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ENSCM_S7_BIOCH_TP_Biotechnologies_Parcours_App_Introduction
Created by jvignon
Année 2016-2017
TP
PCR
Purification
Electrophorèse
Enzymologie
Date
07-11-2016
09-11-2016
22-11-2016
23-11-2016
PRELIMINAIRES
Le vocabulaire utilisé pans le polycop ne vous est pas forcément familier. Vous
trouverez un glossaire (également accessible sur la plateforme pédagogique) vous
fournissant les définitions correspondant aux termes employés. Lors de leur première
apparition dans le texte ces termes sont indiqués par la présence d'un astérisque (*).
Les TP devront être préparés avant la séance.
Pour chaque atelier, vous trouverez des éléments utiles (polycop de TP, protocoles
de certaines mesures, …) à sa préparation sur la plate-forme pédagogique (Vignon,
Deuxième année étudiants, Chimie Organique et Biologique, tronc commun-TP Biochimie,
dossier Documentation). En particulier, il est important de consulter la notice
d'utilisation des micropipettes.
Durant les séances, chaque binôme doit préparer ses propres solutions (pas de
partage des solutions par paillasse ou de solutions communes pour plusieurs binomes).
CONSIGNES DE SECURITE

Dans la salle de travaux pratiques, le port de la blouse et des lunettes de protection
est obligatoire.
Les produits toxiques (acrylamide, bromure d’étydium (BET), β-mercaptoéthanol,
solution de nickel) doivent être manipulés avec des gants (latex ou nitrile). En cas de
renversement de produits toxique, cela doit être signalé à l’enseignant responsable et la
paillasse doit être immédiatement nettoyée avec du Sopalin ou une éponge. Quand les
produits doivent être manipulés sous hotte, cela sera indiqué par l’enseignant.
Chaque binôme dispose d’une demie paillasse pour effectuer son travail, ce qui lui
laisse la place nécessaire pour s’organiser de manière optimale.
GESTION DES DECHETS
Tous les consommables (pointes de micro pipettes, tubes plastiques (Eppendorf,
Falcon, hémolyse), cuvettes de spectrophotomètre, …) ont un coût très élevé et le travail
doit être planifié pour limiter leur consommation et donc minimiser la production de
déchets.
A chaque atelier correspond la production de déchets spécifiques qui seront collectés
dans les conteneurs appropriés. Leur localisation est indiquée dans la salle de TP.
Les poubelles noires sont exclusivement réservées au déchets en verre. Ne pas y jeter
les cuvettes de spectrophotomètre en plastique.
DEROULEMENT DE LA SEANCE DE TP
La salle de TP sera fermée de 12 h 30 à 13 h 30. Il est essentiel d’organiser
votre travail en tenant compte de cette interruption.
La séance débute par une interrogation écrite de 10 à 15 minutes, comportant
3 à 5 questions se rapportant à la théorie, à la préparation de la manipulation et la

connaissance des prés requis. Ces questions ont pour but : (1) de déterminer
comment la partie théorique a été assimilée ; (2) vérifier que l'expérience qui doit
être menée est bien comprise et préparée.
Dans le polycopié, pour chaque atelier, vous trouverez les prés requis à
connaître et une liste non limitative de questions qui sont susceptibles d'être posées.
Le matériel commun (balances, spectrophotomètres, pH-mètres, …) doit être
maintenu parfaitement propre. En cas de manquement à cette règle, la note de
manipulation de l'ensemble du groupe de TP sera diminuée.
PRESENTATION ET CONTENU DU COMPTE RENDU
Un seul compte rendu de l'ensemble des ateliers sera remis. Au format pdf, il
devra être envoyé par mail au plus tard le 16 décembre à 17 heures. Le compte-
rendu devra refléter le travail personnel de chaque binôme. Tout CR remis après
l'heure limite ne sera pas pris en compte et sera noté zéro.
Le compte-rendu sera organisé de la manière suivante
- NOMS ET PRENOMS, N° DE BINOME
- INTITULE ET DATE DU TP
- SECTION RESULTATS
- ANALYSE-DISCUSSION DES RESULTATS
- INTEGRATION DE L'ENSEMBLE DES ATELIERS
Le compte rendu ne devra pas exéder 15 pages, y compris figures et annexes
Dans la rédaction du compte rendu, ne pas reprendre les parties "méthodologie" et
"principe de l'expérience" ou "introduction" qui sont suffisamment développées dans le
poly ou en cours. Les notions théoriques nécessaires (vues en cours ou en TD (se rappeler
de la 1ère année et des enseignements des matières autres que la biochimie)) devront être
utilisées dans l'analyse et la discussion des résultats.

