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Hivebench
ENSCM_S7_BIOCH_TP_Biotechnologies_Parcours_App_Introduction
Created by jvignon
Année 2016-2017
TP
Date
PCR
07-11-2016
Purification
09-11-2016
Electrophorèse
22-11-2016
Enzymologie
23-11-2016
PRELIMINAIRES
Le vocabulaire utilisé pans le polycop ne vous est pas forcément familier. Vous
trouverez un glossaire (également accessible sur la plateforme pédagogique) vous
fournissant les définitions correspondant aux termes employés. Lors de leur première
apparition dans le texte ces termes sont indiqués par la présence d'un astérisque (*).
Les TP devront être préparés avant la séance.
Pour chaque atelier, vous trouverez des éléments utiles (polycop de TP, protocoles
de certaines mesures, …) à sa préparation sur la plate-forme pédagogique (Vignon,
Deuxième année étudiants, Chimie Organique et Biologique, tronc commun-TP Biochimie,
dossier Documentation). En particulier, il est important de consulter la notice
d'utilisation des micropipettes.
Durant les séances, chaque binôme doit préparer ses propres solutions (pas de
partage des solutions par paillasse ou de solutions communes pour plusieurs binomes).
CONSIGNES DE SECURITE
Dans la salle de travaux pratiques, le port de la blouse et des lunettes de protection
est obligatoire.
Les produits toxiques (acrylamide, bromure d’étydium (BET), β-mercaptoéthanol,
solution de nickel) doivent être manipulés avec des gants (latex ou nitrile). En cas de
renversement de produits toxique, cela doit être signalé à l’enseignant responsable et la
paillasse doit être immédiatement nettoyée avec du Sopalin ou une éponge. Quand les
produits doivent être manipulés sous hotte, cela sera indiqué par l’enseignant.
Chaque binôme dispose d’une demie paillasse pour effectuer son travail, ce qui lui
laisse la place nécessaire pour s’organiser de manière optimale.
GESTION DES DECHETS
Tous les consommables (pointes de micro pipettes, tubes plastiques (Eppendorf,
Falcon, hémolyse), cuvettes de spectrophotomètre, …) ont un coût très élevé et le travail
doit être planifié pour limiter leur consommation et donc minimiser la production de
déchets.
A chaque atelier correspond la production de déchets spécifiques qui seront collectés
dans les conteneurs appropriés. Leur localisation est indiquée dans la salle de TP.
Les poubelles noires sont exclusivement réservées au déchets en verre. Ne pas y jeter
les cuvettes de spectrophotomètre en plastique.
DEROULEMENT DE LA SEANCE DE TP
La salle de TP sera fermée de 12 h 30 à 13 h 30. Il est essentiel d’organiser
votre travail en tenant compte de cette interruption.
La séance débute par une interrogation écrite de 10 à 15 minutes, comportant
3 à 5 questions se rapportant à la théorie, à la préparation de la manipulation et la
connaissance des prés requis. Ces questions ont pour but : (1) de déterminer
comment la partie théorique a été assimilée ; (2) vérifier que l'expérience qui doit
être menée est bien comprise et préparée.
Dans le polycopié, pour chaque atelier, vous trouverez les prés requis à
connaître et une liste non limitative de questions qui sont susceptibles d'être posées.
Le matériel commun (balances, spectrophotomètres, pH-mètres, …) doit être
maintenu parfaitement propre. En cas de manquement à cette règle, la note de
manipulation de l'ensemble du groupe de TP sera diminuée.
PRESENTATION ET CONTENU DU COMPTE RENDU
Un seul compte rendu de l'ensemble des ateliers sera remis. Au format pdf, il
devra être envoyé par mail au plus tard le 16 décembre à 17 heures. Le compterendu devra refléter le travail personnel de chaque binôme. Tout CR remis après
l'heure limite ne sera pas pris en compte et sera noté zéro.
