Biologie cellulaire du 22 janvier. LA DIVISION CELLULAIRE. Cycle de division cellulaire. Ce n’est pas que la mitose = division du noyau. -Il y a dans ce cycle une phase M qui comprends la division nucléaire et la division cytoplasmique, c’est la mitose + cytodiérèse. -Interphase comprends 3 phases: -G1 : biosynthèse de la plupart des protéines présentes dans la cellule. -S : Synthèse de l’ADN avec duplication du matériel génétique. -G2 : Préparation de la mitose. -Chez les organismes monocellulaires : les procaryotes, la division cellulaire est régulé de façon basique. Il y a un rôle limitant immédiat des nutriments qui sont dans le milieu de culture. -Chez les eucaryotes et organismes pluricellulaires : Il y a une régulation plus complexe. Si il y a une lésion cutanée de cellules, celles ci envoient des signaux aux cellules avoisinantes pour induire une prolifération et quand ces dernières ont remplis la brèche cutanée il faut qu’elles s’arrêtent de proliférer. Si ce phénomène de régénération ne se fait pas, la blessure n’est pas réparé ; et s’il se fait sans qu’il y ait d’inhibition quand les cellules sont contacter entre elles, il y a un cancer cutané qui apparaît. -Il faut aussi une régulation à l’intérieur de la cellule car la division concerne la mitose, le cytoplasme et ça implique une croissance préalable donc il faut avoir dupliquer le cytosquelette, le matériel membranaire, nucléaire et cytoplasmique car ça divise la cellule en 2. Ceci implique dès les monocellulaires la nécessité d’une coordination des cycles chromosomiques, centroplasmiques et centrosomiques. -Pour étudier cette activité de régulation, on utilise la culture cellulaire : On prends les cellules de la peau, on les mets dans une boite de pétrie, on met des facteurs de croissance, ces cellules s’attachent dans la boite de pétrie et vont pousser et au bout de 7 jours elles s’arrêtent de pousser dès que les cellules sont à confluence. Donc le premier élément de régulation est le contact intercellulaire et l’adhérence qui fait qu’il y a une inhibition de contact quand cellules confluentes. Si on met des facteurs de croissance dans le milieu de culture, ça augmente la prolifération cellulaire. -Une autre régulation : une cellule qui se différencie arrête de proliférer. Il y a un lien direct entre la différenciation cellulaire et la prolifération. Quand il y a vieillissement (mort cellulaire), il faut une régulation négative de la prolifération. -Cancer : prolifération anarchique, indépendance par rapport aux facteurs de croissance, perte de l’inhibition de contact. Méthode d’étude de la division cellulaire. - Microscope : les cellules se divisant sont arrondie avec une membrane nucléaire dissoute, il y a le fuseau mitotique, des chromosomes en plaque équatoriale caractéristique de la mitose. Tout ceci peut se filmer comme pour l’apoptose. - Colorer les cellules : On peut voir les noyaux, la plaque équatoriale. Actuellement pour diagnostiquer le cancer on colore le tissu pathologique et on regarde s’il y a des mitoses dans le tissu. La microscopie en contraste de phase permet de voir les cellules sans les colorer. Cette coloration permet de voir les différentes phases : l’ébauche du fuseau mitotique, la métaphase avec les chromosomes qui se condensent, qui migrent le long de ce fuseau à l’anaphase. 1 -Les techniques de coloration, comme pour l’apoptose, sont impressives car dépendent de l’observateur donc il faut des techniques moléculaires plus quantitatives pour définir la prolifération cellulaire dans les cellules ou tissus. L’événement le plus traçable dans la division cellulaire c’est la duplication du matériel génétique. Si on marque l’ADN avec des réactifs fluorescents, des colorants et séparer ces cellules en cytométrie de flux. On peut utiliser l’incorporation de base nucléotidique marqué comme la thymidine tritiée et mesurer la radioactivité. On peut aussi incorporer du non radioactif comme le BRDU (bromo déoxy uridine) repérable avec des anticorps. En 1970, on injectait au patient de la thymidine tritiée ou du BRDU puis on opérait leur tumeur et on se servait de la quantification de l’incorporation pour voir le potentiel prolifératif d’une tumeur pour mieux phénotypé cette tumeur. On a arrêté cette technique car incorporer quelque chose dans le génome est toujours mutagène. -En cytométrie de flux, quand on passe de G1 à G2 c’est le passage d’1 ADN à une quantité double (c’est ce qui s’est passé en S). -G0 est la phase quiescence. -Quel est le temps de ces différentes phases ? pour le voir il faut des repères dans le cycle cellulaire. Un des repères facile à voir : c’est la mitose. La phase S est aussi facile à voir car duplication de l’ADN donc si on met de la thymidine tritiée et qu’on regarde tout de suite, on verra seulement les cellules en phases S. Donc M et S facilement repéré. Si après l’incorporation on attends un peu, on suit l’évolution de la cellule et ça permettra en prenant ces deux repères de définir la longueur des différentes phases. La phase G1 qui prépare l’action est celle la plus longue. -Pour étudier tout cela en culture cellulaire, le problème c’est que toute les cellules ne sont pas en mitose en même temps. Mais on a besoin d’avoir que des cellules à la même phase. On peut faire : - une déprivation en facteur de croissance donc cellule en G1 arrêté mais c’est pas très efficace car ça fait crever les cellules. -un isolement mécanique : les cellules en mitose sont plutôt rondes donc isolable facilement si on tape les boites de culture sur la paillasse car les cellules rondes vont allés dans le milieu de culture et on peut les recueillir en lavant les cellules et en les mettant dans une autre boite de culture. -utiliser des drogues. L’aphidicoline bloque en G1/S. Le nocodazole bloque en métaphase. Contrôle de la division cellulaire ? Au niveau d’une cellule il y a un cycle du centrosome, nécessité d’un cycle chromosomique et une régulation de la cytodiérèse et tout cela doit être coordonnée par un programme dans le temps. C’est donc par une enchaînement de mécanismes moléculaires qui vont varier au cours du temps. - Quand cellules synchronisées : si on met facteur de croissance on induit S et si on les ôte la cellule est bloqué en G1 jusqu’à un certain point. Il y a donc augmentation de la synthèse des protéines, des ARNs, des lipides et des glucides qui s’installent au cours de G1 pour se terminer en S. La duplication de l’ADN se fait pendant S. Une exception : les protéines de la chromatine ont un stock doublé en parallèle de la duplication de l’ADN donc pas en G1 comme les protéines de structure. Il y a un point de restriction ® qui fait que même si on hôte les facteurs de croissance la division cellulaire sera irréversible. -R est un point après lequel l’activation du cycle cellulaire devient irréversible et là on observe enchaînement chronologique décrit. Si pas de facteur de croissance, arrêt en G1 précoce. Si on laisse le facteur on va de G1 à S. Le facteur de croissance étant indispensable seulement jusqu’au point R. 2 Composants intracellulaires qui régulent les phases du cycle cellulaire. Pour les découvrir, on a fait des fusions cellulaires et des micro injections de noyaux provenant de cellules à différents moments du cycle cellulaire. Pour faire une fusion cellulaire, on a 3 moyens : - On peut mettre un virus (Sedaï) - Des solvants comme le polyéthylèneglycol. - Du courant électrique. Ces 3 modalités de fusion cellulaire vont donner une cellule hybride qui a 2 noyaux : hétérocaryons donc on peut observer quel est l’influence du noyau d’une cellule sur le comportement de l’ensemble de la cellule. Cette fusion cellulaire est utilisé pour faire des clones où fusion entre des noyaux somatiques et des cellules embryonnaires. - Une cellule en G1 et une cellule en S qu’on fusionne : Le noyau en G1 passe en S alors que le noyau en S continue d’incorporer la thymidine et il poursuit le cycle cellulaire. On en déduit que la cellule en S contient un facteur déclenchant S sur la cellule en G1 : c’est le facteur de promotion de la phase S ou SPF. - Une cellule en G1 et cellule en G2 : La cellule en G2 complète sa mitose et son effet sur la cellule en G1 est d’entraîner l’amorce d’une mitose. On déduit que la cellule en mitose contient un facteur déclenchant de mitose : le MPF. - Une cellule en S + une cellule en G2 : la phase S se poursuit avec incorporation de thymidine. Sur le noyau en G2, on voit un retard de la mitose. La cellule en G2 est insensible à SPF, il peut y avoir qu’une seule réplication de l’ADN en même temps c’est à dire quand une réplication se produit il y a une inhibition d’en faire une deuxième. - Un noyau en G1 qui passe en S fusionné avec un noyau en G2 : La cellule en G2 reste en G2 : il y a une mitose retardé donc SPF a disparu de la cellule en G2. La cellule en G1 contient facteurs retardant la mitose tant que la réplication de l’ADN n’est pas terminé. -Ces expériences ont montrés qu’il y a des facteurs de promotions de S ou mitose, que si ces éléments là ne sont pas finit il y a des inhibiteurs qui empêche de faire une deuxième réplication en même temps qu’une réplication. SPF en fin de G1 et en S. MPF en fin de G2 et en M. Il y a des facteurs inhibiteurs