Chapitre 2 : Les Méthodes d`analyse de la Cellule
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Chapitre 2 : Les Méthodes d’analyse de la Cellule – Bernard Rousset Sommaire PARTIE 1 : Approches et Moyens d’études de la Cellule – Page 1 PARTIE 2 : Méthodes d’analyse de la forme et de la structure des cellules et des organites – Page 10 PARTIE 3 : Méthodes d’études des constituants moléculaires de la cellule - Page 18 PARTIE 4 : Quelques méthodes d’études du fonctionnement cellulaire – Page 21 PARTIE 1 : Approches et Moyens d’études de la Cellule I – Source de matériel biologique et utilisations principales. A) Organes-Fragments d’organe (Tissus) Source Législation Animaux d’abattoirs Aucune Accessibilité Facile Animaux de laboratoire - Loi d’agrément des locaux. - Personnel formé. - Selon disponibilité Temps de Recueil Court Court Homme - Loi Hurriet - Comité d’éthique - CPP - Travail de Diagnostic - Opération pour tissus anormaux. Long B) Lignée Cellulaire - Lorsque l’on veut travailler sur des lignées cellulaires, on utilise des cellules immortalisées càd des cellules capables de se multiplier de manière infinie. 1 - D’où proviennent ces cellules ? - Elles sont soit issues de Tumeurs soit elles résultent de modifications génétiques expérimentales. Fascicule. 2 – Conservation de ces lignées - La conservation par congélation est la technique la plus répandue. Cependant, il existe différentes conditions de conservation qui ne dépendent que des buts poursuivis (ce que l’on veut faire de ce matériel biologique) qui peuvent être la viabilité, le maintien de la structure ou le stockage simple du matériel biologique. II – Modalités de Conservation du matériel biologique - La technique de préservation des structures et des constituants cellulaires est la Congélation. Cependant, selon l’usage que l’on veut faire a posteriori de ces échantillons, ces derniers ne doivent pas être conservés dans les mêmes conditions. Il existe donc plusieurs techniques de congélation : 1 Conditions Standards A très basse température - 20 à – 80°C -100°C Lyse cellulaire (= Destruction des structures cellulaire mais conservation du contenu.) Mort Cellulaire (=Conservation des Structures.) Congélation par Cryoprotection - Technique avec ajout de Glycérol et DMSO - Diminution progressive de la température. - Stockage entre -80°C / -196°C - L’eau passe de l’état liquide à l’état vitreux. Survie de la Cellule III – Modalités de Fixation des cellules et tissues pour examen morphologique - La Fixation, c’est le traitement qui sert à établir des ponts chimiques entre certaines macromolécules afin de figer des structures cellulaires dans un certain état. A) Composés utilisés - Aldhéyde : C’est une fonction chimique qui correspond à l’oxydation d’un alcool primaire. Pour fixer des tissus animaux, on utilise du Formaldéhyde ou du Glutaraldéhyde. B) Réactions - Les réactions qui s’enchainent se font avec les fonctions amines primaires. Fascicule. IV – Utilisation principales du matériel biologique Lorsque l’on veut travailler sur un échantillon viable, il faut : - Connaitre Le nombre de cellule viables dans l’échantillon (Test du Bleu de Tryptophane) - Séparer et trier les différentes cellules en présence pour se concentrer sur un seul type de cellules. A) Numération par comptage cellulaire - Lames de Verre qui présentent des rayures sur sa partie centrale permettant d’obtenir des volumes définies. (Lame Thomas ou Malasse ) - On dispose dans ces rayures un goutte cellulaire (fraction aliquote : 20µl sur 5ml) - On place au-dessus de la lame, une lamelle qui piège une certaine hauteur de liquide fixe que l’on connait. - On peut compter le nombre de cellules présentes dans un champs microscopique (=Volume) connu. B) Numération par quantification d’ADN - On va compter les cellules en faisant une mesure de l’ADN. En effet, au sein d’un organisme connu, toutes les cellules on la même quantité d’ADN par noyau. Chez l’Homme, un noyau contient 8 pg d’ADN - Dans une fraction aliquote, on connait la quantité d’ADN et donc la quantité cellulaire présente. 2 V – La culture des cellules : Primaire & Secondaire - Culture primaire : Culture de cellules fraichement isolées. - On fait de manière fréquente des cultures de cellules adhérentes au support. A) Conditions d’ensemencement 1 – Dans les flacons traités pour la culture cellulaire - Boite de Pétri : 3 à 30 cm de Diamètre - Flacon : 25 à 500 ml - Plaques multi-puits : < 30 ml ; Culture d’une seule cellule par puit. 2 – Dans un milieu complexe - Il existe de nombreuses sortes de milieux complexes différentes les uns des autres. Cependant, tous contiennent : - des éléments essentiels à la synthèse des constituants et au métabolisme (ions glucose, acides-aminés, vitamines...) Il s’agit de tout ce que n’apporte plus la cellule. - Sérum : Sérum de Veau Fœtal en Général (= SVF) dont le pourcentage, par rapport au milieu est de 0,5 à 10 %. Le SVF est un Facteur : - D’adhésion - De croissance - D’Hétérogénéité. - D’antibiotiques : nécessaires pour la culture de cellules eucaryotes pour empêcher la prolifération de cellules procaryotes (=Bactéries.) 3 – Densité d’ensemencement La densité d’ensemencement est variable suivant les buts suivis de la création d’une lignée cellulaire. Cette densité d’ensemencement varie entre 104 et 106. 