress
oxydatif.
•
Mesure de la capacité antioxydant des aliments et suppléments
alimentaires et de leur effet in vivo.
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