Le compte-rendu sera organisé de la manière suivante
- NOMS ET PRENOMS, N° DE BINOME
- INTITULE ET DATE DU TP
- SECTION RESULTATS
- ANALYSE-DISCUSSION DES RESULTATS
- INTEGRATION DE L'ENSEMBLE DES ATELIERS
Le compte rendu ne devra pas exéder 15 pages, y compris figures et annexes
Dans la rédaction du compte rendu, ne pas reprendre les parties "méthodologie" et
"principe de l'expérience" ou "introduction" qui sont suffisamment développées dans le
poly ou en cours. Les notions théoriques nécessaires (vues en cours ou en TD (se rappeler
de la 1ère année et des enseignements des matières autres que la biochimie)) devront être
utilisées dans l'analyse et la discussion des résultats.
Le compte-rendu débutera directement par la partie "résultats". Dans celle-ci, doivent
impérativement figurer :
- 1- La préparation des solutions et tampons nécessaires (pesée, volume, pH, ...). Il est
inutile de recopier les tableaux du polycopié qui ont été vérifiés par les enseignants ;
- 2- L’explication claire et formelle des calculs ;
- 3- La compilation des résultats complets sous forme de tableaux les plus simples possible.
Dans ces tableaux, on doit retrouver les données expérimentales brutes initiales ;
- Quand les résultats proviennent de données graphiques (enregistrement d'activité
enzymatique, gel d'électrophorèse ...) celles-ci doivent être fournies avec le compte rendu ;
- Lors de la réalisation de graphiques, il est important de choisir une échelle qui permette
une bonne lisibilité (ce n'est pas obligatoirement le graphe qui occupe toute la page ...). Un
même graphe peut comporter plusieurs courbes qui devront être clairement différenciées
les unes des autres (symboles visibles de couleurs ou de forme différentes identifiés par
une légende). Chaque graphe doit comporter des échelles clairement définies avec les
unités et une légende sur chaque axe.
- Les courbes rendant compte des points expérimentaux ne doivent pas être définies par
une interpolation ou une équation polynomiale de degré n. Les courbes doivent refléter le
phénomène observé en fonction des équations qui le gouvernent.
- Dans tous les cas où cela est possible, un calcul d'erreur devra être effectué.
La partie résultats sera suivie par une interprétation critique des résultats et une
discussion. Cette discussion devra vous permettre de mettre en exergue les conclusions
que vous tirez du TP : avantage des techniques, simplicité, précision etc... Elle doit surtout
être la place d'un examen critique de vos résultats (il n'y a pas que les "erreurs de manip"
pour expliquer des "résultats bizarres" ou "aberrants"). Il est important de prendre en
compte que l'analyse de vos résultats ne porte que sur une seule détermination sans
reproduction. Il vous manque donc la mesure de la variabilité de vos résultats. Dans tous
les cas, la confrontation de vos résultats à ceux des autres binômes vous apportera des
données complémentaires très utiles.
NOTATION DES TRAVAUX PRATIQUES
La note de TP est partagée en trois parties égales :
- La note "pratique" qui prend en compte la préparation du TP, la manière de manipuler
(soin, organisation de la paillasse, méthode, intérêt, questions, ...). Cette note reflète le
comportement individuel sur l'ensemble des séances de travaux pratiques ;
- La note de compte rendu de TP.
- La note d'interrogation écrite en début de séance.
La note définitive remise à la scolarité est la moyenne de ces trois notes.
BUT DES TRAVAUX PRATIQUES
Le but des quatre ateliers qui constituent les travaux pratiques
de biotechnologie est de vous faire aborder l'étude et la
caractérisation d'une protéine du parasite Trypanosoma brucei qui
provoque la maladie du sommeil (voir les liens suivants :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Trypanosoma_brucei ;
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs259/fr/).Cette
protéine, la pyrophosphatase TbVSP1 est une enzyme qui catalyse
l'hydrolyse du pyrophosphate en phosphate. Elle est essentielle pour
le cycle de vie du parasite et peut donc constituer une cible
thérapeutique pour lutter contre la contamination par le parasite.
Le but des travaux pratiques est de vous faire aborder une technique de biologie
moléculaire qui est devenue essentielle pour l'étude des protéines : l'utilisation de
protéines recombinantes qui permet de faire exprimer les protéines par une souche
bactérienne ou eucaryote afin d'en disposer en grande quantité et de pouvoir la
caractériser. Ces techniques imposent de disposer du gène de la protéine à étudier pour
l'insérer dans un vecteur qui sera transfecté chez un hôte pour le faire exprimer.
