LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Biologie et physiologie du développement végétal [email protected] 1 Introduction 1.1 Rappels 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.2 3 Dvpt végétal versus dvpt animal Rappels sur l’anatomie des plantes Diversité des types biologiques Cycle de dvpt d’une plante à fleur La plante : un système intégré en interaction avec son environnement 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 2 3 Contraintes de la vie fixée : adaptations développementales et plasticité du végétal Tropismes Systèmes de perception des signaux Les hormones : nature, métabolisme et effets multifactoriels Modèle d’études en bio du dvpt des plantes 2.1 Plantes modèles 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 Antirinium (gueule de loup) Arabidopsis thaliana Choix de l’espèce modèle Mutagenèse 2.2.1 2.2.2 Génération de mutant par l’insertion d’un gène dans un génome = mutagenèse insertionnelle Nouvelle stratégie de mutagenèse insertionnelle utilisant Agrobactérium 2.2.2.1 Résumé : 2.2.2.2 Utilisation de Agrobacterium : 2.2.2.3 Exemple : faire des plantes transgéniques de tabac : 2.2.2.4 Insertions de gènes rapporteurs 2.2.2.4.1 Fusion transcriptionnelle 2.2.2.4.2 Fusion traductionnelle 2.2.2.5 La mutagenèse à l’aveugle 3 La plante : un système intégré en interaction avec son environnement 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 8 9 9 10 10 10 11 12 12 3.1 Contraintes de la vie fixée : adaptations développementales et plasticité du végétal 12 3.2 Systèmes de perception des signaux 12 3.3 Perception de la lumière 13 3.3.1 3.3.2 Capacité de percevoir la direction de la lumière = Phototropisme Maîtrise de la germination et de la floraison grâce au phytochrome 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 3.3.2.4 3.3.2.5 3.3.2.6 4 3 4 4 5 13 13 Floraison Germination Effets de la lumière sur le dvpt de la jeune plantule Caractéristiques de la molécule phytochrome Structure et fonction du phytochrome (p13) Mode d’action cellulaire des phytochromes 13 14 15 15 16 18 Les hormones végétales : nature, métabolisme et effets multifactoriels 19 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 Auxine Bio$ de l’auxine Mode d’action de l’auxine Transport de l’auxine Autres effets de l’auxine Perception du signal : le mystère des récepteurs 19 19 19 21 21 21 1 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4.2 Cytokinine 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 Historique Bio$ (p16-17) Les effets de la cytokinine Transduction du signal Les Gibbérellines ou Acides Gibbérellique GA 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 4.4 Fonction : Historique : Structure de la molécule et voie de bio$ Effets des gibbérellines Voie de transduction du signal Acide abcissique (ABA) 4.4.1 4.4.2 4.4.3 Rôle, contraintes hydriques Bio$ Réponses à l’ABA 4.4.3.1 4.4.4 4.4.4.1 4.5 4.5.1 4.5.2 5 6 Transport de l’ABA pour réponse à la sécheresse Résumé des effets de ABA (p23) Experience sur les cellules de gardes des stomates Ethylène C2H4 Bio$ de l’éthylène Transduction du signal à l’éthylène Du zygote à la graine 22 22 22 23 24 26 26 26 26 27 28 28 28 28 28 29 29 29 29 30 31 32 5.1 Embryogénèse : mise en place de l’embryon et des réserves 32 5.2 Dormance et germination, régulation par les hormones et la lumière 32 Bases cellulaires et génétiques de la construction d’une plante 33 6.1 Les méristèmes et la mise en place de la structure primaire des racines et des tiges : contrôle de la division, de l’élongation et de la différenciation 33 6.2 Organisation fonctionnelle des méristèmes racinaires et caulinaires de la cell apicale aux méristèmes pluricellulaires 33 7 8 6.3 Notions de cellules souches et gènes de dvpt 33 6.4 Mise en place, dvpt et sénescence des feuilles 33 6.5 Ramification des systèmes racinaires et caulinaires 33 6.6 Dispositifs de croissance radiale 33 Evolution de la reproduction sexuée et morphogénèse florale 33 7.1 Facteurs inducteurs de la floraison 33 7.2 Paramètres structuraux et génétiques de l’induction et du développement floral 33 7.3 Evolution de la reproduction sexuée chez les Embryophytes 33 7.4 Pollinisation, auto-incompatibilité et fécondation 33 7.5 De la fleur au fruit 33 Conclusion 33 2 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 1 Introduction 1.1 Rappels P1 Plantes sup = spermatophytes Evolution des caractères biologiques Algues : milieu diff. Contraintes du mil adaptation Les plantes : tissu soutien, conducteurs, repro « à sec » Sortie du milieu aquatique vx Communication cellulaire gaz Tissus reproducteurs au sommet des tissus végétatifs Trias : Végétaux supérieurs Puis plantes à fleurs et à ovules, hermaphrodites et spermatophytes modernes Endosymbiose photo$ Origine évolutive des plantes à fleurs (angiospermes) converge à un ancêtre. se sont diversifiées après P2 Arbre des eucaryotes Angiosperme (les 2 du bas des Métaphytes) Il existe d’autres lignées photo$ : algues brunes et vertes (endosymbiose secondaire) Origine évolutive lignée verte : adaptation terrestre 1.1.1 Dvpt végétal versus dvpt animal Animal - cellule souple - division animale par pincement végétal -paroi pectocellulosique (paroi rigide) - plan de div pré établi, marqué par une bande de prot (plaque) constituant des MT = phragmoplaste - plan de div établie selon orientation, ou asymétrique - blastulation (stade morula) : homogénéité dans les cellules - dès la première div : div asymétrique - plan de div TJS le même selon l’espèce donnée - définition de 2 pôles : apical (embryon) et basal (tissu suspenseur) - une cell est totipotente (mise au point avec cell de mésophylle), on peut obtenir un embryon ou une racine - permet de sauver les espèces en voie de disparition - fonctionnement des méristèmes (cell - les cell animales peuvent régresser au st. cell souche (mais découverte assez nouvelle) 3 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 souches) peuvent générer en permanence