Numéro d’ordre : 03 ISAL 0031 Année 2003 Thèse IMAGERIE ULTRASONORE QUANTITATIVE HAUTE FRÉQUENCE : APPLICATION AU SUIVI DE LA FORMATION DU SYSTÈME CARDIAQUE AU STADE EMBRYONNAIRE CHEZ LA SOURIS QUANTITATIVE MEASUREMENTS IN ULTRASOUND AT HIGH FREQUENCY APPLIED TO THE EVOLUTION OF THE EMBRYONIC MOUSE CARDIO-VASCULAR SYSTEM présentée devant L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon pour obtenir Le grade de docteur École doctorale : M.E.G.A. Mécanique, Énergétique, Génie civil, Acoustique Spécialité : Acoustique par Johann LE FLOC’H Maître és Physique Université de Bretagne Occidentale Soutenue le : 05 septembre 2003 devant la commission d’examen Jury : rapporteur Lori BRIDAL CR CNRS, HDR rapporteur Frédéric PATAT MCU-PH, HDR F. Stuart FOSTER Professeur Gérard GIMENEZ Professeur président Marc JANIER PU-PH directeur de thèse Didier VRAY Professeur Laboratoire de recherche CREATIS UMR CNRS 5515, affilié à l’INSERM, Lyon, FRANCE Table des matières Introduction générale 11 1 Imagerie pour le petit animal 13 1.1 1.2 1.3 1.4 Introduction aux études post-génomiques . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.1.1 Du séquençage des génomes aux études post-génomiques . . . . 14 1.1.2 Quelques applications des études post-génomiques . . . . . . . . 15 1.1.3 Rôle des modalités d’imagerie pour les modèles animaux . . . . . 16 1.1.4 Modalités d’imagerie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 La souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.2.1 Origine et anatomie de la souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.2.2 Le développement embryonnaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2.3 Préparation de la souris en vue de l’imagerie . . . . . . . . . . . 35 ANIMAGE : Plateforme multimodale d’exploration in vivo du petit animal 38 1.3.1 Les objectifs d’ANIMAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 1.3.2 Projets en imagerie ultrasonore à ANIMAGE . . . . . . . . . . . 40 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 2 Imagerie quantitative de la souris adulte et gestante en ultrasons 2.1 2.2 Mesures quantitatives en mode B et mode M . . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.1.1 Les différentes sondes ultrasonores et les paramètres mesurés . . 44 2.1.2 Applications à la souris et aux embryons de souris . . . . . . . . 49 Mesures quantitatives en mode Doppler . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 2.2.1 Les différents modes Doppler et paramètres mesurés . . . . . . . 55 2.2.2 Applications à la souris et aux embryons de souris . . . . . . . . 59 2.2.3 2.3 43 Mesures Doppler chez l’embryon de souris 129 . . . . . . . . . 62 Mesures quantitatives en visualisation 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 2.3.1 Acquisition et visualisation 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 2.3.2 Applications à la souris et aux embryons de souris . . . . . . . . 70 1 TABLE DES MATIÈRES 2.3.3 2.4 Quantification 3D de l’embryon de souris à ED 14.5 . . . . . . . 72 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 3 Backscattering by blood in the mouse embryo: goals and experimental determination 77 3.1 Blood and backscattering by blood . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 3.1.1 Blood and erythropoiesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.1.2 Ultrasound scattering by blood . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 3.1.3 Factors influencing the backscatter coefficient . . . . . . . . . . . 83 Experimental set-up description for mouse imaging . . . . . . . . . . . . 84 3.2.1 A high frequency ultrasound scanner . . . . . . . . . . . . . . . 84 3.2.2 Mice studied and apparatus of anaesthesia . . . . . . . . . . . . . 88 3.2 3.3 Experimental methodologies for the calculation of the backscatter coefficient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 3.3.2 3.4 92 Experimental methodologies to estimate the backscatter coefficient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Experimental development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 4 Backscattering by blood in the mouse embryo: quantification of changes in backscattering within the heart chambers during gestation 4.1 105 Protocol for obtaining blood samples and haematology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 4.2 4.3 4.1.1 Blood samples of mouse embryo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 4.1.2 Analysis of the blood samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Protocol for imaging the embryonic mouse heart . . . . . . . . . . . . . . 109 4.2.1 Mouse embryo imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 4.2.2 B-scan images of the embryonic mouse heart . . . . . . . . . . . 110 4.2.3 M-mode imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Power spectra analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 4.3.1 Frequential parameters measured with a 400 window (256 samples) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 4.3.2 Frequential parameters measured with a 200 window (128 samples) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 4.4 Apparent integrated backscatter coefficient after corrections . . . . . . . . 