- Le premier atelier vous fera aborder la méthode qui permet d'amplifier le gène de
la protéine et de le modifier pour obtenir une protéine recombinante. La modification de la
protéine consiste à ajouter une queue de 6 histidines à l'extrémité C-terminale de la
protéine (queue poly-His). L'adition de cette queue poly-His permet la purification de la
protéine par chromatographie d'affinité IMAC.
- Le deuxième atelier vous montrera comment en trois étapes (extraction, IMAC
(chromatographie d'affinité), dessalage (chromatographie d'exclusion)), il est possible
d'obtenir la protéine totalement purifiée.
- Le troisième atelier vous permettra d'évaluer les résultats de la purification de la
pyrophosphatase par électrophorèse. Cela vous permettra de montrer l'enrichissement de
la protéine dans les fractions sélectionnées et l'éventuel degré de contamination de
l'enzyme purifiée. Accessoirement cet atelier vous permettra de vérifier la qualité des
dosages de protéines de l'atelier précédent.
- Le quatrième atelier vous permettra d'aborder la mise au point des conditions
expérimentales à utiliser pour une mesure d'activité enzymatique et la rigueur nécessaire à
l'obtention de résultats significatifs. La pyrophosphatase recombinante purifiée au cours
des ateliers précédents sera utilisée pour effectuer la détermination des paramètres
cinétiques (Km et kcat) de l'enzyme.
Glossaire des enseignements de biochimie
Ce glossaire a été rédigé à la demande des élèves. Pour l'instant, il comprend les termes
incompris ou inconnus qui nous ont été signalés par les élèves ainsi que ceux utilisés dans
le cadre des travaux pratiques de tronc commun en deuxième année. La version de ce
glossaire déposée sur la plateforme pédagogique, peut donc s'enrichir des nouveaux mots
que vous nous signalerez.
Ce glossaire ne constitue qu'une aide à la compréhension immédiate, il n'est pas exhaustif,
les définitions de certains mots concernent leur sens dans le cadre de l'enseignement. Il ne
vous dispense pas d'aller chercher dans un dictionnaire ou tout autre document une
information plus précise.
ADN : acide désoxyribonucléique : enchaînement bicaténaire des quatre
désoxyribonucléotides (A : Adénine ; T : Thymine ; C : Cytosine ; G : Guanine). Constitué de
deux chaînes antiparallèles et complémentaires reliées par le groupement phosphate par
des liaison en 5' et 3' des groupement désoxyribose des nucléotides successifs.
Appariement A-T, G-C. Porte l'information génétique d'une cellule.
Aérobie : processus qui se déroule en présence d'oxygène
Amorce ou Primer : courte séquence d'ADN qui s'apparie avec une séquence
complémentaire sur de l'ADN simple brin. Permet à l'ADN polymérase de poursuivre la
synthèse du brin complémentaire du brin matrice.
Amplification : augmentation du nombre de copies d'un gène ou d'une séquence d'ADN
ou d'ARN par la technique de PCR.
Anaérobie : processus qui se déroule en absence d'oxygène.
Anti-sens : l'ADN est composé de deux brins complémentaires et antiparallèles. Lors de la
transcription d'un gène en ARN seul l'un des brins est transcrit, c'est le brin sens. Le
deuxième brin de séquence complémentaire est le brin anti-sens. La technique anti-sens est
une technique qui consiste à synthétiser de courtes séquences d'ARN complémentaires de
séquences d'ARN. L'hybridation de ces deux séquences déstabilise l'ARN et conduit à sa
dégradation et empêche la synthèse de la protéine correspondante.
APS : Persulfate d'amonium. Composé générateur de radicaux libres utilisé pour initier la
polymérisation du mélange acrylamide/bis-acrylamide dans la préparation des gels
d'électrophorèse.
