Rôle des facteurs de transcription de choc thermique HSFs dans le

Rôle des facteurs de transcription de choc thermique HSFs dans le développement du cerveau au stade embryonnaire: étude de l'implication du facteur HSF1 et HSF2 dans le Syndrome d'Alcoolisme Fœtal Le principal sujet d’intérêt du laboratoire est de comprendre les liens qui peuvent exister entre les programmes de développement embryonnaire et les mécanismes qui régissent la réponse des êtres vivants aux modifications de leur environnement. Le sujet principal traité durant cette thèse est de comprendre comment un stress (alcool) peut influer sur le développement du cortex embryonnaire en formation. Le modèle d’étude étant le syndrome d’alcoolisme fœtal qui se caractérise par des malformations du cortex lors de la migration de neurone au stade embryonnaire. Le second intérêt de ce modèle est qu’il n’existe pas de base moléculaire connue pour expliquer les malformations observées. Nous avons supposé que la perturbation de l’activité du facteur HSF2 peut donner une explication au phénotype observé. Les facteurs de transcription HSFs (Heat Shock Factors) sont impliqués dans la réponse aux stress environnementaux comme le choc thermique, historiquement Heat Shock Response ou HSR mais aussi, stress beaucoup moins étudié, l’exposition à l’alcool. Chez les mammifères, HSF1 est le facteur dédié à cette réponse (Åkerfelt et al., 2007). Il est présent à l’état monomérique, inactif en conditions normales et est activé par le stress : il devient nucléaire, trimérique, capable de lier spécifiquement des sites HSE (Heat Shock Elements) sur l’ADN et d’induire la transcription des gènes codant des chaperons moléculaires (Heat Shock Proteins) lesquels assistent la renaturation des polypeptides endommagés, délétères pour la cellule. Chez la souris, au cours du développement, le facteur HSF2, qui partage avec HSF1 la propriété de lier spécifiquement les sites HSE, est constitutivement actif en conditions normales (Rallu et al., 1997). Nous avons montré que HSF2 est impliqué dans le développement normal du cerveau : HSF2 régule l’expression de divers gènes cibles impliqués dans la migration radiaire des jeunes neurones post‐mitotiques lors de l’établissement des couches du cortex murin (Kallio et al., 2002 ; Chang et al., 2006). Le Syndrome d’Alcoolisme Fœtal (SAF) se caractérise entre autre par des défauts de migration neuronale radiaire, mais les bases moléculaires qui sous‐tendent cet effet sont encore mal connues (Gressens, 2000). L’exposition courte à l’alcool active le facteur de transcription HSF1 sur des cellules ex vivo (Zhong et al., 1998). Nous avons donc fait l’hypothèse que les HSFs puissent être des médiateurs de ces défauts migratoires. Cette étude a été menée en collaboration avec Pierre Gressens (U676 Inserm, Hôpital Robert Debré, Paris). Nous avons analysé par EMSA (electrophoretic mobility shift assay) les activités de liaison à la séquence HSE des facteurs HSFs dans les cortex embryonnaires, après intoxication chronique à l’alcool des embryons de souris in utero. Nous avons montré que l’intoxication chronique des embryons à l’alcool provoquait une activation de HSF1 pour la liaison à HSE. Nous avons déterminé, par RT‐PCR en temps réel, le niveau d’expression des gènes normalement cibles de HSF2, impliqués dans la migration neuronale: nous avons montré qu’en corrélation avec les perturbations des activités de HSF1 et HSF2, le niveau d’expression de ces gènes était modifié. Par immunoprécipitation de chromatine (ChIP), nous avons confirmé l’occupation des sites HSE de ces gènes cibles par HSF1 ou HSF2 ou les deux facteurs ensemble dans les néocortex in vivo: le recrutement du facteur HSF1 au niveau des sites HSE des gènes cibles impliqués dans la migration a pour conséquence une dérégulation de leur expression. Nous avons aussi démontré l’existence d’hétérotrimeres entre les facteurs HSF1 et HSF2. La perturbation dans l’activité des facteurs HSFs serait la base moléculaire des défauts de migration induits par l’alcool. Le rôle des HSFs dans la migration a également été testé sur la migration de fibroblastes embryonnaires MEFs Hsf1KO ou Hsf2KO ex vivo (wound healing): la perte de HSF1 ou HSF2 ralentit notablement la migration des MEFS ; l’exposition à l’alcool perturbe également la migration ; on observe un effet cumulatif des effets de l’alcool et de la perte de l’un des HSFs sur la migration. Des expériences d’injection Intrapéritonéale de Brdu sont réalisées sur les cortex fœtaux Hsf2KO pour étudier la migration in vivo en présence ou non du facteur HSF2 lors d’intoxication chronique à l’alcool. Nous avons aussi séquencé les fragments d’ADN issus de Chip pour déterminer l’occupation du facteur HSF2 sur les sites HSE au niveau de l’ensemble du génome. Ceci va nous permettre de déterminer potentiellement un consensus HSE pour HSF2 dans les neurones en migration ainsi que de découvrir d’autres gènes cibles pour ce facteur et cela pour une compréhension globale du rôle des facteurs HSFs dans les processus de développement. Ces études fournissent donc pour la première fois une base moléculaire pour expliquer cet aspect du SAF que constituent les défauts de migration neuronale radiaire. Ces travaux ouvrent un champ nouveau pour comprendre la spécificité des effets de l’alcool sur le cortex en développement. En effet, l’alcool active HSF1 d’une manière tout à fait originale par rapport à l’activation classiquement induite par le choc thermique. En effet, suite à un choc thermique, même persistant, l’activation du facteur HSF1 est transitoire. Par contre, la signature de l’exposition chronique à l’alcool ‐ en termes à la fois transcriptionnels sur le gène Hsf1 et post‐traductionnels sur le facteur HSF1 permettent d’expliquer comment ce facteur peut être activé de façon durable par l’alcool et peut donc avoir des effets à long terme au cours de la corticogenèse et sous‐tendre ses effets dans le SAF.