119 4.4.1 Apparent integrated backscatter coefficient . . . . . . . . . . . . 119 2 TABLE DES MATIÈRES 4.4.2 4.5 Discussion on factors influencing the backscatter coefficient . . . 120 Conclusions and Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 Conclusion générale 129 Annexe A 131 Annexe B 135 3 TABLE DES MATIÈRES 4 Liste des abréviations A vitesse sanguine de remplissage d’un ventricule à la fin de la diastole pendant la contraction de l’oreillette AIB coefficient apparent de rétrodiffusion intégré sur une bande de fréquence AoD aorte dorsale ArO artère ombilicale BSC coefficient de rétrodiffusion CC cycle cardiaque D diastole DC débit cardiaque E vitesse sanguine de remplissage d’un ventricule au début de la diastole pendant la relaxation du ventricule ED embryonic day (jour de gestation) F zone focale F fréquence cardiaque FE fraction d’éjection FF champ lointain FR fraction de raccourcissement H ou HCT hématocrite HW paroi ventriculaire IRM imagerie par résonance magnétique IMM imagerie magnétique microscopique MCV volume globulaire moyen ME microscopie électronique MV masse ventriculaire N population d’embryon étudié à un âge donné NF champ proche PP ou PW paroi postérieur 5 LISTE DES ABRÉVIATIONS RBC globule rouge RX rayon X S systole SI (IS) septum interventriculaire SVGD surface du ventricule gauche pendant la diastole SVGS surface du ventricule gauche pendant la systole TA temps d’accélération TD temps de décélération TE temps d’éjection TEP tomographie à émission de positons TNE temps de non éjection Tra flux trnasmittraux US ultrasons VD (RV) ventricule droit VDD ventricule droit pendant la diastole VDS ventricule droit pendant la systole VG (LV) ventricule gauche VGD ventricule gauche pendant la diastole VGS ventricule gauche pendant la systole VO veine ombilicale 6 Liste des tableaux 1.1 Comparaison des stades de gestation pour différentes espèces . . . . . . . 26 1.2 Comparaison Homme-souris : paramètres généraux . . . . . . . . . . . . 28 1.3 Tailles de l’embryon de souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.4 Morphogenèse des chambres cardiaques pour différentes espèces . . . . 32 1.5 Anesthésiques pour la souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1 Comparaison de sondes hautes fréquences . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 2.2 Mesures quantitatives en Mode B et M chez la souris adulte . . . . . . . . 51 2.3 Mesures quantitatives en mode B chez l’embryon de souris . . . . . . . . 54 2.4 Comparaison de mesures en Doppler chez la souris adulte et l’homme . . 59 2.5 Mesures quantitatives en Doppler chez l’embryon de souris . . . . . . . . 61 2.6 Mesures Doppler : paramètres hémodynamiques chez l’embryon de souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.1 Hématologie Homme-souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 3.2 Spécification d’un système ultrasonore haute fréquence - VS40 . . . . . . 86 4.1 Volume globulaire, hématocrit et concentration de globules rouges chez 129 l’embryon de souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 4.2 Paramètres anatomiques cardiaques de l’embryon de souris . . . . . . . . 114 4.3 Paramètres spectraux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 7 LISTE DES TABLEAUX 8 Table des figures 1.1 Microscopie électronique de l’embryon . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.2 IRM haute résolution de l’embryon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.3 Bouchon de souris - âge de gestation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 1.4 Schéma de la souris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.5 Anatomie de la souris gestante 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 1.6 Anatomie de la souris gestante 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 1.7 Schéma d’un embryon de souris dans son sac de gestation . . . . . . . . . 28 1.8 Dissection d’embryons de souris, microscopie électronique . . . . . . . . 29 1.9 Schéma anatomique du cœur. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 1.10 Formation du système cardiovasculaire 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 1.11 Formation du système cardiovasculaire 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.1 Synoptique - sonde mono-élément . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 2.2 Synoptique - sonde multi-éléments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.3 Paramètres anatomiques en mode M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 2.4 Un schéma expérimental de l’imagerie de la souris . . . . . . . . . . . . 53 2.5 Illustration du Doppler pulsé et continu . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 2.6 Illustration du Doppler couleur - système vasculaire thyroïdale chez l’Homme. Sonde L12-5 38 mm (Fréquence Doppler 6 MHz). . . . . . . . . . . . . . 57 2.7 Paramètres hémodynamiques en Doppler pulsé . . . . . . . . . . . . . . 58 2.8 Schéma des embryons dans la corne utérine . . . . . . . . . . . . . . . . 