des organes durant tout le long de la vie de la plante 1.1.2 Rappels sur l’anatomie des plantes - sèves brutes/ élaborée - connexions entre cellules via APOPLASME (circule à l’ext) et SYMPLASME (circule à travers les cellules) - jonctions cellulaires : jonction GAP (p11 fig 15,24) - Plasmodesme = RE commun à 2 cellules permettant le passage de molécules - spermaphytes forment les végétaux complexes 1.1.3 Diversité des types biologiques Il existe deux grands types de plantes à fleurs : Monocotylédone Dicotylédone - embryon à 1 cotylédon - embryon à 2 cotylédons - nervure // - nervures ramifiées - pas de racine principale - racines latérales et racine principale - nb de pétales multiple de 3 (fig 3.40 p6) ≠ types de végétaux se distinguent par le mode de reproduction : ¤ Plantes annuelles : - cycle de vie entier, meurt dans l’année, - part de la germination de la graine dvpt de la partie végétative puis mise en place de la structure de reproduction qui donne 1 fruit/ graine entouré dans les tissus maternelle qui donnent les fruits - graine = structure sèche qui permet à la plante de résister (stratégie de survie) ¤ Plantes pérennes - survivent plusieurs saisons, plusieurs années - plantes à bulbe, stock la partie végétative sous forme de tissus souterrains (réserves de molécules riches en énergie) - la partie aérienne est sacrifiée car sensible au gel ¤ Espèces ligneuses, arbre : - partie aérienne - dvpt maintient structure solide qui permet la colonisation dans l’atmosphère de tissus photo$iques - en hiver, ils se débarrassent des feuilles ¤ Cryptophytes : espèces qui maintiennent 1 partie aérienne en mauvaise saison, plante qui se cache 4 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 1.1.4 Cycle de dvpt d’une plante à fleur POLLINATION FERTILIZATION ZYGOTE (1 CELL) EMBRYO DEVELOPMENT SEED 1.2 La plante : un système intégré en interaction avec son environnement 1.2.1 Contraintes de la vie fixée : adaptations développementales et plasticité du végétal (p 8-9) • Perception de la lumière (photorécepteurs) • Perception de l’environnement chimique • Racines perçoivent des minéraux. ex : nitrate , CO2 • Perception physique • T°C, vent, force de gravité Plusieurs expériences : p 5, p12 1.2.2 Tropismes 1.2.3 Systèmes de perception des signaux 1.2.4 Les hormones : nature, métabolisme et effets multifactoriels 2 Modèle d’études en bio du dvpt des plantes 2.1 Plantes modèles 2.1.1 Antirinium (gueule de loup) Possède deux atouts : 5 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - mode de dvpt de la fleur particulier avec une fleur sans symétrie radiale mais latérale, pétales soudés. - Existe sous forme de mutant : soit mutant de couleur ou de forme étude des gènes de bio$ du dvpt - donc abs de pigments, existence de mutants à sym radiale gènes mutés - comment identifier les gènes resp du dvpt ? Existence d’un transposon… lorsque fleur était au stade à 2 cell, une cell mutante s’est libérée de la présence du transposon réversion génétique - si on connait la sq moléculaire du transposon, il suffit de digérer l’ADN du mutant et de récupérer le locus contenant le transposon. Autres modèles : Zea Mais (mais sauvage est brun ou violet donc nous mangeons des mais mutants) Oriza sativa Medicago sativa ou troncacula (luserne) étude mutant de fixation de l’azote …symbiose 2.1.2 Arabidopsis thaliana - étude du dvpt de la plante - plante de la famille des Crucifères (choux) - aisance de génération de mutants ponctuels en imbibant graine dans sub mutagènes ou en irradiant les graines avec des rayons gama - génome de l’espèce simple, non redondant donc proba d’identifier les mutants augmente - toutefois 60% des gènes présents à l’état dupliqué - génération de 2 mois (2-4 générations à l’année) - croisement possible en pollinisant une plante émasculée - petite taille (1m²= 50 plantes) 2.1.3 Choix de l’espèce modèle - dans l’idéal : généralisation à l’ensemble des plantes ex : sauvage et mutant incapable de $ ho de croissance de arabidopsis et riz mutation du gène de croissance 2.2 Mutagenèse 2 façons employée par les généticiens : • Mutagenèse insertionnelle (transposon) • Utilisation de Agrobacterium 2.2.1 Génération de mutant par l’insertion d’un gène dans un génome = mutagenèse insertionnelle Mutants générés par la plante naturellement par mobilisation de transposons (= sq d’ADN mobile qui peut s’insérer au hasard sur un K de son hôte) 6 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Deux manières d’agir pour le transposon : - transposons s’insère dans le cadre ouvert de lecture (succession de codons qui codent pour un peptide) code génétique interrompu mais peptide transcrit - transposons s’insère dans le gène au nv du promoteur d’un gène ou dans la partie non codante et amène signaux d’arrêt de la transcription gènes n’est plus transcrit Rmq : - souvent mutation nulle (abs totale du produit du gène) ou mutation avec expression modérée du gène lorsque transposon est situé à proximité du gène qui est seulement perturbé - normalement transposon endogène mais on peut prendre transposon d’une autre espèce Petite histoire de prix nobel : - 1950 Barbara Mc Intock travaillait sur la transmission des caractères anormaux chez le mais mutation pas stable dans le temps, peuvent réapparaitre Théorie : il existe dans le génome des gènes qui ne sont pas à un endroit (prix nobel) - Identification de 2 éléments mobiles : activator (AC) autonome + dissociator (DS) non autonome ayant besoin d’une enzyme codée par AC - AC et DS ensenble sont fonctionnels - plus tard, intro dans d’autres plantes modèles même comportement mutation de gène Exp de southern blot (séparation selon taille) : mutagénèse insertionnelle Détection de transposons (Mu) dans le génome du maïs Détection de l’allèle muté et sauvage d’un gène dans le génome du maïs 7 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - on voit sq qui indiquent qu’il y a de nombreux transposons dans le génome du mais donc difficile