ARN : Acide Ribonucléique. Enchaînement monocaténaire de 4 ribonucléotides (A :
Adénosine ; U : Uridine ; G : Guanosine ; C : Cytidine). Les nucléotides sont reliés entre eux
par les liaisons du groupement phosphate en 5' et 3' des groupements ribose successifs.
Des appariements complémentaires et antiparallèles sont possibles A-U, G-C). Il existe
plusieurs formes d'ARN : les ARN messagers (ARNm) proviennent de la transcription de
l'ADN en ARN du gène d'une protéine. Ils sont synthétisés dans le noyau par la RNApolymérase et migrent dans le cytoplasme où ils sont traduits en protéine. Les ARN de
transfert (ARNt) permettent le transfert d'un acide aminé à une séquence protéique en
cours de synthèse. Ils sont reconnus par la machinerie de biosynthèse des protéines
(ribosomes) et s'associent à l'ARNm par l'anticodon complémentaire du codon de l'ARNm.
L'ARN ribosomal (ARNr) participe à la structure du ribosome.
Bactérie : Organisme unicellulaire dépourvu de noyau. Modèle d'étude très apprécié du
fait de sa vitesse de multiplication et de la possibilité de modifier son patrimoine génétique.
Très utilisé également pour la production de protéines recombinantes.
Biosynthèse : Synthèse réalisé par un organisme vivant mettant un jeu une ou plusieurs
enzymes.
BSA : Albumine sérique de Bœuf. L'albumine est la protéine la plus abondante du sérum.
La BSA est très utilisée comme étalon pour le dosage des protéines.
Centrifugation : Technique mettant en jeu l'application d'une force centrifuge (RCF,
correspondant à une accélération angulaire) à un échantillon afin d'en séparer les
différents constituants. La force appliquée à l'échantillon dépend du rayon du rotor utilisé
et de sa vitesse de rotation :formule calcul RCF.pdf . Son utilisation met en jeu différentes
techniques : vitesses de sédimentation (utilisée pour séparer les différents constituants
subcellulaires), isopicnique (la séparation des constituants se fait par gradient de densité).
Chromatographie d'affinité : technique chromatographique où le support est greffé à un
substituant qui va fixer avec une haute affinité un ligand spécifique. Le ligand est ensuite
élué par ajout d'un ligand compétiteur ou un changement de pH (modification de la charge
du substituant ou du ligand) ou de force ionique. Permet de concentrer puis purifier le
ligand à partir d'un mélange avec un haut rendement.
Chromatographie d'échange d'ions : Technique chromatographique basée sur
l'interaction électrostatique entre le support et les composés d'un mélange. Plus
l'interaction électrostatique est forte et plus le composé est retenu par le support. L'élution
se fait soit en faisant varier le pH, soit la force ionique. C'est une technique qui permet la
concentration d'un composé à partir d'un grand volume d'échantillon.
Chromatographie d'exclusion : Technique chromatographique permettant de séparer les
éléments d'un mélange en fonction inverse de leur taille. Le support après un étalonnage
avec des composés de masses connues permet la détermination de la masse molaire d'un
composé inconnu. Très utilisée il y a une trentaine d'année pour la purification et la
caractérisation des macromolécules biologiques, essentiellement les protéines.
Clonage : Technique permettant d'isoler un individu d'une population (bactérie, cellule
eucaryote), de le laisser se multiplier afin d'obtenir une population importante d'individus
tous identiques. Peut également s'appliquer à l'isolement du gène d'une protéine pour
l'amplifier afin de l'intégrer à un vecteur. Permet la production de masse de la protéine ou
l'expression de la protéine dans un organisme (cellule) afin d'en déterminer la fonction.
Code génétique : Les différentes combinaisons, trois par trois, des quatre ribonucléotides.
Chaque combinaison correspond à un acide aminé spécifique. Trois combinaisons
correspondent à des codons stops. Il y a plus de combinaisons que d'acide aminés, ainsi
plusieurs codons différents correspondent au même acide aminé (dégénérescence du
code).
Codon :
Séquence de trois ribonucléotides sur un ARNm déterminant la nature de
l'acide aminé qui doit être ajouté à une séquence protéique. Il est reconnu par l'ARNt
portant l'acide aminé.