62 2.9 Embryon de souris à ED 14.5 en Mode B (HDI 5000) . . . . . . . . . . . 64 2.10 Fréquences cardiaques et vitesses maximales entre ED 11.5 et ED 19.5 . . 65 2.11 Temps d’accélération et décélération entre ED 11.5 et ED 19.5 . . . . . . 66 2.12 Visualisation 3D du cerveau de l’embryon de souris . . . . . . . . . . . . 71 2.13 Photographie du banc d’acquisition d’images ultrasonores pour la quantification 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 2.14 Segmentation 3D du sac embryonnaire chez la souris. . . . . . . . . . . . 75 9 TABLE DES FIGURES 3.1 Schéma de l’érythropoïèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 3.2 Système ultrasonore haute fréquence- VS40 . . . . . . . . . . . . . . . . 85 3.3 Fonctions de transfert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3.4 Equipements d’anesthésie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.5 Equipement microsurgicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 3.6 Images en mode B de l’embryon à hautes fréquences . . . . . . . . . . . 90 3.7 Images en mode B du cœur de l’embryon de souris à 19 MHz et 40 MHz 91 3.8 Principe d’acquisition des signaux radio-fréquence d’une expérience sur fantôme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Photographie d’un fantôme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 3.10 Facteur de compensation du volume insonifié . . . . . . . . . . . . . . . 98 3.9 3.11 Coefficient de rétrodiffusion du fantôme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 3.12 Facteurs de correction de la fonction de transfert du système ultrasonore . 103 4.1 Echantillons de sang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 4.2 Echantillons pour analyse au microscope de ED 13.5 à ED 17.5 . . . . . . 107 4.3 Diamètres des globules rouges nucléés et de leurs noyaux de ED 13.5 à ED 17.5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 4.4 Photographie du banc d’acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 4.5 Images mode B de l’embryon de souris à 19 MHz . . . . . . . . . . . . . 111 4.6 Images mode B de l’embryon de souris à 40 MHz . . . . . . . . . . . . . 112 4.7 Imagerie en mode B et en mode M . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 4.8 Mode M et paramètres anatomiques cardiaques . . . . . . . . . . . . . . 115 4.9 Moyenne des densités spectrales de puissance des signaux radio-fréquences117 4.10 Coefficient apparent de rétrodiffusion intégré en utilisant la méthode adaptée (256 échantillons) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 4.11 Coefficient apparent de rétrodiffusion intégré en utilisant la méthode standard (256 échantillons) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 4.12 Coefficient apparent de rétrodiffusion intégré en utilisant la méthode adaptée (128 échantillons) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 4.13 Coefficient apparent de rétrodiffusion intégré en utilisant la méthode standard (128 échantillons) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 4.14 Paramètres en hématologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 4.15 Echantillons de sang à ED 9.5 et ED 11.5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 10 INTRODUCTION GÉNÉRALE Introduction générale Au cours de ces dernières décennies, les modèles animaux ont permis de mieux connaître les mécanismes qui interviennent dans le développement du vivant. Le décryptage récent du génome de la souris, parallèlement au décryptage du génome humain, montre le rôle fondamental que joue ce petit animal dans le domaine de la recherche biologie-santé. A l’ère du post-génome, la compréhension de l’expression de l’ensemble de ces gènes est le principal objectif. Les progrès de la biologie moléculaire permettent maintenant, chez l’animal, par des techniques appropriées de modifier le matériel génétique. Ces souris permettent d’étudier le développement normal ou pathologique mais également la fonction d’un gène ciblé, par la réalisation de surexpression (modèle transgénique) ou de suppression (technologie du knock out) de ce gène. Afin d’étudier les effets de ces modifications sur le développement de la souris, les techniques histologiques puis l’examen au microscope restent couramment employées. Ces techniques sont statiques, nécessitent hélas le sacrifice de l’animal et ne permettent donc pas un suivi dans le temps du même animal. Les modalités d’imagerie peuvent permettre, dans certaines conditions, un suivi in vivo, non invasif et dynamique du développement de la souris. Elles devraient donc apporter des informations complémentaires à celles recueillies par la traditionnelle analyse de coupes histologiques. Toutefois, l’imagerie du petit animal présente des contraintes importantes qui limitent l’utilisation directe des techniques d’imagerie clinique. Le présent travail concerne l’imagerie ultrasonore du petit animal. Cette modalité d’imagerie rencontre des contraintes liées principalement à la résolution spatiale, temporelle et à la profondeur d’exploration. L’utilisation de fréquences ultrasonores significativement plus élevées que celles utilisées en imagerie chez l’Homme, sur des systèmes adaptés à la petite taille des organes à étudier, nous a permis de nous intéresser à deux études : – le suivi du développement embryonnaire chez la souris et en particulier l’étude du développement du système cardiovasculaire. – la rétrodiffusion du sang à haute fréquence chez l’embryon de souris. 