d’identifier celui responsable de la mutation - transposon tjs présent chez les mutants et non chez les sauvages - révélation avec une sonde du transposon qui s’est inséré dans gène muté - récup gène séquençage - détection de transposons (Mu) NB : Chez Arabidopsis on a utilisé transposon du mais 2.2.2 Nouvelle stratégie de mutagenèse insertionnelle utilisant Agrobactérium - Agrobacterium tumeraciens crée maladie appelé « la galle » du collet (entre tronc et racine) par un évènement de transgénèse - cell de la tumeur primaire se div en abs d’ho de croissance (pas de métastase, car cell végétales ne migrent pas) - due à l’insertion de gène codant pour des enzymes d’ho de bio$ végétales dans le génome des cell infectées - croissance anarchique, localisée à l’endroit de l’infection - but : transfert de gènes de bio$ d’aa utiles à la bactérie nouvelle niche - les gènes procaryotes transférés ne sont pas supposés fonctionner dans une plante (eucaryote) surtout que la bactérie elle-même ne sait pas les utiliser Obtention de mutants par Agrobacterium = outil de transgénèse - chez l’animal on peut injecter un gène dans tissu et ADN se retrouve dans cellule, noy et puis dans ADN cellule animale modifiée génétiquement facile - chez les végétaux, deux obstacles : paroi, vacuole au centre de la cellule qui prend 80% du volume cellulaire et pression hydrique pas facile sans faire exploser la cellule - Agrobacterium tumefaciens possède un plasmide géant TI (tumor inductible) - plasmide possède : 8 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - gènes de réplication du plasmide (rep) - gène de virulence (vir) - ADN Transféré (ADN T) contenant gène de l’opines (codent pour gène codant pour enz de bio$) et d’ho végétales - si blessure dans cellule végétale, bac peut transférer gène ADN T (p 29) - cellule vég $ indicateur de blessure perçut par bac du sol - récepteurs codé par protéine virA et virG de la bac qui fixent mol - vir G activation de la production de l’ADN simble brin par coupure produit par série d’évènement codé par gène de la région Vir - ADN simple brin fixe VirD de façon cov + chapelet de protéines Vir E pour protection (ressemble à un virus) - structure migre de la bac. à la plante par pont cytoplasmique via la protéine Vir B à l’endroit où il n’y a pas de paroi pectocellulosique - complexe transféré de façon active au cyto de la cellule végétale - pénétration dans le noy par pore nucléaire - dans nucléoplasme, ADN T s’intègre dans le génome via probablement une coupure de l’ADN simple brin 2.2.2.1 Résumé : - ADN T d’origine bactérienne (portion d’ADN plasmidique transféré du plasmide bactérien vers l’ADN de la plante) - transfert induit par molécule codante dont protéine G (opéron) qui active région Vir - insertion de l’ADN T se fait quasiment au hasard du génome nucléaire végétal et ressemble à un méca de recombinaison illégitime - qq nucléotides complémentaires mais pas tous - les enzymes de recombinaison et de réparation de la plante intègrent le génome bactérien 2.2.2.2 Utilisation de Agrobacterium : - utilisation du plasmide désarmé (ne produisant pas la maladie) pour insérer gènes d’intérêt dans plante - outil de mutagénèse insertionnelle cellule mutée dans un gène récup cellule mutée cellule totipotente plante mutée - ADN T peut être transféré jusque dans les gamètes surtout femelles car Agrobacterium peut vivre dans fleur - insertion de gènes de résistance à des herbicides et aux antibiotiques pour sélectionner les cellules ayant intégrées ADN T (c’est pour ça que les OGM possèdent une résistance aux antibiotiques) - 1/1000 vont être transformés - ADN T a une chance sur deux de tomber dans un gène - aujourd’hui on peut trouver dans le commerce tous les mutants d’inactivation de gène 9 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 2.2.2.3 Exemple : faire des plantes transgéniques de tabac : plante mère prélèvement de disques filiaires incubation en présence de Agrobactérium milieu de sélection des cellules transformées (GSV) Micropropagation de bourgeons (culture in vitro) plantule plante exprimant le gène d’intérêt - chez arabidopsis on trempe directement les fleurs dans agrobactérium 2.2.2.4 Insertions de gènes rapporteurs Insertions de marqueurs de localisation cellulaire (gène dont l’expression va être facilement observable) On fait une fusion transcriptionnelle en prenant le promoteur du gène d’intérêt inséré devant la séquence d’un gène de bactérie - insertion dans le plasmide Ti - gène GUS capable d’hydrolyser le glucuronide - précurseur hydrolysable synthétique du glucuronide (X-gluc) 2.2.2.4.1 Fusion transcriptionnelle Fusion transcriptionnelle = indique la capacité de transcription d’une séquence d’ADN étudiée, on accouple physiquement un promoteur de gène à un gène rapporteur (ex : GUS), ce qui permet de colorer les territoires où le gène va s’exprimer en bleu. Ex : suite à un stress on peut voir que des gènes luttant contre le stress s’exprimer grâce à l’introduction d’un promoteur et d’un gène rapporteur (coloration X-glu) On trempe les plantes dans le substrat de βglucuronidase. Permet l’identification du rôle d’un gène 10 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Fusion transcriptionnelle Promoteur du gène d’intérêt RB ATG Stop NPTII LB Séquence du gène GUS (gène de bactérie) Resistance à Kanamysine Enz Glucuronidase (E.Coli) 2.2.2.4.2 Fusion traductionnelle Fusion traductionnelle = prélèvement de la totalité du gène et couplage de l’ensemble à une nouvelle séquence codante marqueur de la séquence du gène. Transcription et traduction vont ê observées en même temps. On enlève le codon stop et on remplace la partie non codante par un gène de protéine fluorescente (GFP : Green Fluorescent Protein) ex : on peut détecter la présence d’organismes vivants ( présence d’ATP) dans les piscines 2 infos : une info sur la traduction, la régulation et la localisation cytologique de la protéine en question Fusion traductionnelle RB Promoteur du gène d’intérêt ATG Stop Partie non codante remplacée par séquence fluorescente GFP LB Chez méduse : Photons bleus (400 nm) Photons verts Luciférine + ATP Luciférase GFP 11 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 2.2.2.5 La mutagenèse à l’aveugle = apport d’ADN exogène grâce à Agrobacterium = Génération de mutants par traitements chimiques/physiques des génomes des plantes Traitement mutagène sur grand nb d’individu (nb optimal : 105 -106) (cf p 28) Chez Arabidopsis, traitement mutagène sur gamètes difficile alors on fait la mutagénèse sur les embryons. 