4 – Volume d’ensemencement - Le Volume d’ensemencement est également variable. On essaye toutefois de laisser un mince film de 2 à 3 mm pour favoriser les échanges gazeux. En effet, les cellules présentent des besoins en apport d’Oxygène et de rejet de CO2.. B) Conditions de culture - La culture cellulaire est maintenue dans un incubateur. Il s’agit d’un flacon jamais fermé présentant, pour la survie de la lignée, les caractéristiques suivantes : - L’atmosphère est constituée d’un mélange de 95% d’air et de 5% de CO2. Celui-ci contrôle le pH. En effet, il est nécessaire pour cultiver des cellules que l’on travaille dans un milieu tamponné (milieu où le pH est contrôlé par un système tampon.) - La température est réglée à 37°C (Température physiologique de l’organisme humain.) - Le milieu dans lequel on travaille, est un milieu stérile afin d protéger non seulement le milieu, mais également l’expérimentateur. 3 C) Devenir des cellules 1 – Adhérence au support - Dure de quelques heures à 24H. - L’adhérence est la capacité d’une cellule à se fixer au support, càd de s’adapter au milieu dans lequel elle va effectuer sa culture. 2 – Evolution des cellules dans les boites de culture. 2.1 – Les cellules ne se multiplient pas - Si l’ensemencement est à forte densité, on doit obtenir une couche cellulaire continue. - Si l’ensemencement est à faible densité, on doit obtenir des îlots de cellules (cellules isolées ou en petits groupes.) 2.2 – Les cellules se multiplient - Si on a un ensemencement à faible densité et que les cellules se multiplient, on observe une division cellulaire. Celle-ci s’achève quand il n’y a plus de possibilités de se multiplier (milieu trop étroit.) A ce moment précis, on dit que les cellules sont arrivées à confluence. - Suite à ce moment de confluence, on traite légèrement les cellules avec un enzyme protéolytique (= capable de scinder une protéine – La Trypsine par exemple.) - Nous avons donc créer une culture secondaire. D) Devenir des cellules en culture - La vitesse de multiplication d’une lignée cellulaire est caractérisée par son Temps de Doublement de Population (TDP) E) Expression de la différenciation - Chaque cellule est spécifique est cette spécificité se manifeste lors de la création de lignée cellulaire, par l’apparition de caractéristiques fonctionnelles conservées par les cellules. Il s’agit de la réacquisition (= les cellules retrouvent les caractéristiques morphologiques et les propriétés fonctionnelles qui les caractérisent.) Exemple de spécificités réacquises : - Neurones = Formation d’extensions - Cellules cardiaques = Fréquences de Battements. - Cellules épithéliales = Réorganisation Tridimensionnelle. VI – Etablissement de lignées cellulaire : Le Clonage et la Fusion Cellulaire. Le Clonage : qu’est-ce que c’est C’est l’obtention d’une population à partir de la multiplication d’une seule cellule. Comment l’obtient-on ? On prend une culture de cellule en suspension que l’on dilue pour avoir une cellule par puit de culture. On cultive cette cellule jusqu’à obtenir un clone puis une lignée cellulaire clonales. On peut par la suite faire un stockage de cette lignée clonée par congélation. 4 A) Etablissement de lignées cellulaires - Deux possibilités 1 – A partir de cellules normales - Les cellules dites « normales » sont des cellules incapables de se multiplier spontanément. Il leur faudra donc acquérir cette caractéristique de multiplication infinie que l’on nomme ’immortalisation des cellules. - On donne cette capacité aux cellules (l’immortalisation) en introduisant dans ces cellules, un ou plusieurs gènes exogènes qui transforment ces cellules. Celles-ci vont donc pouvoir se multiplier de manière infinie. - On introduit ce gène dans une cellule hôte à l’aide d’un vecteur plasmidique (issu de bactérie) ou vecteur viral (issu d’un virus.) Attention vocabulaire ! On transfecte un gène vers une cellule eucaryote mais on transforme un gène vers une cellule procaryote. Lorsque le gène s’exprime au sein d’une cellule, on obtient des plages de cellules qui se multiplient. Cependant, l’affectation d’un gène dans le caryotype d’une cellule peut présenter des inconvénients. En effet, on ne sait jamais si ce gène va être intégrer ou non par la cellule. C’est pourquoi on transfecte certains gènes uniquement dans des lignées dont on connait les diverse caractéristiques. 2 – A partir de cellules tumorales (animales ou humaines) - Pour créer une lignée cellulaire clonale à partir de cellules tumorales, il suffit de mettre directement ces cellules en culture et on obtiendra des plages où ces cellules se multiplient. - On constate ici que la caractéristique de multiplication infinie est définie initialement dans les cellules tumorales. B) Culture des lignées cellulaires - La culture de lignée cellulaire présente les mêmes caractéristiques que la culture de lignées cellulaire clonales. - On essaye d’identifier la subculture d’un lignée cellulaire (=le nombre de passages subis par les cellules depuis la création de la lignée en question, que ce soit des cultures primaires ou secondaire.) - Même si des conditions générales existent pour la création de lignées cellulaires, chaque type de lignée cellulaire peut nécessiter des requis particuliers (proportion de Sérum…) - Une culture effectuée dans un milieu chimiquement défini ne requiert pas de Sérum ! C) Autre modalités de culture (pour que les cellules puissent adhérer.) 