11 Dans le chapitre 1, nous présentons l’intérêt de l’imagerie de la souris dans le contexte des études post-génomiques et les principales avancées déjà réalisées. La présentation de l’anatomie et de certaines données physiologiques de la souris nous amène aux principales difficultés que rencontre son imagerie au cours de son développement, et plus particulièrement l’imagerie de son système cardio-vasculaire. Nous présentons ensuite nos travaux de recherche en imagerie par les ultrasons dans le cadre de la plateforme d’imagerie ANIMAGE. Dans le chapitre 2, les principaux modes d’imagerie en ultrason (B, M et Doppler) sont rappelés. Un état de l’art de l’imagerie ultrasonore quantitative de ces modes appliqués à l’étude du système cardiovasculaire de la souris adulte et gestante est ensuite présenté. Il met en évidence les paramètres quantitatifs qui peuvent être déduits à partir de ces modes. Les travaux réalisés sur la plateforme d’imagerie ANIMAGE à Lyon en collaboration avec les chercheurs de CREATIS sont présentés. Les paramètres hémodynamiques mesurés au cours de la formation du système cardiovasculaire de la souris nous ont permis d’établir des données de référence pour la souche étudiée (129 ). Parallèlement, une étude de faisabilité de la visualisation et de la quantification du volume de l’embryon de souris a été menée à partir d’un volume de données ultrasonores. Les chapitres 3 et 4 présentent les travaux de recherche menés à très hautes fréquences (19-40 MHz) au Sunnybrook and Women’s Health Sciences Centre à Toronto dans le laboratoire du professeur F. Stuart Foster. A très hautes fréquences, l’échogénicité du sang chez l’embryon de souris est plus élevée que celle, observée à plus basse fréquence, chez la souris adulte. De plus, au cours de la gestation de la souris la morphologie des globules rouges évolue. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’échogénicité du sang variait au cours de la gestation et que ces variations étaient liées au développement des globules rouges. Ce travail a donc consisté à imager le cœur de l’embryon de souris in vivo et à quantifier, par la mesure du coefficient de rétrodiffusion, les variations d’échogénicité du sang de l’embryon de souris. L’estimation du coefficient de rétrodiffusion nécessite la prise en compte de la fonction de transfert du système ultrasonore et des phénomènes de diffraction. Les méthodes employées et la mise en œuvre expérimentale de ces méthodes de correction sont détaillées au chapitre 3. Dans le chapitre 4, le protocole d’imagerie de l’embryon de souris et les résultats de la quantification sont discutés. Cette étude permet également de montrer la possibilité d’étudier la fonction cardiaque pendant le développement de l’embryon de souris. 12 Chapitre 1 Imagerie pour le petit animal Ce chapitre va permettre de situer l’imagerie du petit animal dans le contexte des études post-génomiques. Après une introduction aux travaux de recherche dans le domaine du génome, et le rôle des modèles animaux pour de telles études, nous montrerons comment l’imagerie médicale adaptée à la souris peut apporter des informations jusqu’alors inaccessibles. Nous nous intéresserons à l’anatomie de la souris et plus particulièrement au développement de son système cardiovasculaire au cours de la gestation. Nous présenterons ensuite les projets en imagerie ultrasonore d’ANIMAGE, la plate forme d’imagerie multimodalité du petit animal qui a été créée pendant mon travail de thèse. Les projets auxquels j’ai participé dans le cadre d’ANIMAGE seront présentés. 13 1.1. INTRODUCTION AUX ÉTUDES POST-GÉNOMIQUES 1.1 Introduction aux études post-génomiques 1.1.1 Du séquençage des génomes aux études post-génomiques La génomique est une sous discipline de la Génétique. Elle est la science des génomes qui étudie la structure, le fonctionnement et le rôle de l’ensemble des gènes des organismes vivants. Elle est divisée en deux parties : la génomique structurale et la génomique fonctionnelle. La première correspond à l’étude de la structure des génomes. Elle s’attache à identifier la composition des gènes et à localiser ces gènes dans l’ensemble du génome. La seconde correspond à l’étude de la fonction des génomes et constitue les études postgénomiques ou du post-génome. Les études post-génomiques ont ainsi pour objectif la compréhension de l’expression de l’ensemble des gènes d’un être vivant. Pour l’espèce humaine cela revient à étudier 23 paires de chromosomes, ou autrement dit 30 000 ou 40 000 gènes, ou encore 3,5 milliards de nucléotides. Ce projet de découverte du génome humain a débuté dès 1987 [Bishop 90]. A la fin de l’année 1990 un projet internationnal nommé "Projet