1) Traitement chimique EMS (Ethyl méthane sulfonate ; méthyle les bases de l’ADN => création d’aberration dans le génome => erreur dans la réplication de l’ADN) 2) Rayons X et gama, neutrons rapides créent cassures dans l’ADN ou trous qui peuvent être mal réparer et créer des mutations. Il existe 4 cellules utiles à la mutagenèse dans l’embryon d’Arabidopsis, donc 4 types de générations mutantes dvpt de la plante devenue chimère et constituée de cellules mutées et d’autres normales. Il faut repérer les parties mutées de la plante utilisation des graines : 1/16 de mutants dans la descendance. Explication : Le ¾ des graines proviennent de la partie de la plante qui n’a pas subi la mutagénèse. ¼ des graines sont issues d’une cellule de l’embryon mutée de manière récessive qui donne un phénotype mutant (homozygote mutant m/m) que dans ¼ des cas. 3 La plante : un système intégré en interaction avec son environnement 3.1 Contraintes de la vie fixée : adaptations développementales et plasticité du végétal (voir intro) La plante subit son environnement car ne peut pas se déplacer pour se trouver dans des conditions plus favorables à son dvpt ou à sa reproduction. Ex : plantes à la montagne et en ville, plante qui subit des tremblements, plantes percevant la gravité La paroi pectocellulosique réduit les échanges aux jonctions 3.2 Systèmes de perception des signaux (voir intro) = constitué d’un R, de molécules signal et de réponses 12 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 3.3 Perception de la lumière perception de la direction de la lum, distinction entre plusieurs longueurs d’onde, adaptation du dvpt et de la croissance 3.3.1 Capacité de percevoir la direction de la lumière = Phototropisme Dès 1830, Darwin (père et fils) démontrent que des plantes céréales (coléoptyle) en germination orientent leur croissance en f° de la direction de la lumière (exp avec fente dans une boite) En 2002, le mutant nph (non phototropic hypocotyl) a un hypocotyle qui ne répond pas au phototropisme. Il y a donc un gène qui code pour un élément ayant un intérêt évolutif qui permet à la plante de détecter la direction de la lumière. Une plante qui pousse vers la lumière expose la max de surface foliaire vers la lum et donc optimise sa photo$. Le gène npf code pour protéine mbR PHOT (récepteur). PHOT incapable de percevoir la lum toute seule. Elle est accompagnée de cofacteurs flaviniques (FMN) qui absorbent la lumière. Le complexe PHOT+FMN absorbent la lum et déclenche un signal cellulaire ( ?) qui a pour cq l’inhibition de la croissance des cellules excitées par les photons. Du coup la croissance est asymétrique sur la tige à cause des cellules exposées qui arrêtent leur croissance. La nature des photons influant sur la phototropie : les bleus seulement sont capables de déclencher le phototropisme alors que le rouge est efficace pour la photosynthèse. Hyp : la lum bleue est bcp moins diffractée par l’atmosphère, les longueurs d’onde courtes sont donc les meilleurs indicateurs de la direction des rayons solaires (en plus rouge peut être aussi un reflet de la présence de végétaux à proximité). 3.3.2 Maîtrise de la germination et de la floraison grâce au phytochrome Le deuxième type de perception de la lumière qui agit sur la germination des graines, la floraison de la plante et aussi sur la différenciation des cellules photosynthétiques du à une molécule nommé phytochrome. Petite histoire : - Décalage des dates de « semage » sur plusieurs semaines, pour récolter le soja sur plusieurs semaines. => mais ttes les cultures de soja fleurissent en même temps ! 3.3.2.1 Floraison - Le mammouth du maryland (tabac qui ne fleurit jamais) => avantages économiques ! 13 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 => mais on peut donc très difficile d’obtenir des graines, plantes incapables de différencier les saisons Saison de floraison dépend de la longueur du jour. On distingue 3 types de plantes - neutre : longueur du jour n’influe pas - à jours courts (j<12h) : chrysanthèmes - à jours longs (j>12-14h) : iris Expérience p 68 : Plantes à jours courts Lorsque les nuits sont courtes état végétatif de la plante Lorsque les nuits sont longues floraison au bout de qq jours Si on réveille les plantes par réveil lumineux nuit interrompue état végétatif La plante assimile la situation à une longue journée. Plantes à jours longs : Inverse des chrysanthèmes. Nuit interrompue assimilation à longue journée floraison On s’aperçoit que les plantes sont sensibles à la durée où elles sont privées de lumière. Les 2 types de plantes perçoivent la même info mais la traite différemment. Ce phénomène dépend du phytochrome qui est spécialisé dans le rouge et le rouge lointain : - rouge (660 nm) déclenchement de la floraison - rouge lointain (730 nm) inhibe floraison. - C’est un phénomène réversible (R + RS annule l’effet du R) : dernière longueur d’onde perçue compte - phytochrome présent dans les parties végétatives de la plante 3.3.2.2 Germination Graines de laitue ne donnent un bon rendement de floraison que si elles sont préexposées à la lum => pb économique donc laitue devient modèle Graines de laitues répondent particulièrement bien à la lumière Ccl : Existence de mécanismes qui contrôlent la floraison, la germination ! L’environnement lumineux des végétaux varie, ainsi que la durée et la qualité. On quantifie la lum en µmoles par m² par secondes (midi 1000, sous couvert végétal 10-100) Plus de rouge lointain la nuit et même proportion pendant la journée. 