1 - Culture de cellules sur plastique traité 2 – Culture de cellules sur Matrice extracellulaire L’environnement péri-cellulaire est constitué de Collagène et d’autre protéines. 3 – Culture de cellules sur Micro-Porteur Ce procédé est utilisé si on requiert une grande quantité de cellules. 4 – Culture de cellule en suspension 5 D) Fusion cellulaire : Génération de cellules hybrides Etapes dans le Fascicule. Résumé des quatres étapes : - Addition d’un agent de Fusion (Polyéthylène Glycol) - Culture dans un milieu complexe - Evolution des structures cellulaires dans un milieu sélectif - Clonage des cellules hybrides formées à partir des Hétérocaryons (=fusion des noyaux des deux cellules mises en suspension initialement.) VII – Séparation et Tri cellulaire A) La centrifugation - La centrifugation est un moyen de séparation utilisant la force centrifuge. - Cette force varie en fonction de la vitesse de rotation v et de la distance d séparant l’élèment à séparer et le centre de la rotation. D’où : F = f(v,d) Exemple d’utilisation : - Séparation des cellules sanguines en Plaquettes, GR, GB et PMN. - Il existe deux types de centrifugation : Différentielle & Isopcynique. 1 – Centrifugation différentielle - Elle sépare les éléments selon leur taille. - Les éléments les plus gros se retrouvent au fond du culot et les plus léger dans le surnageant. 2 – Centrifugation isopycnique - Elle sépare les éléments selon leur densité - On définit au préalable un gradient de densité où les éléments vont tendre vers leur propre densité. La centrifugation est une méthode de choix pour séparer non seulement des cellules, mais aussi des particules. B) Tri cellulaire par adsorption - Si on met un mélange, constitué de 2 types de cellules A et B, dans un milieu contenant des Ac fixés au support et reconnaissant les cellules A, les cellules A vont se fixer au support. Par lavage, on peut éliminer les cellules B et ne conserver ainsi que les cellules qui nous intéressent. - Par la suite, il faut enlever les liaisons entre les cellules A et les anticorps pour pouvoir garder que les cellules A. On appelle ce procédé la Désorption. C) Analyse des cellules par Cytométrie en flux 1 – Présentation - La Cytométrie en flux est une méthode de tri des cellules par action d’un faisceau lumineux. 2- Fonctionnement - Les cellules sont conservées en suspension (vibration de l’appareil) et sont analysées et triées une à une par un analyseur qui varie en fonction de la taille, du nombre de cellules et de l’intensité de fluorescence. - On dispose d’un réactif qui reconnaît telle ou telle substance à la surface des cellules de la lignée désirée. - Un dispositif donne une charge + ou – aux gouttes contenant les cellules. Cette charge varie selon la cellule qui vient d’être analysée. 6 - les gouttes chargées passent dans un champ électrique très puissant pendant un très court instant au cours duquel on observe un déviation des gouttes. Il y a, ce moment-là, un tri des gouttes en fonction des cellules qu’elles contiennent. - Les cellules non triées sont regroupées dans un flacon à part. Cette opération dure quelques millisecondes pour une cellule donnée, ce qui permet un très grand rendement. VIII – Lyse cellulaire et isolement d’organite de compartiments cellulaires. A) Préparation d’extrait tissulaire et lyse des cellules Fasicule B) Homogénéisation des tissus et lyse des cellules Fasicule - Cette homogénéisation s’effectue dans un milieu isotonique, à un pH de 7-2 à 7-4 et à une température de 0 à 4°C. - Il existe 5 techniques d’homogénéisation : - Par pression : Broyage des cellules - Par pression dans un Tamis : Passage d’élément plus petits que la cellule. - Par Ultrasons : Utilisation des hautes fréquences. - Par utilisation d’un détergent doux : On fait des trous. - Par Congélation. Développement de la technique de Broyage des cellules par pression. - On effectue une rupture et une destruction des parois cellulaires par exercice de forces de pression et de cisaillement entre le Piston et les parois de l’Homogénéiseur. - Le moteur effectue une rotation de 500 à 3000 tours/minute (Appareil de Potter ou Dounce.) - Il faut trouver un compromis entre proportion de cellules lysées et la proportion d’organites intacts. - Objectifs de cette destruction cellulaire : - Analyse du contenu cellulaire - Mise en place de systèmes expérimentaux simplifiés afin d’étudier un processus biologique (sans trop de réactions parasites) - Reconstitution des ensembles fonctionnels à partir de sous-fractions. Autrement-dit, on identifie les acteurs d’un processus biologique en reconstruisant le processus à partir des organites séparés. On fait alors ce qu’on appelle une étude dans un système acellulaire. C) Sous fractionnement cellulaire 1 – Présentation - Comment séparer les différentes composantes d’une cellule ? Par sédimentation selon la taille et/ou la densité. - Il existe deux types de centrifugeurs : - Le centrifugeur