Cofacteur : Composé nécessaire pour assurer l'activité d'une enzyme. Souvent constitué
d'un ion métallique (par exemple métallo protéase à zinc). Le cofacteur participe à la
réaction catalytique.
Compétition : Traduit la liaison de deux ligands sur un même site de fixation.
L'augmentation de la concentration de l'un des ligands diminue la liaison du deuxième. Le
ligand compétiteur provoque une diminution de l'affinité du site de liaison pour le
deuxième ligand.
Construction : Réalisation d'un agencement de séquences d'ADN pour le transférer dans
une bactérie ou une cellule pour permettre l'expression d'une protéine. Souvent utilisé
pour ajouter à la séquence d'une protéine une étiquette (par exemple poly-histidine) ou
mettre cette protéine sous le contrôle d'un promoteur qui permettra sa surexpression.
C-Terminal(e) : Dernier acide aminé d'une protéine dont la fonction acide carboxylique
est libre. Par extension, la partie de séquence de la protéine à proximité immédiate de cet
acide aminé. Cet acide aminé peut être modifié (amidation) pour inhiber l'action des
carboxypeptidases et augmenter la stabilité de la protéine.
Culot : A la fin d'une centrifugation, fraction constituée des éléments qui ont sédimenté au
fond du tube. Sa composition va varier en fonction de l'accélération angulaire auquel est
soumis l'échantillon.
Cycle de PCR : Succession d'étapes de durées différentes pendant lesquelles la
température va varier et comprenant la dénaturation, l'hybridation de l'amorce et
l'élongation du brin copie. Cette succession d'étapes est répétée un nombre de fois suffisant
pour permettre l'amplification du fragment d'ADN.
Cycle, voie métabolique : Succession des réactions nécessaires à la transformation d'un
substrat en un produit final. Par exemple glycolyse (glucose -> 2 pyruvate), cycle de Krebs,
etc …
D.O. : Densité optique = Absorbance d'une solution.
Desoxyribonucléotide : Molécule organique composée de l'association d'une base azotée
(purine ou pyrimidine) avec le carbone 1' du désoxyribose et d'un groupement mono-, di
ou tri-phosphate lié au carbone 5' du désoxyribose. Ensemble des 4 constituants de l'ADN
sous forme de dNTP. (A : Adénine ; T : Thymine ; C : cytosine ; G : guanine)
Dessalage : Chromatographie d'exclusion utilisée pour diminuer la concentration de(s)
sel(s) d'un échantillon. Le composé dessalé est élué dans le volume mort et le(s) sel(s)
retenu par le support.
Détergent : Composé organique permettant la désorganisation des membranes lipidiques
et l'extraction des protéines qui y sont intégrées.
Digestion : Etape pendant laquelle un substrat est soumis à l'action d'une ou plusieurs
enzymes. Digestion peptidique : coupure par des protéases ; Digestion trypsique : coupure
d'une protéine par la trypsine puis purification des différents fragments qui seront
séquencés par spectrométrie de masse ; digestion DNAase : dégradation de l'ADN
Electrophorèse : Technique permettant la séparation des macromolécules sous l'action
d'un champ électrique.
Elution , Eluer : Séparation de composés adsorbés sur un supports par lavage progressif.
Permet la séparation des différents composants d'un mélange.
Enzyme de restriction : Enzyme qui reconnaît une séquence particulière d'ADN double
brins, généralement palindromique et qui réalise une coupure au niveau de cette séquence.
La coupure peut être soit franche, soit à "bouts collants" (dans ce cas la coupure sur chacun
des brins est décalée de quelques base. Les enzymes de restriction sont les outils de base
pour la réalisation de constructions.
Espaceur : Elément d'épaisseur constante placé entre deux plaques de verre afin de
déterminer l'épaisseur d'un gel d'électrophorèse.
Étiquette, Tag : Séquence d'acide aminé ajoutée à l'extrémité C- ou N-terminale d'une
protéine afin de permettre sa purification (par exemple séquence polyhistidine) ou son
repérage (par exemple Green Fluorescent Protéine (GFP) ou Yellow FP (YFP)). Cette
séquence est rajoutée par modification du gène de la protéine.