14 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Phytochrome permet de connaitre la position de la plantes par rapport aux autres. La dernière longueur d’onde perçue par les graines de laitue est : - rouge 660 nm => déclenchement de la germination, - rouge lointain 730 nm => inhibition de la germination => Effet phytochrome réversible ! Donc existence de R ayant une cap de discrimination importante. Donc on fait l’hyp la plus simple = un seul R qui absorbe 2 longueurs d’onde différentes étant capable d’informer la cellule. Phénomène de réversibilité possible seulement lorsqu’on est au niveau du moment de perception du signal (avant que le processus physiologique soit déclenché). = > limité dans le tps 3.3.2.3 Effets de la lumière sur le dvpt de la jeune plantule - aspect étiolé (skotomorphogenèse) des plantes poussant à l’obscurité (feuille jaunie, tige et hypocotyle s’allongent, cotylédon refermé et petit, racines à peine visible) - à la lum désétiolement mais phénomène pas vraiment réversible - phytochrome impliqué - dvpt à lum = photomorphogenèse - skotomorphogenèse croissance des cellules de l’hypocotyle sans divisions (grandes cellules) - différenciation et croissance cellulaire : épiderme de cotylédon - à l’obscurité petite cellules id - à la lum apparition de stomates et croissance des cellules - à l’échelle cellulaire : étioplaste chloroplaste - croissance stimulée par le RL (longueur d’onde qui passe à travers les autres plantes) et inhibée par le R. Donc compétition force la plante à pousser plus que ces voisines 3.3.2.4 Caractéristiques de la molécule phytochrome - purification biochimique par chercheurs ayant cultivés des plantules de blé étiolés - caractéristique attendue : mol absorbant le R et le RL - protéine soluble - capacité d’absorbance : 280 nm (car protéine), 400 nm (petite bleu), 660 nm (pic R) Spectre du phytochrome = spectre d’action - in vitro si on éclaire protéine à 660 nm, si on refait spectre d’absorbance du même échantillon , alors spectre nouveau avec pic à 730 nm 15 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - phytochrome natif absorbe à 660 nm - phytochrome activé par éclairement à 660 nm absorbe à 730 nm - phytochrome activé par éclairement à 730 nm absorbe à nouveau à 660 nm …. On peut transformer le phytochrome en l’éclairant avec les longueurs d’ondes. (p 13) 3.3.2.5 Structure et fonction du phytochrome (p13) 660 nm 730 nm Changement de conformation du dernier cycle du chromophore - homodimère = polypeptide de 250 kDa - polypeptide n’a pas de particularité concernant son absorbance - groupement formé de 4 cycles capable d’absorber la lum lié de façon cov sur l’exté Nt de la protéine = chromophore qui change de conf du dernier cycle (cis / trans) selon λ absorbé 16 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - asso polypetide + groupement = phytochrome actif - exté Ct = régulation du peptide, transmission du signal au reste de la cellule 2 types de mutants : - sans chromophore = muté à l’exté Nt non perception de la lum - avec chromophore mais muté au niveau Ct pas de transmission du msg 2 types de phytochrome importants A et B : - A extrêmement abondant chez plante à l’obscurité, et inexistant à la lum capte très petites quté de lum - B activé par du rouge prend la place de A A darkness Light directional light Résumé : - Germination - Désétiolement - Floraison - Evitement de l’ombre shade direct light reflected light cotyledon hypocotyl shade avoiding characteristic photomorphogenic phototropic etiolated Existence d’un équilibre entre les 2 formes de phytochromes. Le rapport des deux est interprété par la plante. 17 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 3.3.2.6 Mode d’action cellulaire des phytochromes Lors de fusion traductionnelle entre le phytochrome et la GFP (gène rapporteur), les 2 polypeptides sont traduits comme un seul par la cellule. On voit une fluorescence verte dans la cellule à l’obscurité Si illumination dans longueurs d’onde R absorbé par phytochrome, la protéine change de conf dans la cellule, phytochrome migre vers le noyau. Si illumination dans longueurs d’onde RL absorbé par phytochrome, la protéine change de conf dans la cellule, phytochrome migre en dehors du noyau. Phytochrome activé va dans noyau se lie à facteur de transcription et permet la transcription des gènes d’intêret. NB : cryptochromes absorbent la partie bleu (400nm) du spectre qui peuvent déclencher le dé-étiolement. Les mutants de phytochrome sont aveugles dans le rouge 18 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4 Les hormones végétales : nature, métabolisme et effets multifactoriels 4.1 Auxine schéma - l’histoire commence avec le phototropisme (les Darwin père et fils 1880) : l’exté de la plante (coléoptyle) perçoivent la lumière - Boysen Jensen (1913) : incision de la moitié du coléoptyle du coté de la lum , alors croissance vers la lum - Hyp 1 : substance diffusible descend du sommet vers le coléoptyle qui fait une croissance directionnelle - Paal (1919) - Hyp2 : substance permet une croissance différenciée (auxèse) du à l’acculation préférentiel dans les tissus à l’obscurité - Went (1926) : purification Auxine permet une croissance différenciée (auxèse) due à l’accumulation préférentielle dans les tissus à l’obscurité Auxine (acide indol acétique) : mol diffusible Molécules d’auxine AIA et Auxine synthétique ont en commun le cycle et la partie acide acétique. A forte [c], l’auxine a un effet toxique (agent orange au vietnam). 