classique : 20 000 tours/minute (200g) ; Réfrigération - L’ultracentrifugueur : 80 000 tours/minute (800g) ; Réfrigération sous-vide. - La Force de centrifugation : L’unité de la force exercée dans le centrifugueur est la force gravitationnelle notée « g » 7 2 – Méthode différentielle - A partir d’un homogénat cellulaire de base, on utilise la centrifugation pour séparer les organites. Cette séparation se fait de manière ordonnée (selon la taille.) Force exercée (en g) 600 Temps (en minutes) 10 15 000 10 100 000 60 300 000 120 Organites obtenus Noyau Mitochondrie Lysosome Peroxysome Mb Plasmique Microsome (RE) Edifice moléculaire (ribosomes) 3 – Méthode Isopycnique - Il faut contrôler et analyser la pureté des fractions obtenues. Pour ce faire, on effectue une mesure de contenu à l’aide de marqueurs spécifiques aux fractions. - Ces marqueurs sont principalement des enzymes. Marqueurs Cytochrome Oxydase Phosphatase acide Catalase Organites reconnu par le marqueur Mitochondrie Lysosome Peroxydase D) Analyse post-isolation 1 – Détermination de l’enrichissement en organite Mesure de : 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é - Activité spécifique = 𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡é𝑖𝑛𝑒𝑠 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑆𝑝é𝑐𝑖𝑓𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖é𝑒 - Facteur de Purification = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑆𝑝é𝑐𝑖𝑓𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑙′ 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔é𝑛𝑎𝑡 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖é𝑒 𝑑𝑒 𝑙 ′ 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔é𝑛𝑎𝑡 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 - Rendement de la purification = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 2 – Détermination du degré de pureté. - Il s’agit de quantifier la déplétion en marqueurs n’appartenant pas à la fraction (caractéristique d’une sous fraction potentiellement contaminante.) Mesure de : - Facteur d’appauvrissement = 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑆𝑝é𝑐𝑖𝑓𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑙 ′ 𝐻𝑜𝑚𝑜𝑔é𝑛𝑎𝑡 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑆𝑝é𝑐𝑖𝑓𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖é𝑒 - Rendement de la déplétion = 8 1 = 𝐹𝑃 Exemple : Activité Protéines Activité spécifique du marqueur. Homogénat initial 6 000 U 1 000 mg 6U/mg AS (HI) = 6 000 / 1 000 = 6 AS (FP) = 2 400 / 20 = 120 FP = 120 / 6 = 20 RP = 2 400 / 6 000 = 0,4 FA = 6 / 120 = 0,05 9 Fraction purifiée 2 400 U 20 mg 120 U/mg PARTIE 2 : Méthodes d’analyse de la forme et de la structure des cellules et des organites. I – Champs d’application de microscopie - Il existe deux types de microscopie : - La microscopie optique (ou photonique) - La microscopie électronique. Schéma Meulin. - La microscopie électronique possède une très grande précision d’observation qui recoupe même la microscopie photonique. Ainsi, les appareils électroniques les plus perfomormants peuvent rendre observable des entités de l’ordre de 1Å, ce qui correspond à la structure de l’atome. En signe de comparaison, la cellule a une taille de l’ordre de 10 à 20 µm, ce qui est 6 à 10 X plus petit que la plus petite particule visible à l’œil nu. II – Les principes de microscopie Schéma Meulin. - Les éléments présentés sont dans un ordre décroissant. A) Microscopie électronique - source d’électrons - Echantillon - L’image obtenue est uniquement observable sur un écran B) Microscopie photonique - Source lumineuse (= source de photon.) - Echantillon - Image observable dans l’oculaire et visualisé sur un moniteur (caméra) Quelque-soit le type de microscope utilisé, on utilisera toujours, : - des lentilles condenseurs pour condenser le flux de photons (dans le cas d’un microscopie photonique = Lentille optique) ou le faisceau d’électrons (dans le cas d’une microscopie électronique = lentille électromagnétique.) - des lentilles objectifs. SOUS PARTIE A – LE MICROSCOPE PHOTONIQUE Caractéristiques : - Grandissement maximum : 2 000 fois - Limite d’observation : 0,2 µm (mitochondries à peine visibles.) - Préparation à observer : peu épaisse. III – Les techniques de préparation et d’observation A) Préparation de l’échantillon. - Lorsque l’on veut observer un échantillon biologique en MO, il est obligatoire de préparer l’échantillon. En effet, quoiqu’il advienne, il faut faire des tranches assez fines pour pouvoir observer correctement. Pour ce faire, il existe deux possibilités : - La Fixation (= Réticulation des Macromolécules.) - Inclusion du tissu dans une matrice solide de Paraffine. - Préparation des coupes à l’aide d’un microtome. - Traitement pour révélation cellulaire. 10 - La Congélation du tissu (= Cryo-protecteur.) - Préparation des coupes au cryo-microtome. - Fixation des coupes - Traitements pour révélation des structures cellulaires. B) Observation de la cellule. - Lorsque l’on observe une cellule en MO, celle-ci est soit fixées, soit vivantes. 1 – Les différents types de microscopies photoniques - Microscope droit - Microscope inversé : Utilisé pour observer des cellules dans une boite de culture. Pour cela on constate une grande distance entre l’échantillon et le condenseur. 