Eucaryote : Organisme dont les cellules sont pourvues d'un noyau.
Expression : Niveau auquel un ARNm ou une protéine va être détecté dans une
préparation. Le niveau d'expression varie en fonction de l'état physiologique ou
pathologique.
Extemporané, Extemporanément : Se dit d'une préparation qui doit être réalisée juste
avant son emploi.
Extracellulaire : Tout ce qui se trouve à l'extérieur de l'enveloppe constituée par la
membrane cellulaire.
Facteur de purification : Traduit l'enrichissement d'un composé dans une préparation
entre deux étapes de purification. A ne pas confondre avec le rendement de purification.
Fraction : Lors de la séparation d'un mélange, représente les différentes parties obtenues.
Par exemple, lors d'une chromatographie d'exclusion, les fractions sont définies soit en
volume, soit en temps, soit par variation de l'absorbance.
Gène : Séquence d'ADN codant pour une protéine et faisant partie d'un chromosome. La
transcription en ARNm et sa traduction en protéine d'un gène dépend la présence de
séquences régulatrices (promoteur). Débute toujours par le codon de la méthionine et se
termine par un codon stop. Chez les eucaryotes, l'ADN dun gène est composé d'exons et
d'introns qui sont remaniés après la transcription en ARN pour conduire à un ARNm
mature.
Génie génétique : Les différentes techniques qui permettent de modifier l'expression d'un
ou d'une série de gène (Suppression, sur-expression, changement, etc)
HEPES : 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Composé (pKa = 7,55)
utilisé pour la préparation de solutions tampon.
Homogénat : Solution ou suspension résultant de la perte de la structure membranaire
d'un tissus ou d'une culture de cellule dans un milieu tamponné.
Homogénéisation : Techniques permettant la rupture des membranes cellulaires afin de
libérer le contenu des cellules dans un milieu tamponné. Par exemple : sonication (ultra
sons), potter ou Dounce (Broyage), choc osmotique (éclatement), high pressure cell
(variation de pression), …
Homogénéiser : Remise en suspension ou solution homogène après séparation de
différentes fractions (par exemple culot de centrifugation)
Hybridation : Restauration de la forme double brin de l'ADN à partir de la forme simple
brin. Possibilité qu'a une séquence d'ADN ou d'ARN de s'associer de manière
complémentaire et anti-parallèle avec de l'ADN simple brin.
Intracellulaire : Tout ce qui se trouve dans l'enveloppe définie par la membrane d'une
cellule.
Kit : Ensemble de réactifs et/ou enzymes permettant la réalisation d'une réaction
particulière. Par exemple dosage de protéines, purification d'ARN, …
Ligand : Toute molécule qui se fixe sur une structure spécifique pour exercer un effet. Par
exemple ligands des récepteurs des neurotransmetteurs ou récepteurs hormonaux.
Ligase :
Enzyme qui assure la catalyse de la liaison phosphodiester entre deux
nucléotides sur une chaîne d'ADN
Ligation : Réaction catalysée par les ligases (anglicisme).
Lyse : Technique permettant d'assurer la rupture des membranes cellulaires afin de
permettre la libération du contenu intracellulaire dans une solution tampon. Peut être
réalisé de différente manières, mais requiert souvent l'emploi de détergents.
MES : 4-Morpholineethanesulfonic acid. Composé (pKa = 6,1 utilisé pour la préparation de
solutions tampon.
Métabolisme : Ensemble des transformations moléculaires et énergétiques qui se
déroulent de manière ininterrompue dans une cellule ou un organisme. Par extension,
ensemble des transformations concernant une classe spécifique (métabolisme des sucres,
des lipides, …)
Migration : Déplacement des protéines sous l'influence d'un champ électrique dans un gel.
N-Terminale : Dernier acide aminé d'une protéine dont la fonction amine est libre. Par
extension, la partie de séquence de la protéine à proximité immédiate de cet acide aminé.
Cet acide aminé peut être modifié pour inhiber l'action des aminopeptidases et augmenter
la stabilité de la protéine.
