Biocapteur optique de Glucagon sur silicium poreux

B IOCAPTEUR OPTIQUE DE GLUCAGON SUR SILICIUM POREUX :
E TUDE PRELIMINAIRE
Mohamed Dribek, Jonathan Barrault, Nathalie Lorrain, Séverine Haeseart,
Mohammed Guendouz et Lazhar Haji
Laboratoire Foton, CNRS UMR 6082, Enssat, BP 80518, 22305 Lannion cedex
[e-mail]
R
ESUME
Dans le but de développer un biocapteur à base de nanostuctures photoniques en
silicium poreux, nous avons déterminé des conditions de nanostructuration du silicium
favorable à l’immunodétection optique d’une hormone hypoglycémiante, le glucagon.
En plus, nous avons étudié la première étape de biofonctionnalisation ; la silanisation.
M
OTS - CLEFS : silicum poreux; guid d'onde; microcavité; biocapteur optique.
1. I
NTRODUCTION
Un biocapteur est un dispositif analytique constitué d’un biorécepteur immobilisé à la surface
d’un transducteur permettant la qualification et/ou la quantification de l’interaction analyte/sonde.
En effet, le transducteur transforme le phénomène biochimique résultant de cette interaction en un
signal mesurable. Selon le type de biorécepteur (enzyme, anticorps, ADN, cellule ou
microorganisme) ou celui du transducteur (électrochimique, mécanique ou optique) on distingue
plusieurs classes de biocapteurs [1]. Nos travaux portent en particulier sur les biocapteurs d’affinité
à transduction optique sur silicium poreux (SiP). Cette étude s’inscrit dans la perspective de réaliser
de nanostructures photoniques en SiP permettant, après biofonctionnalisation, une détection optique
directe d’une molécule biopharmaceutique « le Glucagon ». De nos jours, la seule technique
analytique appliquée pour la détection de cette molécule est la radioimmunologie qui est une
méthode à la fois indirecte et couteuse. Nous présentons dans cet article les études préliminaires de
réalisation de nanostructures photoniques et en particulier les microcavités.
2. E
TUDE DE L ’ ELARGISSEMENT DES PORES DU SILICIUM POREUX
La formation du silicium poreux, matériau constituant le transducteur du biocapteur, permet
l’obtention de structures poreuses ayant une grande surface spécifique et un indice de réfraction
modulable. De plus, la compatibilité à la fois avec les milieux biologiques et la technologie VLSI
ainsi que la réactivité des surfaces poreuses rendent la matrice de SiP favorable aux interactions
biomoléculaires [2,3]. Pour infiltrer cette matrice poreuse par des molécules biologiques, la taille
des pores doit être ajustée, en particulier du fait que lorsque les molécules sont en solution, elles
forment des colloïdes et génèrent des phénomènes stériques rendant leur infiltration délicate.
Pour la réalisation d'un biocapteur de Glucagon, la sonde choisie est un anticorps
antiglucagon de type IgG
1
et de taille égale à 17 nm. Pour une infiltration maximale de cette sonde
nous avons étudié la réalisation par voie électrochimique de matrices poreuses ayant des pores de
diamètre supérieur à 50 nm [4]. Pour cette partie d’expérimentation, nous avons utilisé deux types
de substrat de Si: type P
+
(5.10
-3
ȍ cm) et type N
+
(10
-2
ȍ cm). Nous avons étudié l’effet de la
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concentration du HF dans l’électrolyte et de la densité de courant d’anodisation sur la taille des
pores déterminée à partir des analyses au MEB. Nous avons constaté que pour les deux types de
substrats, l’augmentation du courant d’anodisation permet d’augmenter la taille des pores, alors que
l’augmentation de la concentration d’HF entraîne un effet contraire. Dans les meilleures conditions,
le diamètre moyen des pores obtenus sur le substrat de type P
+
est égal à 55 nm avec 55% des pores
de diamètres au-dessus de 50 nm. Sur le substrat de type N
+
, le diamètre moyen des pores est égal à
85 nm avec 91% des pores de diamètres au-dessus de 50 nm. A priori, la taille de ces pores
permettra l’infiltration de la sonde IgG avec une efficacité meilleure sur Si type N
+
.
3. S
ILANISATION DE LA SURFACE DES PORES
Les sondes infiltrées à l’intérieur des pores doivent être fixées à la surface des cristallites.