Génome Humain", regroupant 20 laboratoires, aujourd’hui 25, répartis aux États-Unis, au Royaume Uni, au Japon, en France1 , en Allemagne et en Chine, a été initié dans le but d’identifier tous les gènes, de repérer leur place sur les chromosomes, de les séquencer 2 [Lander 01]. Une ébauche du génome humain, initialement prévu en 2005, a été récemment atteinte. En raison de la taille de ce génome, les grands centres de séquençage, financés par des moyens publics, ont convenu de diviser le travail et de se charger individuellement de régions chromosomiques ou de chromosomes particuliers. Par exemple, la France contribue au séquençage du chromosome 14 qui correspond à une contribution du séquençage de 2,5%. Chaque groupe s’engage à déposer les données dans des bases de données publiques, accessibles à tous via internet3 , dès leur obtention. Parallèlement à ce projet, le séquençage ou décryptage du génome de certains organismes constitués d’un génome de plus petite taille et donc plus facile à étudier est déjà achevé. Par exemple, nous retiendrons le séquençage du génome du ver nématode Caenorhabditis elegans largement étudié (6 chromosomes, 17 800 gènes, 100 millions de paire de base) [Martinelli 97] et du génome de la mouche drosophile (4 chromosomes, gènes, 13 600 165 millions de paires de base) [Adams 00] avec lequel des progrès technolo- giques en terme de séquençage automatique sont aujourd’hui testés [Myers 00]. La comparaison d’un gène similaire dans différents organismes devrait permettre une meilleure 1 Genoscope et CNRS UMR-8030 séquencer signifie déterminer l’enchaînement des unités chimiques A, C, G et T 3 http ://www.ornl.gov/hgmis/ 2 14 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL compréhension de l’évolution d’un gène et de son rôle [Clark 99]. Parmi les vertébrés et après l’Homme, c’est aujourd’hui la souris qui est l’animal le plus étudié. A l’heure où les projets de séquençage des gènes de la souris et de l’Homme arrivent à leur terme, la compréhension de la fonction et du rôle des milliers de gène d’organismes complexes offre déjà un nombre important d’applications. La compréhension d’un plus grand nombre de gènes par les étude post-génomiques devraient permettre d’ouvrir de nouvelles perspectives, en souhaitant qu’un cadre éthique soit respecté. 1.1.2 Quelques applications des études post-génomiques Les applications engendrées par l’étude du génome sont déjà nombreuses, telles que la production de protéines, le dépistage génétique, la thérapie génique et la création de modèles animaux transgéniques. Des protéines naturelles, comme l’hormone de croissance, sont extraites des animaux ou de l’espèce humaine pour soigner des déficiences ou des maladies comme le diabète. Depuis le début des années 80, on peut produire certaines de ces protéines à partir de bactéries, ou de levure dont le génome est parfaitement maîtrisé. Par exemple, le gène humain qui permet la fabrication de l’insuline a été identifié et l’introduction de ce gène dans des bactéries spécifiques les conduisent à produire de l’insuline. Le séquençage du génome humain a déjà permis d’identifier les gènes impliqués dans certaines maladies graves. Ainsi, le dépistage génétique est possible et consiste à déceler les mutations génétiques indiquant qu’un individu a une forte probabilité d’être atteint d’une maladie donnée. La thérapie génique quant à elle, a pour but de remplacer ou modifier un gène défectueux à l’origine d’une maladie génétique par un gène normal. Plusieurs problèmes se posent quant à la manière de véhiculer et de fixer ce gène. Très récemment, une équipe de chercheurs de l’hôpital Necker à Paris a obtenu un résultat très encourageant en thérapie génique. L’injection d’un gène "réparateur", dans les moëlles osseuses d’enfants bulles, a permis la production des défenses immunitaires qui manquaient aux enfants [Cavazzana-Calvo 00]. Cependant, l’un des enfants traités a récemment développé une forme de leucémie, engendrant de multiples questions sur le principe de la thérapie génique. Parallèlement, les modèles animaux peuvent fournir une quantité considérable d’informations. Les animaux transgéniques sont des animaux dont un ou plusieurs gènes ont été inactivés ou auxquels un gène étranger a été introduit. L’introduction ou la modification d’un gène chez l’animal a pour but de déterminer la ou les fonctions de ce gène, lorsqu’il est inconnu ou d’étudier une maladie humaine, lorsque ce gène est connu. Ces animaux sont égale15 1.1. INTRODUCTION AUX ÉTUDES POST-GÉNOMIQUES ment utilisés pour développer et tester de nouveaux médicaments. La mouche drosophile, le ver nématode et la souris font ainsi l’objet d’un nombre de plus en plus important de manipulations génétiques produisant des modèles génétiques. Parmi ces animaux la souris offre de nombreux avantages par rapport aux invertébrés : son génome est 14% plus petit que celui de l’homme et est entièrement séquencé, son génome est très proche de celui de l’homme, approximativement 99% des gènes de la souris trouvent leurs équivalents chez l’homme [Consortium 02] et son développement anatomique et physiologique est similaire à l’homme [Krause 01]. Les recherches effectuées par le passé sur la souris et les nombreux modèles développés pour l’étude de maladies associées à un disfonctionnement cardiaque [Rossant 96] ou neuronal [Zhang 97] ont conduit naturellement à développer ce modèle animal pour les études génétiques. Pour tenter de comprendre le rôle des gènes dans le développement de ces modèles animaux, les biologistes ne disposent à présent que de méthodes invasives telle l’histologie. Dans le cadre de ce travail, nous avons choisi de nous intéresser à un mode d’analyse permettant le suivi du développement des modèles animaux in vivo et si possible de façon non invasive. 