Oligo : Courte séquence d'ADN ou d'ARN (jusqu'à une vingtaine de nucléotides).
Peigne : Pièce de plastique de la même épaisseur que les espaceurs utilisé pour mouler des
puits dans les gels d'électrophorèse. C'est dans ces puis que seront déposés les échantillons
à analyser ou les marqueurs de masse molaire.
Phosphorylation oxydative : Ensemble des réactions qui se déroulent pendant la phase
aérobie du métabolisme énergétique.
Plasmide : Séquence d'ADN circulaire présente chez certaines bactéries. Peut se
transmettre d'une bactérie à l'autre. Les plasmides sont très utilisés en biologie
moléculaire pour permettre la synthèse de protéine ou l'amplification d'une séquence
d'ADN particulière. Les plasmides peuvent également êtres intégrés dans les cellules
eucaryotes à condition d'y avoir insérer les éléments régulateurs compatibles.
Polymérase : Enzyme assurant l'élongation des chaînes d'ADN (DNA-polymerase) ou
d'ARN (RNA-polymerase) complémentaires à un brin matrice.
Polymerase Chain Reaction, (PCR) : Technique permettant l'amplification géométrique
d'une séquence d'ADN. Met en jeu la succession de différentes étapes (voir amplification).
Quand on souhaite amplifier une séquence d'ARN, elle doit être précédée d'un étape de
"reverse teanscription" (RT-PCR) afin d'obtenir la séquence ADN complémentaire de la
séquence de l'ARN par une reverse-polymerase.
Primer :
Voir amorce
Procaryote : Organisme unicellulaire dépourvu de noyau.
Protéine fonctionnelle : Etat d'une protéine après sa traduction à partir de l'ARNm et les
modifications post-traductionnelles qu'elle peut subir dans le réticulum endoplasmique et
l'appareil de Golgi quand elle acquiert sa conformation tridimensionnelle définitive et
qu'elle a atteint le compartiment cellulaire de destination. Par analogie, protéine isolée
(purifiée) qui a conservé sa fonction (par exemple, une enzyme).
Protéines recombinantes : protéine modifiée par génie génétique et produite par un
organisme eucaryote (bactérie, virus) ou procaryote. Elle peut comporter des parties
supprimées ou ajoutées, ou les deux par rapport à la protéine native.
Purification :Isolement d'un composé spécifique à partir d'un mélange. Se caractérise par
un facteur de purification (augmentation de la proportion du composé par rapport aux
autres, à la fin de la purification le composé est pur) et un rendement de purification
(quantité de composé purifié par rapport à la quantité initiale).
Rendement de Purification : Caractérise la quantité d'un composé par rapport à sa
quantité initiale après sa purification à partir d'un mélange. Ne pas confondre avec la
facteur de purification.
Réplication : phase du cycle cellulaire pendant laquelle l'ADN chromosomique est l'objet
d'une duplication semi conservative (chaque brin de la molécule d'ADN sert de matrice
pour la synthèse du brin complémentaire. Après la duplication, il y a scission de la cellules
en deux cellules filles qui contiennent le même patrimoine génétique.
Résistance : Caractérise la perte de sensibilité des bactéries à un agent toxique
(antibiotique). Un gène de résistance à un antibiotique est souvent inséré dans un plasmide
afin de sélectionner les bactéries (non résistantes) qui ont intégré le plasmide.
Ribonucléotide : Molécule organique composée de l'association d'une base azotée (purine
ou pyrimidine) avec le carbone 1' du ribose et d'un groupement mono-, di ou tri-phosphate
lié au carbone 5' du ribose.Constituants de l'ARN sous forme de NTP (A : Adénosine ; U :
Uridine ; G : Guanosine ; C : Cytidine).
Sélection : Processus par lequel on isole un individu ou une population d'individus
présentant les caractéristiques souhaitées. Par exemple, après transfert d'un plasmide à
des bactéries, l'isolement des bactéries qui ont intégré le plasmide. Se réalise à l'aide d'un
agent de sélection, typiquement l'ajout d'un antibiotique, seules les bactéries ayant intégré
le plasmide porteur du gène de résistance à l'antibiotique peuvent se multiplier.