Cette étape d’immobilisation nécessite l’adaptation chimique de la surface des cristallites. En effet,
juste après sa préparation, la surface interne du SiP est constituée essentiellement de groupements
SiH, SiH
2
et SiH
3
[5] dont nous avons vérifiés la présence par spectroscopie IR. Cette surface à la
fois peu stable et hydrophobe n’est pas favorable pour travailler en milieu aqueux. Ce qui nous a
amené tout d’abord à l’oxyder afin d’obtenir des groupements Si-OH, Si=O et Si-O-Si puis à fixer
d’une manière covalente des silanes à groupements réactifs aminés (silanisation). Le suivi de
l’évolution de la modification chimique de la surface des cristallites a été effectué par spectroscopie
IR et par réflectométrie dans l’UV-visible et proche IR. L’oxydation du SiP a entraîné le
déplacement de son spectre de réflectance vers les basses longueurs d’ondes (blue shift). Cette
variation est due à la diminution de l’indice de réfraction de la couche poreuse suite à l’oxydation
des cristallites de silicium. L’effet de la silanisation entraîne au contraire le déplacement du spectre
vers les grandes longueurs d’onde (red shift). Ceci est dû à la fixation des silanes (n = 1.46) sur la
surface interne des pores remplaçant en partie l’air.
Ces résultats ont permis de vérifier la fixation des silanes aminés à la surface oxydée des
cristallites de silicium poreux. Cette étape est nécessaire pour achever les étapes suivantes
d’immobilisation de la sonde biologique (IgG1).
4. R
EALISATION DE NANOSTRUCTURES PHOTONIQUES EN S I P
Le dispositif que nous cherchons à réaliser pour une application de biodétection exploite les
propriétés optiques d’une microcavité ou d’une structure guidante.
Une microcavité est constituée d’une couche active (d’indice n
1
) séparée par deux miroirs de
Bragg chacun constitué par l’alternance d’un nombre de couches d’indice différents n
1
(porosité 1)
et n
2
(porosité 2). La longueur d’onde de résonance de cette microcavité est très sensible à la
variation d’indice de réfraction de la couche active. Ainsi, la présence de glucagon (n= 1.42) dans
cette couche peut être détectée. En tenant en compte la taille de la molécule, celle des pores
constituant les couches poreuses de la microcavité doit être ajustée. En utilisant les résultats obtenus
précédemment, nous avons réalisé des microcavités en utilisant deux densités de courant
respectivement égales à 40 mA/cm² (couche d’indice n
1
) et 30ma/cm² (couche d’indice n
2
).
La figure 2 montre les micrographies correspondant à la surface de couches poreuses pour ces
deux conditions ainsi qu’une coupe transversale de la microcavité.
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Fig. 1 : Micrographies MEB de la
surface de couches SiP sur substrat
de type N
+
(a) 40mA/cm² ,
(b) 30 mA/cm² ,
Micrographie de la tranche d’une
microcavité. (c)
(a) (b) (c)
Nous avons également étudié une structure guidante constituée de trois couches : une couche
poreuse d’indice n
1
pour le guidage sépare deux couches de confinement d’indice n2 (avec n2<n1).
La couche de confinement supérieure sert de couche sensible à l'espèce biologique. La couche
guidante devra donc être réalisée avec des pores imperméables à la sonde. Pour satisfaire cette
condition et d’après les résultats précédents, nous avons retenu les conditions suivantes pour réaliser
cette structure sur un substrat de type P
+
: couche d’indice n
1
: J = 2mA/cm² - HF 10% et couches
n’indice n
2
: J= 50ma/cm² - HF10%. La figure 2 montre des micrographies MEB correspondant à
ces conditions.
Fig. 3 : Micrographies MEB de la
surface de couches SiP sur substrat
de type P
+
.
(a) 2mA/cm²
(b) 50 mA/cm².
Micrographie de la tranche d’un
guide formé de trois couches (c)
(a) (b) (c)
C ONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les études réalisées nous ont permis de définir des conditions d’élaboration des couches de
silicium poreux adaptées pour notre application de biodétection, ainsi que la réalisation de la
première étape de biofonctionnalisation (silanisation). Nous avons aussi commencé la conception et
la réalisation de nanostructures en SiP autre que la simple couche telle que les structures guidantes
et les microcavités. Les prochaines étapes seront donc de compléter l’étude de ces structures, d’en
exploiter d’autres, de les fonctionnaliser et d'évaluer leurs capacités à détecter le glucagon.
R
EFERENCES
[1] Lowe C.R. “Overview of biosensor and bioarray technologies”. In handbook of biosensors and biochips,
Eds. Marks R.S.et al, Wiley-Interscience, pp. 7-22, 2007.
[2] Zhu Ziqiang, Zhang Jian, Zhu Jianzhong. “An Overview of Si-based Biosensors”. Sensor Letters. 3 (2),
pp. 71-88, 2005.
[3] Canham L.T. et al., “Derivatized porous silicon mirrors: Implantable optical components with slow
resorbability”. Phys. Stat. sol. (a) 182, pp. 521-225, 2000.
[4] H. Ouyang et al. ,”Macroporous silicon microcavity for macromolecule detection”. Adv. Funct. Mater.
15, pp. 1851-1859, 2005.
[5] Janshoff A et al., “Macroporous p-type silicon Fabry-Perot Layers. Fabrication, characterisation, and
application in biosensing”. J Am. Soc. 120, pp12108-12116, 1998.
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