4.1.1 Bio$ de l’auxine - à partir du trp - désamination - décarboxylation - oxydation molécule active P14 d poly ADN T contient gène de bio$ d’ho : voie bactérienne de bio$ de l’auxine (2 étapes) au niveau du collet de la plante Voies de stockage et de dégradation de l’auxine. Il n’y a pas de système d’excrétion chez les végétaux, il faut donc mettre en place des systèmes catabolique qui se font essentiellement par l’oxydation et dégradation Certaines formes d’auxine sont inactivées réversiblement 4.1.2 Mode d’action de l’auxine 19 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Auxine provoque l’acidification de la paroi. L’acidification provoque l’élongation Théorie de la croissance acide pH naturellement à 5,5 pH avec l’auxine diminue de 1 unité de pH : 4,5 donc 10 fois plus de proton dans le milieu extérieur. Donc l’auxine permet à la cellule de pomper des –OH ou en réalité par excrétion de H+ par des ATPase de type plasmalemmique. Croissance possible seulement en milieu acide et stoppée en milieu basique. La fusicoccine (toxine de champignons) déclenche l’acidification du milieu ext par activation des pompes à protons (5,23 .4,2) et donc la croissance. Une fusion transcriptionnelle (du Promoteur DR5 et de GUS) montre la présence d’auxine dans les cellules en croissance. DR5 est transcrit de façon dose dépendante par l’auxine. Modification des interactions faibles entre les différents composés de la paroi. Tous les groupements acides se protonnent et donc moins de charges dans la cellule. Il existe une protéine de paroi, l’expensine activée dans ces conditions acides et qui participent à la destruction des différents composés de la paroi. Chair ramollie Par effet mécanique la cellule peut augmenter de volume car il n’y a plus de force qui vient s’opposer à l’entrée de l’eau dans la cellule par un phénomène d’osmose. Attention : la sensibilité à l’auxine n’est pas uniforme. Racines 10000 à 100000 fois plus sensibles que les tiges !! Faible [AIA] stimule, forte [AIA] inhibe la croissance (mais stimule les mitoses et autrs effets) Tronc Buds Concentration en auxine Exemple d’action de l’AIA Le gravitropisme positif racinaire dépend de l’AIA. La perception de la gravité modifie l’accumulation d’AIA. L’AIA s’accumule « en bas » et inhibe la croissance cellulaire Attention c’est l’inverse dans la tige. Perception Transduction Transmission Courbure La perception de la gravité se fait dans des cellules de la coiffe de la racine au niveau des statocytes. Les statolithes (grains d’amidon) sont sous le gradient de gravité. La densité importante des statolithes fait qu’ils se repartissent tjs au fond de la cellule. La modification de la position de statolithes permet à la cellule de 20 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 percevoir la gravité et de répartir asymétriquement l’auxine. Si une plante de ne peut pas stocker l’amidon, elle ne peut pas percevoir la gravité. P43 Dans la coiffe de la racines 4.1.3 Transport de l’auxine L’auxine est transportée de façon polarisée apicobase - auxine synthétisée à l’apex - auxine transportée vers les zones en croissance - Mutants de transports d’auxines ont une croissance anormale - protéines AUX 1 et PIN ont des ptés de transport Le mutant aux1 est insensible à l’auxine naturelle mais sensible à une auxine synthétique. Auxine naturelle n’est pas transportée et l’auxine synthétique diffuse. AUX1 est un transporteur d’import d’auxine. Exp : Immunodétection du transporteur d’influx AUX1 et du transporteur d’efflux PIN1 dans la racine d’arabidopsis (p43) Ac fluorescent AUX1 transporteur d’influx chargé de pomper l’auxine depuis le milieu ext vers l’int de la cellule En absence de AUX1, les mutants ne réagissent pas à l’auxine. PIN1 transporteur d’efflux Influx et efflux sur face opposée de la cellule. Pour expliquer un transport polaire de l’auxine on faisait référence au piège à anions. - A pH acide la fonction carbox est protonée et donc l’ho peut entrer dans les cellules par diffusion Dans les cellules l’auxine est chargée négativement et donc piégée dans la cellule. Mais il existe des transporteurs d’influx (AUX1) et d’efflux (PIN1). L’auxine en se liant à de petites protéines peut déclencher l’activation de pompes à H+ ATPasiq. 4.1.4 Autres effets de l’auxine - Dominance apicale - Division et différenciation : - Différenciation du fruit - Différenciation des vx et des hydatodes Expérience de Nitsch en 1950 – rôle des akènes 4.1.5 Perception du signal : le mystère des récepteurs 21 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - 1er épisode : la protéine ABP1 est un candidat sérieux - très affine pour l’auxine - localisée dans le mb du RE - A un rôle dans la réponse de l’auxine Protéine ABP1 active croissance de cellule et nécessaire pour ttes les réponses dépendant de l’auxine. - 2ème épisode : les produits des gènes AXR et TIR sont des récepteurs - Mutants affectés dans leur réponse - Protéines solubles dans le cytoplasme - Modulent la présence de répresseurs à l’action de l’auxine Détection du complexe AXR-TIR en présence d’auxine seulement. P10 du poly : …. Voir la suite avec nadia Résumé : Inhibition : - abscission des jeunes feuilles (empêche la chute des jeunes feuilles et stimule celle des feuilles agées) - formation des tubercules 4.2 Cytokinine 4.2.1 Historique - régénération des tissus des végétaux bourrelets des tissus (zone de cicatrisation) cellules se sont divisées pour recouvrir l’endroit de la blessure - recherche sur facteur de la cytokinèse (division des cellules) - mise en place d’un test biologique : découpe bout de tige sur milieu axénique (sans vie) avec extrait chimiques tirés des végétaux - concentré végétal peut déclencher cytokinèse chez tissus bléssés - dans jeune tissu en croissance on trouve bcp de cytokinine (le lait de noix de coco riche en cytokinine = albumen de l’embryon =tissu liquide) - on identifie dans un vieux pot d’adn riche en cytokinine qui contient de l’adn tiré de semence de saumon => activité de cytokinine => modification biochimique naturelle ?? on pensait que ça venait de l’adn 4.2.2 Bio$ (p16-17) AMP transZéatine (p17) Formule chimique Trans-zéatine : - cytokinine dérive de l’adénine - groupement isopentenyl sur azone n° 6 - il existe des ho synthétiques : 6 benzylamino purine (BA), kinetine… 22 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 - formule inactive : zéatine riboside/ribotide AMPAdénosineisopentonyl grâce à l’enzyme ipt transfèrant isopentenyl On retire P et ribose Molécule active La 1ère étape est l’étape la plus importante car limitante car si on transfère gène codant pour l’ipt qui a pour cq une accumulation de trans-zéatine. Donc ipt régulé ! Le lieu de la bio$ : - on pensait que les cytokinines avaient une bio$ dans la racine puis transport acropétales - en réalité, la cytokinine est produite à l’endroit où elle agit (pas transporté à l’échelle de l’organisme entier) - mise en évidence grâce aux cytokinines oxidase (qui élimine les cytokinines) qui agissent de façon locale, la plante entière n’est pas affectée. 