2 – Les différentes techniques d’observation en MO. 2.1 - Microscopie sur fond clair - On exploite la lumière transmise par le faisceau en la faisant traverser la préparation a observée. C’est celle qu’on utilise au Lycée ^^ 2.2 – Microscopie à contraste de phase - On utilise le changement de phase des ondes lumineuses. En effet, lorsque les photons traversent de la matière, les ondes lumineuses subissent un changement de phase. 2.3 – Microscopie à contraste d’interférence différentielle - On utilise les propriétés de diffraction des différentes régions de la cellule (Système optique de Nomarski.) 2.4 – Microscopie sur fond noir Ce type de procédé utilise un éclairage latéral de l’échantillon. La lumière est ainsi dispersée par la cellule dans l’objectif et celle-ci est visible par une certaine brillance sur fond noir. 2.5 – La microscopie Fluorescence conventionnelle. Utilisation de réactifs fluorescents pour analyser la fluorescence de l’épaisseur de toute la préparation. 2.6 – La microscopie confocale Utilisation des contrastes de phases et de la fluorescence. Elle permet d’analyser la fluorescence (localisation de la fluorescence) dans une coupe optique de 100 nm et effectuer une reconstitution en 3D. IV – Identification, localisation de structure cellulaire et/ou de constituants cellulaire. - On remarque que des cellules naturelles (sans traitements – dans un tissus ou en culture) sont incolores et translucides. - Ainsi, comment mettre en évidence certains composés de la cellule ? A) Mise en évidence des composés Il existe deux possibilités : - On peut employer des colorants qui se fixent à certains constituants cellulaires. Voir plus de précision dans le cours d’histologie du S2. - On peut utiliser des réactifs spécifiques : les anticorps. Ceux-ci sont capables de reconnaitre sélectivement des molécules. 11 B) Exemple de l’immunoglobuline - L’Ig est une molécule nommée ainsi car elle a un rôle de protecteur de l’organisme contre un envahisseur : c’est une globuline à fonction immunologique. Il existe différentes types d’Ig (Type A, E,G…) mais les principales restent les Ig G.La masse moléculaire d’une Ig G est de 150 kDa (50kDa/chaine lourde ; 25kDa/chaine légère.) - La molécule d’Ig est un molécule bivalente constituée de 4 chaines (2 lourdes +2 légères) et de 3 fragments : - 2 Fragments Fab (partie supérieure variable.) : régions spécialisées dans la reconnaissance sélective des antigènes contre lesquels elles agissent. Elles pèsent chacune. - 1 Fragment Fc (partie inférieure constante) : région spécifique de l’espèce. Tous les Ig d’une même espèce présente cette même partie constante. On l’utilise comme méthode d’immunomarquage V – Spécificité des Anticorps Chaque Antigène possède un étroit site de reconnaissance repéré par l’anticorps Ac. Ce site de reconnaissance est une structure dans l’espace de la molécule antigénique nommée épitope. A) Production d’Anticorps - La production d’Ac est le but principal de la vaccination. Cette production est une réaction de l’organisme qui veut se protéger. Cette protection est durable car l’organisme conserve en mémoire cette attaque et peut ainsi se protéger d’autant plus efficacement lors d’une agression extérieure par la même molécule antigénique. 12 L’expérimentateur utiliser la fusion de plasmocytes pour générer des cellules hybrides (ou Hybridomes) qui peuvent se multiplier de manière infinie. Ces hybridomes vont produire d’es anticorps dits «Monoclonaux.» B) Anticorps Polyclonaux et Monoclonaux - Ac Monoclonaux = Ne reconnaissent qu’un seul épitope - Ac Polyclonaux = Reconnaissent plusieurs épitopes. Comment obtenir un sérum d’Anticorps Polyclonaux ? Méthode de Kohler et Milstein. VI – Utilisation des Anticorps pour les immunomarquages - Une fois la protéine antigénique détectée par l’anticorps, il faut mettre en évidence cette détection. Pour ce faire, il existe deux méthodes : - Méthode directe : On greffe un marqueur sur l’Anticorps en question. - Méthode indirecte : On utilise un 3° partenaire : Un réactif marqué qui reconnaitra l’Anticorps fixé. A) Les marqueurs 1 – Les marqueurs fluorescents - Ils sont couplés à une enzyme qui reconnait la partie Fc de l’Anticorps monoclonal - Ils ont une capacité à mettre une lumière fluorescente - Exemple : Rhodamine, Fluorescéine. 2 – Les enzymes - Elles reconnaissent directement la partie Fc de l’Anticorps. - Elles permettent une visualisation du Produit. En effet, les enzymes catalysent une réaction qui engendre la production de produit. Celui-ci est visible sur un microscope à fond clair. - Exemple : Protéine GFP (Green Fluorescent Protein.) B) Les réactifs marqués - Ce sont des anticorps secondaires qui sont capables de reconnaître l’Ac d’intérêt. 