de la mitose en G1-S. - Pour connaître les protéines derrière ces activités, on a utilisé 2 façons : 1- Pour purifier un facteur il faut beaucoup de ce qu’on veut purifier. Dans l’œuf de Xenope, on voit que l’ovocyte est arrêté en G2 et que la mitose est induite par la progestérone donc si on micro injecte l’activité MPF on induit une mitose. C’est un test facile pour injecter des protéines qui ont étés purifiés et dont on peut penser qu’elles sont porteuses de l’activité MPF. 2- Approche moléculaire dans la levure = modèle facile. Si on met nutriments pour la levure, elle se multiplie, si on les enlève elle ne se multiplie plus. Dans une population de levures, il y aura des mutants qui apparaissent et des mutants sont incapables de se diviser donc on a regarder les gènes correspondant à cette incapacité et le gène en question correspond à une protéine spécifique : CDC2 (cell division control) qui a un poids moléculaire de 34kDa nécessaire à l’entrée en mitose. Quand mutation de ce gène, les levures sont incapables de se diviser. Des biochimistes ont purifiés une protéine kinase (capable de phosphoryler d’autres protéines). Ils ont fait une recherche d’homologie de séquence entre la protéine kinase qui portait l’activité MPF et la protéine codée par CDC2, il y a une homologie entre les deux donc même type de protéines. 3 - Est ce que MPF est corrélé à la phase M ? On prends la protéine purifié, on l’injecte à un lapin qui s’immunise contre la protéine, on prends son sérum, on purifie les anticorps et on regarde s’il y a des modifications de cette protéine corréler à l’activité MPF. Cette protéine, dosée au cours du cycle cellulaire, n’a aucune variation cyclique donc la modulation de quantité de MPF n’est pas responsable de l’activité MPF directement et si on regarde l’activité protéine kinase, c’est à dire la capacité de cette protéine à en phosphoryler d’autres, on voit qu’il y a bien une modulation cyclique de l’activité kinase qui est bien corréler à l’activité MPF. On a donc une protéine dont la quantité est constante quelle que soit les moments du cycle mais sa propriété à phosphoryler les autres protéines est cyclique. Il y a donc une autre protéine qui varie pour cycliquement activer la protéine : De façon corrélative à l’activité MPF, il y a des modifications quantitatives de la cycline B (protéine) qui est la seule protéine qui cycle. Cette cycline B vient se lier à CDC2 pour l’activer. MPF c’est donc un complexe moléculaire comprenant la protéine kinase et la cycline cyclique. - Il y a une famille de cycline pour les différents moments du cycle cellulaire : de A à H. - Les CDC2 ont étés appelés des CDK pour cycline dependant kinase. La CDC2 a été appelé la CDK1. - La régulation du cycle cellulaire c’est une combinatoire de complexes CDK- cycline dont l’activité va être transitoire au cours du cycle cellulaire et chaque CDK spécifique d’un moment du cycle va avoir des substrats qu’elle va venir phosphoryler entraînant un effet bien spécifique dans la physiologie cellulaire. - En G1 : c’est la cycline D et E. - En S : cycline A. - En M : cycline B. - MPF : CDK 1 (ex CDC2) + cycline B. - SPF : CDK 2,4,5,6 + Cycline D, E, A. Pourquoi une kinase peut induire des événements? En phosphorylant des cibles, elle induit des effets importants pour la biologie cellulaire : - CDK1 est capable de transformer la tubuline-GDP en tubuline-GTP : ce qui entraîne une polymérisation des microtubules ce qui permet l’organisation du fuseau mitotique. - Si on déphosphoryle la tubuline-GTP : cela favorise la dépolymérisation du cytosquelette et on dissout le réseau microtubulaire. - L’organisation ou désorganisation de la membrane nucléaire est importante pour la division nucléaire. Au niveau de la lamina, il y a des lamines : cibles des CDK1 et la phosphorylation des lamines entraînent la désorganisation de l’intégrité de l’enveloppe nucléaire et quand on déphosphoryle les lamines il y a réorganisation de cette enveloppe nucléaire. - Il existe des protéines inhibitrices de l’activité kinasique : ce sont les CDKi (cycline dependant kinase inhibiteur) qui bloquent ou ralentissent le cycle cellulaire. Il y en a 4 : 1- P27 : entraîne un arrêt du cycle en G1/S. Elle est activé par l’AMPc et le TGF . 