4.2.3 Les effets de la cytokinine - agit sur la division cellulaire - sur l’état de différenciation des cellules en particuliers à l’obscurité les tissus se différencient en chloroplastes en présence de cytokinine mime la photomorphogenèse apparition de bourgeon après qq jours - sur la différenciation des cellules en cellules puits (qui acceptent le produit des sèves élaborées) Aa radioactif donc aa ne prend pas la voie du phloème 24-48 h Cytokinine Aa radioactif 24-48 h Radioactivité sur feuille inbibée de cytokinine Feuille puit donc aa transportés dans phloème Auxine et cytokinine agissent en synergie : à forte concentration il y a tumorisation Auxine rhizogenèse Cytokinine tissus verts, bourgeons Balance hormonale 23 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 Tumeur de agrobacterium tumefaciens et rhizogenes - tumefaciens : $ auxine et cytokinine - rhizogenes : $ cytokinine seulement On peut donc dicter l’état de différenciation des cellules en modifiant les concentrations des ho cytokinine et auxine. - 0 ho rien - grande concentration formation de cale, pas de différenciation - cytokinine majoritaire différenciation en bourgeons et feuilles - auxine majoritaire embryogenèse sur cale Effet de la cytokinine p19 : 4.2.4 Transduction du signal P18 - mutant CRE1 qui ne perçoit pas les cytokinines - CRE1 code pour un récepteur transmbR présent chez tous les eucaryotes en particuliers chez la levure - dans la levure, le récepteur SLN a permis d’id la totalité des réponses - SLN permet de reconnaître glucose dans environnement en activant les gènes qui codent pour des enzymes de dégradation du glucose - par analogie, chez les plantes on a trouvé les gènes qui pourraient déclencher une réponse - récepteur à 2 composants, TM en homodimère ayant pour ligand la cytokinine - composant accepteur et receveur sur même protéine - changement de conf - autophosphorylation du récepteur - phosphorylation de ASP (protéine soluble) - AHP importé dans noyau - AHP phosphoryle la protéine ARR - ARR déclenche les réponses à la cytokinine en passant par l’activation de la transcription ou par une action directe Exp : - partie Nt de gène de plante qui code pour la partie R des cytokinine est fusionnée avec la partie du gène de levure qui code pour la transmission du signal - donc levures doivent percevoir la cytokinine et penser que c’est du glucose - levure mutante ne pousse pas en présence de glucose mais en présence de cytokinine qui active le récepteur responsable de la perception du glucose - levures poussent parce qu’elles se nourrissent de glucose seulement si elles le perçoivent 24 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 25 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4.3 Les Gibbérellines ou Acides Gibbérellique GA 4.3.1 Fonction : - ho de croissance et ho de différenciation en particuliers ayant un rôle important dans la floraison et ho pour dvpt des semences au moment de la germination 4.3.2 Historique : - épidemie = la maladie du riz fou => pourrissement du riz suite à une croissance incontrôlée - infection par champi (gibberella fujikuroi) qui digère tissu végétaux tombés ds rivière - purification du composé qui stimule la croissance du riz à partir de filtrat de champi - on pensait avoir trouvé une molécule de champi qui fait pousser les plantes mais en fait elle est $ par les plantes naturellement (convergence évolutive) 4.3.3 Structure de la molécule et voie de bio$ p20 26 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 ¤ 1ère étape dans les plastes (essentiellement non photo$iq) : - isopentenylpyrophosphate (IPP) GGPP (gyranylgyranlpyrophosphate) ent kaurène ¤ 2ème étape dans RE : - ent-kaurèneGA53 +12 ¤ 3ème étape dans cytoplasme : - GA53 GA….. GA grâce à GA20 oxidase régulée par l’auxine qui déclenche la transcription du gène codant cette enzyme - dernière étape GA GA subit un rétrocontrôle par les produits - dernière étape d’activation par hydroxylation de C… de GA2 - inactivation par hydroxylation de C… au dessus de GA2 4.3.4 Effets des gibbérellines ¤ Croissance par élongation : Réorientation des MT (à court terme) : MT permettent d’approvisioner la paroi en précurseurs, enz de bio$ (cellulose $ase) cf schéma $ d’aquaporines (TIP : tonoplaste intrinsic protéine) (à long terme) : entrée d’eau dans vacuole génère une pression sur la cellule qui permet sa croissance ¤ Germination : P35 Graine sans GA ne germe pas et graine avec GA germe car croissance + eau + mobilisation des réserves Etude des graines de céréales : 1. sous l’effet par exemple de la lumière 2. GA sort de l’embryon et diffuse dans le reste de la graine 3. GA perçu par couche de cellule à aleurone 4. Cellule à aleurone $ : amylases, protéases, lipases dans albumen 5. Réserves de l’albumen dégradées 6. Embryon se nourrit d’aa, de glucoses … Inhibition de la germination en imbibant inhibiteur de la voie de $ de la GA Gibbérelline produite puis diffuse de cellule en cellule car elles sont solubles Exp : Gène codant pour canal à eau du tonoplaste pas exprimé en absence de GA Les GA agissent à des doses nanomolaires. ¤ Floraison : 27 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4.3.5 Voie de transduction du signal 4.4 Acide abcissique (ABA) 4.4.1 Rôle, contraintes hydriques …. 