13 - Ces anticorps doivent être purifiés (=Ne conserver que les anticorps qui nous intéresse) - La protéine qui a une affinité pour le fragment Fc de l’Ig G pèse 40 kDa. - Exemple : Staphylocoque doré. VII – Microscopie à fluorescence A) Pré-acquis sur la Fluorescence Molécule Fluorescente Fluorescéine Rhodamine Absorption Bleu Jaune Emission Vert Rouge B) Principe du microscope à Fluorescence - L’objectif est de faire arriver, sur l’échantillon, un faisceau d’excitation adaptée et observer s’il y a une émission de fluorescence adapté. - Pour observer la présence d’une molécule fluorescente, on utilise des filtres : Type de Filtre Bande passante Longueur d’onde qui passe 450 – 490 nm ( ) Dichroïque Seuil > 510 nm ( < 520 nm ( ) ) LDO qui ne passe pas < 450 nm ( > 490 nm ( < 510 nm ( > 520 nm ( VIII – Méthodes d’immunomarquage (L’Immunofluorescence ) L’objectif est de localiser le complexe grâce à la catalyse de l’enzyme utilisée. A) Immunofluorescence directe - Utilisation d’un marquage fluorescent (Fluorophore) directement sur l’anticorps anti-P. - L’Anticorps doit être purifié à homogénéité. B) Immunofluorescence indirecte - Anticorps n’a pas besoin d’être purifié, car on utilise un anticorps secondaire - On peut utiliser plusieurs anticorps secondaire qui vont se fixer sur le complexe Ag/Ac. C) Les différentes modalités de préparation des tissus. - L’Objectif est : - d’identifier et localiser un antigène A dans la cellule. - Localiser un organite par la détection de l’Ag A. 14 ) ) ) ) PARTIE B - Microscopie électronique IX - Le MET A) Présentation du MET - C’est un technique de microscopie qui se fait avec une colonne sous VIDE. - Grandissement : 100 000 fois - Limite d’observation : - Théorique : 1 Å (Taille d’un atome.) - Pratique : 2 à 10 nm ( 100 fois plus grand que le MO.) - L’épaisseur de l’échantillon doit être très mince (50 à 10 nm.) - On génère des coupes ultrafines qui demandent une exigence accrue quant aux conditions de coupes. - Un ME donne des informations partielles ou partiales selon l’angle de vue de l’élément observé. B) Etapes principales pour la préparation de coupes ultrafines. 1 - Fixation - Fixation : Pontage des macromolécules - Traitement - Inclusion de l’échantillon dans une « résine liquide » (pour rendre la matériel dur.) - Préparation avec un ultra-microtome (à base de diamant pour couper très dur.) 2 – Congélation - Congélation - Coupe à l’Ultra-Cryotome. - Fixation et Traitement. C) Conditions et limitation pour obtenir une image - Il faut qu’il y ait une dispersion des électrons sur l’échantillon. - Cette dispersion dépend de la masse de l’atome rencontré par les électrons. Cependant, les cellules et les tissus sont composés d’atome à faible nombre atomique, ce qui ne dispersent pas beaucoup (ou très peu) les électrons. Comment observer correctement ? - La Solution est donc l’ajout d’une étape qui est l’imprégnation. Cette imprégnation consiste à insérer dans la préparation des métaux lourds dont voici un liste : - Uranium - 238 - Plomb (Citrate) – 207 - Osmium (Oxyde d’Osmium) - 190 15 - Platine 195 - Or - 197 - Attention ! Les structures sont révélés de façon différentes selon le type de métaux lourd utilisé pour l’imprégnation. D) Les différentes types d’observation en MET 1 – Immunomarquage et observation au MET 2 – Préparation de l’échantillon pour la cryofracture et l’examen au MET - La membrane des mitochondries est riche en protéine contrairement aux membrane des GR. Mode Opératoire : - Dépôt de la suspension à analysée sur une grille recouverte d’un film de Carbone. - Après 5 minutes, aspirer le liquide et dépôt d’acétate d’Uranyle - Le métal lourd va se poser partout sauf où il y a des particules (càd sur toute la grille) - On peut observer : Bactériophage, Virus de la pomme de Terre, Virus de la Grippe, Filament d’Actine. 3 – Ombrage métallique et observation au MET. - On place un échantillon dans un milieu sous vide et un métal en évaporation qui va se déposer sur l’échantillon. - Ce dépôt va faire de l’ombrage métallique et peut aboutir à une dissolution de l’échantillon. - Exemple d’utilisation : Molécule de Myosine & Fibre de Collagène. - On mesure la taille de la macromolécule et observer la forme de certaines structures grâce à cette méthode. X - Présentation du MEB - L’échantillon fixé est déshydraté puis recouvert d’une couche uniforme de métal lourd (Platine vaporisée sous vide.) - Grâce au détecteur, le faisceau balaye la surface de l’échantillon, il y a émission d’électrons secondaires. 16 PARTIE 3 : Méthodes d’études des constituants moléculaires de la cellule I – Solubilisation des protéines membranaires A) Définition - Détergent : Molécule amphiphile possédant la capacité de former des micelles de par sa structure bipolaire (une tête hydrophile et 1 seul corps hydrophobe.) - Protéine membranaire : Protéine transmembranaire ou ancrée à la membranaire de la cellule via un pied d’ancrage lipidique. B) Comment mettre en solution ces protéines membranaires ? - On utilise des glycolipides de la membrane dont la structure est assimilable à celle des détergents Exemple : Si on a un mélange eau/huile, le détergent se focalisera entre les 2 phases. On observe la formation de micelles après agitation. - Lorsque le détergent est ajouté à la cellule, on observe une destruction des bicouches lipidiques car il y a formation de micelles mixtes et d’un complexe soluble avec les protéines. C) Les détergents ioniques 1 – A quoi servent-ils ? - Ils servent à solubiliser, changer la conformation des protéines et dénaturer des protéines par rupture des liaisons H et ioniques. 