1.1.3 Rôle des modalités d’imagerie pour les modèles animaux Les informations répertoriées actuellement sur le développement embryonnaire de la souris sont déjà considérables. Toutefois, les analyses génétiques jusqu’à présent menées concernaient les traits de caractère ou phénotype qui s’expriment après la naissance. Autrement dit, les gènes qui provoquent la mort des embryons ont été peu étudiés et la découverte des mutations qui interfèrent pendant les premières étapes de la formation embryonnaire ou morphogenèse, reste marginale. La technologie du gène "knockout" 4 a amélioré de manière conséquente la compréhension du rôle de certains gènes dans le développement de la souris [Rossant 96]. Par exemple le gène jouent un rôle très important pour le développement normal du système cardiaque et du placenta [Yang 95]. Le gène TEF-1 est lié au développement du système cardiaque et neuronal [Chen 94]. Cependant, l’exploitation de ces récentes découvertes génétiques chez la souris est freinée pour deux raisons principales. La première est que l’étude du rôle de ces gènes ne peutêtre réalisée qu’en sacrifiant un très grand nombre d’embryons de souris à chaque âge de gestation. La seconde est que la fonction du gène ne peut pas être étudiée sur un même individu au cours de la gestation. Il y a donc un réel besoin de méthodes d’analyses les moins invasives possibles et in vivo de la souris. 4 Technique consistant à empêcher un ou plusieurs gènes de s’exprimer. 16 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL Plusieurs modalités d’imagerie, certaines utilisées en routine clinique chez l’homme, pourraient répondre à cet objectif. Les techniques d’imagerie telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomographie par rayons X, la Tomographie à Emission de positons (TEP) ou l’imagerie ultrasonore (US) devraient offrir de larges possibilités pour l’exploitation des résultats récemment obtenus en biologie. Elles sont cependant confrontées à deux problèmes majeurs. Le premier est que le développement embryonnaire de la souris est intra-utérin et rend donc son exploration difficile. Le second est la petite taille de la souris et par conséquent des embryons, ce qui impose une résolution spatiale inférieure à 100 . Toutes ces techniques sont aujourd’hui en plein essor et ont connu de récents développements qui tendent à améliorer la résolution spatiale. Le but est de quantifier les modifications anatomiques ou fonctionnelles occasionnées par la sous ou sur-expression de tels ou tels gènes dans le cas de la souris transgénique et de quantifier l’évolution d’une maladie particulière "modélisée" chez la souris. Des études doivent tout d’abord être menées sur des souris et des embryons normaux afin de répertorier des données de référence. Les paragraphes suivants présentent quelques modalités d’imagerie qui ont été récemment appliquées à la souris et/ou à l’embryon de souris. 1.1.4 Modalités d’imagerie A priori, toutes les modalités d’imagerie utilisées en routine clinique ou destinées à imager le corps humain ont un intérêt pour l’étude des modèles animaux. Toutefois, les contraintes technologiques et les domaines d’applications de chaque modalité ont fait que certaines technologies se sont plus particulièrement développées. Nous donnons ici un bref état de l’art des modalités les plus développées pour les modèles animaux : la microscopie électronique (ME), l’IRM et enfin l’imagerie ultrasonore pour laquelle nous apporterons notre contribution dans ce travail. La microscopie électronique Jusqu’à présent, la microscopie électronique est la modalité d’imagerie qui a fourni le plus grand nombre d’informations sur le développement de la souris. La ME propose une résolution de l’ordre de à , qui représente la meilleure résolution compa- rativement aux autres modalités d’imagerie. Elle fournit des informations de type anatomiques [Kaufman 92], des informations sur le développement d’organes particuliers [Vuillemin 89a, Vuillemin 89b, Pexieder 84a], et offre de larges possibilités dans le domaine de la génomique. La ME permet d’étudier visuellement l’impact de gènes spécifiques sur la formation d’un organe. Par exemple, la visualisation du cœur de l’embryon a 17 1.1. INTRODUCTION AUX ÉTUDES POST-GÉNOMIQUES été réalisée et pourrait apporter de nouveaux éléments quant au rôle des gènes impliqués dans la