Le compte-rendu débutera directement par la partie "résultats". Dans celle-ci, doivent
impérativement figurer :
- 1- La préparation des solutions et tampons nécessaires (pesée, volume, pH, ...). Il est
inutile de recopier les tableaux du polycopié qui ont été vérifiés par les enseignants ;
- 2- L’explication claire et formelle des calculs ;
- 3- La compilation des résultats complets sous forme de tableaux les plus simples possible.
Dans ces tableaux, on doit retrouver les données expérimentales brutes initiales ;
- Quand les résultats proviennent de données graphiques (enregistrement d'activité
enzymatique, gel d'électrophorèse ...) celles-ci doivent être fournies avec le compte rendu ;
- Lors de la réalisation de graphiques, il est important de choisir une échelle qui permette
une bonne lisibilité (ce n'est pas obligatoirement le graphe qui occupe toute la page ...). Un
même graphe peut comporter plusieurs courbes qui devront être clairement différenciées
les unes des autres (symboles visibles de couleurs ou de forme différentes identifiés par
une légende). Chaque graphe doit comporter des échelles clairement définies avec les
unités et une légende sur chaque axe.
- Les courbes rendant compte des points expérimentaux ne doivent pas être définies par
une interpolation ou une équation polynomiale de degré n. Les courbes doivent refléter le
phénomène observé en fonction des équations qui le gouvernent.
- Dans tous les cas où cela est possible, un calcul d'erreur devra être effectué.
La partie résultats sera suivie par une interprétation critique des résultats et une
discussion. Cette discussion devra vous permettre de mettre en exergue les conclusions
que vous tirez du TP : avantage des techniques, simplicité, précision etc... Elle doit surtout
être la place d'un examen critique de vos résultats (il n'y a pas que les "erreurs de manip"
pour expliquer des "résultats bizarres" ou "aberrants"). Il est important de prendre en
compte que l'analyse de vos résultats ne porte que sur une seule détermination sans
reproduction. Il vous manque donc la mesure de la variabilité de vos résultats. Dans tous
les cas, la confrontation de vos résultats à ceux des autres binômes vous apportera des
données complémentaires très utiles.
NOTATION DES TRAVAUX PRATIQUES
La note de TP est partagée en trois parties égales :

- La note "pratique" qui prend en compte la préparation du TP, la manière de manipuler
(soin, organisation de la paillasse, méthode, intérêt, questions, ...). Cette note reflète le
comportement individuel sur l'ensemble des séances de travaux pratiques ;
- La note de compte rendu de TP.
- La note d'interrogation écrite en début de séance.
La note définitive remise à la scolarité est la moyenne de ces trois notes.
BUT DES TRAVAUX PRATIQUES
Le but des quatre ateliers qui constituent les travaux pratiques
de biotechnologie est de vous faire aborder l'étude et la
caractérisation d'une protéine du parasite Trypanosoma brucei qui
provoque la maladie du sommeil (voir les liens suivants :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Trypanosoma_brucei ;
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs259/fr/).Cette
protéine, la pyrophosphatase TbVSP1 est une enzyme qui catalyse
l'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate. Elle est essentielle pour
le cycle de vie du parasite et peut donc constituer une cible
thérapeutique pour lutter contre la contamination par le parasite.
Le but des travaux pratiques est de vous faire aborder une technique de biologie
moléculaire qui est devenue essentielle pour l'étude des protéines : l'utilisation de
protéines recombinantes qui permet de faire exprimer les protéines par une souche
bactérienne ou eucaryote afin d'en disposer en grande quantité et de pouvoir la
caractériser. Ces techniques imposent de disposer du gène de la protéine à étudier pour
l'insérer dans un vecteur qui sera transfecté chez un hôte pour le faire exprimer.
- Le premier atelier vous fera aborder la méthode qui permet d'amplifier le gène de
la protéine et de le modifier pour obtenir une protéine recombinante. La modification de la
protéine consiste à ajouter une queue de 6 histidines à l'extrémité C-terminale de la
protéine (queue poly-His). L'adition de cette queue poly-His permet la purification de la
protéine par chromatographie d'affinité IMAC.