2 – Exemple de Détergents ioniques - Le Sodium Dodecyl-Sulfate (=SDS) est le plus utilisé. On peut parler aussi du Sodium Déoxycholate. II – Méthodes de séparation et purification des protéines. - Ces méthodes de séparation sont applicables à d’autres molécules que les protéines. Principe général : La chromatographie sur colonne. III – Procédés par purification d’une protéine à partir d’une solution complexe A) Chromatographie par échange d’ions B) Chromatographie par filtration sur gel C) Chromatographie d’affinité. D) Degré de Purification et rendement 17 IV – Méthodes d’analyse des protéines - Dans cette partie, on part du principe qu’on a une solution comprenant de nombreuses macromolécules de tailles et charge différentes. - Notre objectif est de séparer et d’analyser la Composition de la solution. A) Séparation des protéines. 1 – Selon leur taille : L’électrophorèse 1.1 – Quel est le principe de l’électrophorèse ? - Le principe de l’électrophorèse est simple. Il consiste à déplacer des molécules selon leur taille : Plus une molécule est grosse moins elle se déplace, donc moins elle migre. 1.2 – La préparation - Dans un premier temps, il faut générer un support de migration. Ce support c’est le gel de polyacrylamide qui se forme par polymérisation et qui présente une épaisseur de 2 à 3 mm. - Dans un deuxième temps, ce support est placé dans un appareil à électrophorèse, et on fait un puit initial où l’on va placer notre solution. - Dans ce puit, on va rajouter plusieurs composants qui sont : - Du SDS : Pour charger négativement tous les composants de la solution. En effet, la migration des composants durant l’électrophorèse va être possible grâce à la mise en place d’un champs électrique dans l’appareil. Cependant, si les composants n’ont pas la même charge (voir pas de charge du tout ^^) on ne va pas avoir une migration en fonction de la taille mais de la charge ! - Du Mercaptoéthanol : Qui est un destructeur des ponts disulfures et qui va donc éliminer les structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines. Dans le même but (détruire les structures II, III et IV), on va effectuer une thermo-dénaturation. Le fait d’utiliser du SDS et un gel de Polyacrylamide nous permet d’appeler cette électrophorèse une SDS-PAGE (=EGPA –SDS.) 1.3 – Fonctionnement & Analyse. - Une fois la préparation effectuée, on instaure le champ électrique dans l’appareil et on attend. Les molécules chargées négativement, vont se diriger vers l’extrémité + et migrer plus ou moins loin, selon leur taille. - L’analyse peut s’effectuer par la suite, par mise en évidence de « tâches » qui correspondent à la migration des constituants de la solution. - Par des caractéristiques connues au préalable, on peut déterminer la composition de la solution. 2 – Selon leur charge : L’Iso-électro-focalisation. - Une molécule chargée ne l’est pas constamment. En effet, cette charge évolue en fonction d’une propriété chimique : le pH. - Cette évolution permet de déterminer un pH précis pour lequel, la charge de la protéine est nulle. On appelle cette valeur le point isoélectrique (noté « pHi ».) 2.1 – Préparation - On introduit un gel d’ampholine qui va créer un gradient de pH. Ce gradient présente un pH très acide du pôle positif de l’appareil. 18 2.2 – Fonctionnement & Analyse - On instaure les protéines dans le gel. Celles-ci vont migrer jusqu’à leur pHi. - A partir du pHi, on peut déterminer la composition de la solution. - Protéine dont le pHi est >7 = Chargée négativement (protéines basiques) - Protéine dont le pHi est > 7 = Chargée positivement (protéine acides) 3 – Selon leur charge et leur taille : l’électrophorèse Bidimensionnelle. - Il s’agit en fait d’un couplage d’une EIF et d’une électrophorèse. - Cette technique est utilisée pour l’analyse d’extrait cellulaire brut où les composés sont nombreux. Purification d’une enzyme lysosomale : Arylsulfatase A exprimée dans la glande thyroïde. - Culture de cellules thyroïdiennes - Purification des Lysosomes contenus dans ces cellules (Centrifugation différentielle et Isopycnique) - Purification de la protéine - Composition en protéines analysée par EGAP-SDS (= SDS-PAGE) pour déterminer la masse moléculaire de la protéine. B) Séparation des acides nucléiques. - Les ARN et ADN sont analysés par SDS PAGE également. - Il faut savoir qu’ils portent une charge négative de par leur fonction phosphate (PO42- .) V – Identification d’une protéine après transfert de membrane = Western Blot - Après une électrophorèse, il est nécessaire de transférer le résultat sur une feuille de cellulose afin de pouvoir mettre en évidence les résultats. - Cette technique est appelée l’électro-transfert. 19 PARTIE 4 : Quelques méthodes d’études du fonctionnement cellulaire I – Introduction - Le fonctionnement cellulaire peut être abordé de façon dynamique en associant des approches : - morphologiques - biochimiques - moléculaires - expérimentales sur cellules vivantes telle que les marquages métaboliques avec des molécules traceurs (molécule radioactive fluorescente.) - L’objectif de cette dernière partie est de comprendre comment suivre le devenir d’une cellule. II – Méthodes d’utilisation du fonctionnement cellulaire A) Les isotopes radioactifs – Données générales principes et exemple d’utilisation. Isotopes : C’est deux types d’atomes d’un même élément chimique. La différence réside en la masse du noyau (soit le nombre de neutron.) B) Propriétés d’un isotope radioactif (ou radio-isotope.) - Les isotopes instables se désintègrent pour donner d’autres atomes. Cette désintégration s’accompagne d’un rayonnement atomique et de l’émission de particule. C’est cette émission que l’on va exploiter. 