morphogenèse des chambres cardiaques ([Lyons 90, Milano 94]). La visualisation 3D d’un ensemble de coupes de la souris obtenues à haute résolution, est un projet en cours de réalisation. Elle permet d’observer un organe sous différents angles et également de le situer par rapport aux autres. Cette visualisation 3D s’avère très utile pour montrer la zone d’action d’un gène quand cette zone est volumique. Le programme développé par le MRC Human Genetics Unit à Edimburgh5 , qui a pour objectif la découverte des facteurs génétiques liés aux maladies humaines et au développement anormal, propose la création d’un atlas numérique à partir de coupes histologiques, réalisées à chaque stade du développement embryonnaire de la souris. La Figure 1.1 présente l’imagerie par ME d’un embryon à 10 jours de gestation. La ME fournit des données de référence mais implique le sacrifice de la souris et ne permet donc pas de suivre dans le temps le développement d’une maladie chez la souris et, plus particulièrement, le développement embryonnaire chez le même individu. Cependant, elle reste, à ce jour, une modalité d’imagerie de référence. F IG . 1.1 – Embryon à 10 jours de gestation en position latérale obtenu en microscopie électronique. Les extrémités, tête (T), membres (M) et somites (S) de l’embryon sont visibles. Schéma issu de K.K. Sulik et P.R. Bream Jr (http ://www.med.unc.edu/embryo_images/). 5 consulter http ://www.hgu.mrc.ac.uk/ pour plus d’informations sur ce projet et le développement em- bryonnaire de la souris 18 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL Imagerie par résonance magnétique Grâce aux travaux de Lauterbur [Lauterbur 73] et Mansfield [Mansfield 75] réalisés dans les années 70, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) est devenue une technique largement employée en routine clinique. Depuis, de nombreuses applications ont été développées chez l’homme et fournissent donc une démarche de base pour les futurs applications chez la souris. Cette imagerie a l’avantage, par rapport aux autres modalités, d’être par nature 3D. A des champs magnétiques de 1.5 Tesla pour l’imagerie dite anatomique et 3 Tesla pour l’imagerie dite fonctionnelle, la résolution dans le plan de coupe ou épaisseur de coupe est de l’ordre de à et n’est donc pas suffisant pour l’imagerie de la souris. Pour accroître cette résolution, des IRM à très hauts champs magnétiques, 7.5 Tesla et plus récemment 9.4 Tesla, ont été développés. A 7.5 Tesla, l’imagerie du nouveau né chez la souris et de la souris adulte a permis l’évaluation des structures et des fonctions cardiaques [Wiesmann 00]. L’imagerie à 9.4 Tesla est connue sous le nom d’imagerie magnétique microscopique (IMM). L’IMM fournit une cellule de résolution de l’ordre de . Cette nouvelle technologie a été appliqué avec succès à l’imagerie d’organes de la souris tels le cœur [Rossant 96], le foie [Fabry 92] et également sur un modèle de souris transgénique d’athérosclérose où l’aorte abdominale et les artères iliaques communes ont été imagées [Fayad 98]. Récemment, les embryons de souris de 9.5 jours de gestation (noté ED 9.56 par la suite dans ce manuscrit) à 18.5 jours de gestation (ED 18.5) ont également été imagés par IMM. Ces données devraient être à l’origine d’un nouvel atlas 3D de l’embryon de souris [Smith 94]. La Figure 1.2 démontre la capacité de l’IMM, associé au Gadolinium (agent de contraste en IRM), à imager le système vasculaire de l’embryon de souris et à étudier, par exemple ses déformations. L’IMM fournit des données 3D de haute résolution, très utiles à la création d’un atlas. Cependant, ce gain en résolution est coûteux en temps d’acquisition (supérieur à 2 minutes pour une seule coupe) et nécessite une importante puissance de calcul. 6 ED pour "Embryonic Day" 19 1.1. INTRODUCTION AUX ÉTUDES POST-GÉNOMIQUES F IG . 1.2 – IRM du système cardiovasculaire d’un embryon à ED 12.5 in vitro en position dorsale et ventrale. (http ://embryo.soad.umich.edu/animal/animalSamples/animalSamples.html) L’imagerie ultrasonore L’imagerie ultrasonore (US) possède trois principaux atouts. Elle permet une imagerie anatomique en temps réel, non-invasive et à faible coût. De plus, la modalité US est portable contrairement aux autres modalités d’imagerie. La modalité US propose plusieurs modes d’imagerie apportant des informations complémentaires, notamment sur les flux et la perfusion des organes par plusieurs modes Doppler. Par ailleurs, les agents de contraste ultrasonores peuvent apporter un rehaussement de ces informations. Cette modalité d’imagerie peut donc être également fonctionnelle. La récente montée en fréquence des sondes ultrasonores, principales caractéristiques des machines ultrasonores, de 2-3 MHz jusqu’à 40 MHz, est à l’origine de nombreuses applications, notamment chez la souris et l’embryon de souris. Néanmoins, la visualisation en 3D reste plus difficile à réaliser que pour les autres technologies. Un état de l’art détaillé de cette modalité d’imagerie est présenté au chapitre 2. 