Sens : L'ADN ayant une structure double brin, seul l'un des brins est transcrit en ARNm.
C'est le brin sens. Le brin complémentaire est le brin anti-sens.
Séquence codante : Dans une séquence d'ADN, la partie qui après transcription en ARN
sera traduite en protéine. Débute toujours par le codon de la méthionine et se termine par
un codon stop.
Séquence nucléotidique : enchaînement de désoxyribonucléotides ou de ribonucléotides
constituant les séquences d'ADN ou d'ARN.
Séquence palyndromique : séquence de désoxyribonucléotide qui se lit d ela même
manière de la gauche vers la droite et de la droite vers la gauche, par exemple ATCTA. Ce
sont des séquences fréquement réconnues par les enzymes de restriction.
Site actif : Dans la structure tridimensionnelle d'une enzyme la partie où se fixe(nt) le (ou
les) substrat(s) et où la réaction catalysée se déroulera. Implique le plus souvent des
chaînes latérales d'acides aminés très éloignés les uns des autres dans la séquence primaire
de la protéine.
Site de restriction : Dans une séquence d'ADN double brin, séquence spécifique reconnue
par les enzyme de restriction qui vont catalyser la coupure de la chaîne au niveau de cette
séquence.
Sonication : Technique de lyse de cellules ou de fragments de tissus par ultrasons.
Souche :
Sélection d'une catégorie particulière d'une espèce et porteuse de
caractéristiques spécifiques. Par exemple, pour la bactérie Eschérichia coli, les souches
BL21 ou JM109.
Standard ou étalon : Composé de référence utilisé pour un dosage. Par exemple la BSA
pour le dosage des protéines.
Substrat : Composé reconnu par une enzyme et qui sera transformé au cours de la réaction
catalysée par l'enzyme.
Surnageant : Après une centrifugation la fraction située au dessus du culot. Contient en
général des composés solubles et/ou de faible densité.
Tampon, solution tampon : Composé ou solution qui permet de limiter les variations de
pH dans une fourchette relativement étroite, ou de maintenir le pH à une valeur voulue. Le
pouvoir tampon d'une solution dépend de la concentration du tampon utilisé et de la
différence entre le pH souhaité et le pKa du composé.
TAQ polymérase : DNA polymérase de la bactérie Thermophylus aquaticus. Cette bactérie
isolée près des sources sous-marines chaudes présente la caractéristique d'exprimer des
protéines qui sont beaucoup plus résistantes à la thermodénaturation. Cette propriété est
utilisée avec cette enzyme dans la technique de PCR où après chaque étape de dénaturation
de l'ADN double brin, il n'y a pas besoin de rajouter de la DANA polymérase.
Thermocycler, thermocycleur : appareil utilisé pour réaliser la technique de PCR. Permet
d'assurer rapidement et de manière contrôlée les différentes étapes (cycles) à différentes
températures.
Traduction : Dans la biosynthèse des protéine, étape qui suit la transcription de l'ADN en
ARN et où les codons de la séquence de l'ARN sont lus par les ribosomes et par
appariement avec l'anticodon des ARNt permet l'allongement de la protéine.
Transcription : phase du cycle cellulaire pendant laquelle une partie d'un brin de l'ADN
chromosomique est transcrite en ARN dont la séquence nucléotidique est complémentaire
et de polarité opposée à celle de l'ADN matrice.
Transfection : Insertion dans une cellule procaryote ou eucaryote d'une séquence d'ADN
(par un plasmide ou un virus) permettant l'expression d'une ou plusieurs protéines.
Tris : Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Composé (pKa = 8,2, utilisé pour la préparation
de solutions tampon.
Vecteur : Construction d'ADN contenant la séquence à intégrer par une bactérie ou une
cellule eucaryote qui contient tous les éléments nécessaire à la sélection des bactéries ou
cellules transfectées et à l'expression de la protéine (promoteur, …). Souvent constitué par
un plasmide (transfection de bactéries) ou de l'ADN linéaire (transfection virale de cellules
eucaryotes).
Voie métabolique : Ensemble des réactions que subit un substrat pour être modifié ou
consommé.