1 – Utilisation Radio-isotope : Médecine & Biologie Radio-isotope artificielle : Pile atomiques 2 – Mode de fonctionnement - Désintégration (en médecine) avec émission : - de particules β - de rayonnement γ - de positons 3 – Mode de mesure - Il existe une période radioactive (temps de demi-vie.) Exemple du carbone 14 : TDDV = 5570 ans. - Pour qualifier le niveau de radioactivité d’un élément, on parle de radioactivité spécifique. - La radioactivité est détectée avec une grande sensibilité et une grande spécificité - Il existe des compteurs qui mesurent quantitativement les désintégrations : Compteurs β et γ. - On utilise ces compteurs pour mesurer une constante physique qui mesure la désintégration par unité de temps (la minute est l’unité de temps la plus utilisée.) C) Principe de l’utilisation des isotopes dans l’étude biologique - Emission de la source radioactive de particules dans toutes les directions de l’espace. - La conséquence est que l’on ne peut qu’avoir des compteurs qui ne mesurent qu’un fraction de la désintégration. On utiliser une unité plus appropriées : cpm (= coup par minute) D) Une autre technique de détection des radioéléments : l’autoradiographie - Cette technique permet de visualiser des effets de l’émetteur radioactif sur le support. On peut détecter pour les émetteurs β, γ et de positons où se situe la radioactivité. 20 E) Utilisation des isotopes radioactifs Des atomes radioactifs sont insérés dans des molécules qui sont des précurseursou des intermédiaires des voies métaboliques Exemple : Remplacer un carbone du glucose par un isotope radioactif pour voir l’évolution du Glucose dans l’organisme. - Les molécules radioactives ou molécules marquées sont introduites dans le milieu réactionnel. - Elles se mélangent aux formes non radioactives et subissent les mêmes réactions. - Les molécules marquées sont des traceurs car : - On les introduit à l’état de traces pour ne pas perturber les conditions physiologiques de cette molécule dans l’organisme (très faible quantité) - On peut suivre leur passage et leurs transformations. - Les isotopes radioactifs ont montrés que dans la cellule vivante, les molécules sont continuellement dégradées et remplacée. III – Etude cinétique des étapes de la biosynthèse de macromolécules par les méthode du PulseChase A) Principe - On suit le devenir et le comment est chassé la molécule radioactive introduite. - On a une séquence (qui peut être réactionnelle) qui passer par différentes étapes. - On introduit la molécule marquée dans le système (quelques secondes à une dizaine de minutes selon la vitesse de transformation de la molécule.) - On suit la molécule marquée dans la séquence d’évènement. - A, B, C et D représentent différents compartiments de la cellule. Ils peuvent être : - isolés par sous-fractionnement - identifiés en ME par : - autoradiographie des produits d’une voie métabolique (trafic cellulaire.) - méthode de chromatographie - d’autres méthodes biochimiques. - Le passage de A vers B sera analysé en suivant le devenir du traceur utilisé. B) Analyse du trafic intracellulaire d’une protéine non synthétisée – Déroulement de la méthode du Pulse Chase. Cellule en culture Incubation pendant un temps court (Pulse) Incubation pendant des temps variables (Chase) Collecte des cellules et sous-fractionnement de ces cellules. Schéma du Polycopié. 1 – Préparation des fractions A, B, C et D. 2 – Imuno-précipitation de la protéine X dans chaque fraction. 3 – Mesure de la quantité de radioactivité incorporée dans X. Conclusion : La protéine X qui apparait dans la fraction subcellulaire B, passe ensuite dans C et D… A n’est pas mis en jeu car elle ne contient pas de radioactivité à aucun temps t : la protéine X ne pas donc pas dans ce compartiment A. 21 IV – Méthodes d’introduction de macromolécules dans les cellules vivantes. A) Définition Molécule lipophile : Passage par diffusion à travers la bicouche lipidique Molécule hydrophile : Pas de passage spontané à travers la bicouche. B) Méthode d’introduction cellulaire d’une molécule hydrophile X. 1 – Couplage à une ou plusieurs petites molécules lipophiles 2 – Micro-injection 3 – Electroporation 4 – Fusion Cellule-liposome* (*) Phospholipide en milieu aqueux : Composé Z à introduire – Agitation ou Ultrason – Liposome contenant X. C) Application - Fragment d’ADN (gène)placé dans un vecteur plasmidique pour faire acquérir une nouvelle fonction à la cellule eucaryote (transfection) ou procaryote (transformation) - Molécule fluorescente pour sonder une activité cellulaire - Anticorps pour bloquer une fonction cellulaire Quelques approches expérimentales particulières : - Mesure de la concentration intracellulaire de calcium : Concentration très basse normalement. - Mesure électrophysiologiques : On va pouvoir analyser le fonctionnement de membrane par transfert d’ions. 22