2- P21 : responsable de l’arrêt du cycle en G1/S. Elle est induite par la P53 en réponse aux lésions de l’ADN. 3- P15/P16 : ont capacités à inhiber les CDK de phase G1. Ils sont codés par des gènes souvent mutés dans les tumeurs. Si on mute des inhibiteurs des CDK, ça favorise une amplification du cycle cellulaire donc tumeur. Lésion de l’ADN. Cela entraîne l’augmentation de P53. P53 induit Bax donc entraîne une cascade menant à libération de cytochrome C, activation des caspases donc apoptose. Avant l’apoptose, quand il y a lésion de l’ADN, P53 induit en allant se fixer sur le promoteur de la P21 d’induire cet inhibiteur de kinase qui vient se positionner sur les complexes CDK/cyclines et qui va bloquer 4 la cellule en phase G1. Avant d’avoir besoin de faire apoptose, on essai de réparer l’ADN en bloquant la cellule en G1. Si la réparation n’est pas bien faite, cela induit Bax puis mort cellulaire. Protéine du rétinoblastome. Le rétinoblastome est une maladie familiale : c’est des enfants qui ont tumeurs au niveau de rétine. Dans ces tumeurs, il existe une mutation d’un gène qui est inactivé, c’est le gène du rétinoblastome. En Phase G1, quand la cellule est quiescente, la protéine du rétinoblastome n’est pas phosphorylé et elle exerce une fonction de séquestration de E2F (protéine) qui est un activateur de la transcription quand libérer de l’emprise de la protéine du rétinoblastome. Le rôle physiologique de cette dernière protéine est de séquestrer E2F donc freiner la prolifération cellulaire. Quand cycle cellulaire activé par des facteurs de croissance, on a activé les cascades de kinase : la cycline E activant CDK2, celle ci va phosphoryler la protéine du rétinoblastome ce qui entraîne une modification de conformation permettant le relargage de E2F qui stimule la prolifération cellulaire. Pour perturber ce système, il y aussi les virus oncogènes (qui ont capacité de déclencher cancer) qui empêchent la protéine du rétinoblastome de lier E2F en la séquestrant donc c’est équivalent à ce qui se passe quand la protéine du rétinoblastome est phosphorylée. Dégradation cyclique des cyclines activatrices. -Il existe le protéasome (compartiment dans la cellule) où se trouvent des complexes de protéases. La protéolyse induite par ces protéases est déclencher par génération d’un signal d’alarme au niveau des protéines qui est médié par l’ubiquitination. Dès qu’une protéine est ubiquitiné, cela déclenche des protéases qui viennent la détruire donc un des effets des CDK activé est d’induire les ligases qui vont permettre l’ubiquitination des cyclines. Donc dès qu’une cycline active une CDK, celle ci va activé des ubiquitines ligases qui entraînent la destruction de cette cycline. - Sur la cycline, il y a un motif à résidus lysine qui est le site de reconnaissance pour l’ubiquitination. L’ubiquitine fait 76 AA. Sous l’effet d’une ubiquitine ligase, il y a polyubiquitination de la cycline. Ce signal de polyubiquitination déclenche la protéolyse de la cycline. - 3 modalités de régulation de l’activation des CDK : 1) une synthèse cyclique de cycline B sous la dépendance par exemple de facteur de croissance (augmentation de cycline B). 2) L’activation des CDK induite par les cyclines va pouvoir être inhiber par des CDKi. 3) La cible même des CDK sont les enzymes qui viennent détruire les cyclines. -Dans le cancer, il y a des augmentations du contenu en cycline, des inactivations des CDKi et des anomalies de l’ubiquitination. Toutes ces cibles sont pour traiter des cancers et on a mis en place des équivalents des inhibiteurs des CDKi qui viennent inhiber l’activité des kinases pour effet anti tumoraux (autre alternative à chimiothérapie ou radiothérapie). - La CDKi pour être activé doit avoir 3 sites de phosphorylations : sur des résidus thréonine, tyrosine ou sérine. D’abord il y a une sérine thréonine kinase et une tyrosine kinase qui vont entraîner une tri phosphorylation de CDK1. Pour qu’il puisse y avoir une liaison de la cycline il doit y avoir action d’une phosphatase qui vient déphosphoryler 2 des 3 résidus et c’est seulement là qu’on observe activation de CDKi. 5 Les télomères Sont les extrémités des chromosomes qui sont indispensable pour assurer l’intégrité du matériel génétique lors du cycle cellulaire. L’ADN télomérique est formé de boucles qui sont rendus possibles par l’existence de motifs simples répétitifs riche en guanine ce qui entraîne la formation de boucles par complémentarité. On se retrouve dans un chromosome normal non sénescent avec des extrémités télomériques. C’est une structure très stable et si on perd cette structure télomérique en boucle, on observe une instabilité du chromosome : on perds du matériel génétique ce qui entraîne directement l’arrêt du cycle cellulaire et la mort de la cellule. La boucle protégeait le chromosome des DNAses. Chez les vieux, les chromosomes sont très court et chez les jeunes ils sont long. Dans les tumeurs il y a une activité des télomères très importante. 6