4.4.2 Bio$ - dans feuille et racines - précurseurs = pas asso au photo$ - p22 : Voie de bio$ des carotéinoïdes à retenir : - Etape de l’enzyme NCED qui clive caroténoïde et produit un 1er précurseurs - étape importante car régulée par perception du stress - précurseues des carotéinoïdes = IPP (comme GA) - néoxanthine : précurseurs du clivage - AIA a un groupement COOH et est à 15 carbones - régulation par inactivation dans les tissus, élimination par : -oxydation destruction irréversible - stockage sous forme d’ester conjugué à un sucre réversible Adaptation de la cellule vég. A la contrainte de manque d’eau Déclenchement dessication chez l’embryon (peut perdre jusqu’à 80% de son eau) 4.4.3 Réponses à l’ABA 1) si gène de la voie de bio$ muté, le mutant avec coléoptyles, cotylédon, jeunes feuilles germent sur l’épis même phénomène de viviparité = absence de domance des embryons La plante $se naturellement l’ABA pendant la maturation des graines entrée en dormance $ de molécules de réserve comme l’amidon, les protéines de réserve stockées dans l’albumen élimination de l’eau 2) mutant de la dernière étape de la voie de bio$ feuilles tombent (droopy, ABA3,..) car toujours en plasmolyse = mutant ne resistant pas au manque d’eau GA dégradation réserves ABA mise en place des réserves + dormance embryonnaire 2 hormones à effet opposé balance relative hormonale Si mutation GA+ABA germination Pour croissance, pas de dualité hormonale. NB : 28 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4.4.3.1 Transport de l’ABA pour réponse à la sécheresse - transporte par xylème depuis racine et inonde tissu foliaire par diffusion piège anionique selon pH extracellulaire : - acide ABA protoné diffusion - neutre (en cas de stress hydrique) ABA déprotoné ABA reste dans MEC Cellules de garde du stomate = cible réelle de l’hormone qui influe sur l’état de turgescence Si pas d’eau $ d’ABA resistance aux échanges gazeux (fermeture des stomates) 4.4.4 Résumé des effets de ABA (p23) - tolérance à la dessication des embryons - déclenche accumulation des protéines de réserves - ration ABA/GA contrôle la dormance - dormance des bourgeons - inhibe l’induction par la GA de l’hydrolyse des réserves - ferme stomates - senescence foliaire 4.4.4.1 Experience sur les cellules de gardes des stomates Il existe 2 écoles : ABA dehors : R. membranaire ABA dedans : R intracellulaire ¤ exp ABA dedans : molécule inactive asso à molécule organique dont on peut réguler la présence = cage photolysable si on met des UV, la molécule absorbe la lumière hydrolyse ABA + molécule organique sans action précurseur dans cellules de garde donc R intracellulaire ABA dans cellules de garde rythme calcique ([Ca]i importante / nulle) ¤ Ecole ABA dehors : ABA déclenche :* - sortie de Cl-, K+ - entrée Ca++, qui stoppe entrée de K+ 4.5 Ethylène C2H4 Découverte 1901 effet sur l’abscission des feuilles Réponse triple Germination 29 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 produite pdt la blessure produite pdt murissement du fruit produite pdt senescence ho diffuse sous forme gazeuse et soluble communication à distance Chez les vieilles feuilles, l’arret de la $ d’auxine déclenche dans la zone d’abcission la $ d’éthylène chute feuille, mort cellulaire En présence d’éthylène dans l’environnement les plantules en germination déclenchent une réponse triple : inhibition de la croissance de la racine, activation croissance en épaisseur, éxagération de la crochet apicale (hypocotyle retourné) $ d’éthylène pourrait servir à l’adaptation aux contraintes physiques au moment de la germination (cailloux) Murissement des fruits : Division cellulaire expansion cellulaire taille maximale du fruit murissement par accumulation de sucre soluble, digestion des parois //t pic d’éthylène et de caroténoïde Inhibition du murissement par vaporisation d’inhibiteur d’éthylène. 4.5.1 Bio$ de l’éthylène P24 Précurseur = S-adénosine méthionine (donneur de méthyl) aa mét conjugué à ribose et adénine Hydrolyse par ACC $ase ACC …. 30 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 4.5.2 Transduction du signal à l’éthylène Mutants insensibles à l’éthylène pas de triple réponse en présence d’éthylène gène mu Mutant ctr Produit du gène CTR est un represseur de la triple réponse empeche la plante de dvper une triple réponse en présence d’éthylène Mutant ein2 = mutant nul insensible à l’éthylène pas de triple réponse donc gène ein 2 stimule à la réponse à l’éthylène Mutant etr1 code pour un represseur ou activation du répresseur. 31 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 La perception du signal dépend du conditionnement des atomes de cuivre dans le récepteur (Cu sur homodimère = R actif). Sel d’argent Cu est remplacé par de l’argent pas de fixation de l’éthylène fleur dure plus longtemps 5 Du zygote à la graine 5.1 Embryogénèse : mise en place de l’embryon et des réserves 5.2 Dormance et germination, régulation par les hormones et la lumière 32 LV302 – Plantes – Dernière mise à jour 01/10/08 6 Bases cellulaires et génétiques de la construction d’une plante 6.1 Les méristèmes et la mise en place de la structure primaire des racines et des tiges : contrôle de la division, de l’élongation et de la différenciation 6.2 Organisation fonctionnelle des méristèmes racinaires et caulinaires de la cell apicale aux méristèmes pluricellulaires 6.3 Notions de cellules souches et gènes de dvpt 6.4 Mise en place, dvpt et sénescence des feuilles 6.5 Ramification des systèmes racinaires et caulinaires 6.6 Dispositifs de croissance radiale 7 Evolution de la reproduction sexuée et morphogénèse florale 7.1 Facteurs inducteurs de la floraison 7.2 Paramètres structuraux et génétiques de l’induction et du développement floral 7.3 Evolution de la reproduction sexuée chez les Embryophytes 7.4 Pollinisation, auto-incompatibilité et fécondation 7.5 De la fleur au fruit 8 Conclusion 33