20 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL 1.2 La souris 1.2.1 Origine et anatomie de la souris La souris n’est pas devenue brutalement un animal de prédilection pour des expériences scientifiques. Elle a une très vieille et riche histoire. Ainsi, la première étude a été réalisée en 1664 par Robert Hooke qui s’intéressait aux réactions des souris en fonction du changement de l’air ambiant. Depuis, son utilisation par les biologistes n’a cessé d’augmenter. Entre 1914 et 1919, A. Lathrop crée une souris pour l’étude du développement de maladies spécifiques et publie des travaux pionners sur le cancer chez la souris. Entre 1913 et 1916, H. Bagg développe la souche BALB/c pour l’étude du comportement. Puis en 1919 la souris est utilisée pour des études génétiques au Cold Spring Harbor Station [Pennisi 00]. Aujourd’hui, pour des raisons techniques et économiques la souris est devenue l’animal de loin le plus utilisé par les chercheurs. En effet, la souris est un animal très prolifique et a une gestation très rapide, de l’ordre de 19 jours (Tableau 1.2). De plus elle est maintenue à un faible coût (des graines et de l’eau suffisent à la nourrir) et a été très largement étudiée. Ainsi, elle s’avère très intéressante pour l’étude de l’impact de nouvelles thérapies médicamenteuses et géniques. Par exemple, le test d’un nouveau médicament prend généralement 7 à 10 ans avant sa mise sur le marché, et avant donc d’être disponible pour le patient. L’étude des effets d’un médicament sur la souris peut être réalisée sur plusieurs générations pour un coût bien moindre que si elle était menée directement sur patients. Dans cette partie, nous nous attacherons à décrire l’anatomie de la souris et plus particulièrement celle de l’embryon auquel nous nous sommes intéressés. Dénomination de la souris La dénomination d’une souris répond à une codification précise. Il existe pour cela des termes spécifiques et une notation stricte. Ainsi, une souris est définie par sa souche, son sexe et l’âge de gestation dans le cas d’une souris gestante. Le fournisseur peut s’avérer une information importante. Selon l’étude envisagée, une souche particulière de souris peut alors être préférée à une autre pour ses caractéristiques spécifiques. La souche détient l’information de l’origine de la souris ou autrement dit, son arbre généalogique. Par exemple, C3H correspond à une souris de souche C3 provenant du laboratoire de Harwell et C3H/HeH représente une souris d’une sous-souche de la souche C3H dérivée d’Harwell (H) provenant de Heston (He). Lorsque les souris ont subi des mutations, d’autres précisions sont également fournies pour préciser le type de la transformation 21 1.2. LA SOURIS (souris mutante ou transgénique) et les gènes étudiés à travers cette souris. Dans ce cas, une abréviation de la souche de la souris est très fréquente. Par exemple, B6 ;129S7Acvr2 correspond à une souris provenant d’une souris de souche C57BL/6J accou- plée à une souris de souche 129S7. C57BL/6J est ici simplifié en B6. Le gène étudié à travers ce modèle est le Acvr2. indique que cette modification est le résultat d’une première, 1, mutation ciblée, tm, targeted mutation, et que les premières initiales du chercheur à l’origine de cette mutation sont Zuk. L’âge de gestation d’une souris est déterminé par l’observation d’un liquide vaginal blanc ou bouchon à mi-journée (Figure 1.3). Celui-ci correspond à l’âge embryonnaire 0.5 ou 0.5 jours de gestation. Nous avons suivi cette définition issue de [Kaufman 92] pour les travaux présentés dans ce manuscrit. Dans la littérature, cette définition n’est pas toujours respectée et ED1 ou ED0 correspondent à ED 0.5 de notre définition. Des comparaisons de différentes études seront faites. La référence concernant l’âge de gestation pour chaque étude sera alors précisée lorsque cette référence sera différente de notre définition. L’expression "stade de gestation" ou "stade de développement" est également souvent rencontrée dans la littérature et ne doit pas être confondue avec l’âge de gestation. Le stade de gestation est basée sur l’observation du développement embryonnaire [Theiler 72]. Il a été observé que suivant la souche des souris et également la position des embryons dans la corne utérine, les embryons ayant le même âge de gestation peuvent être à différent stade de gestation chez la souris [Vuillemin 89a] et chez d’autres espèces. Un stade de gestation peut donc être associé à un ou plusieurs âge de gestation. Le stade de gestation s’avère très utile pour déterminer les correspondances approximatives entre les âges de gestation de différentes espèces, aussi bien pour le développement d’un organe particulier que pour le foetus en général. Dans ce manuscrit, nous citons deux systèmes de notation, celui de Theiler [Theiler 72] dédié à la souris et celui de Carnegie [Butler 87] regroupant les vertébrés. La notation de Carnegie est basée sur des événements du développement embryonnaire et fœtale communs à tous les vertébrés. Le Tableau 1.1 présente le lien entre ces deux systèmes de notation. On peut remarquer que selon la notation de Theiler les stades de gestation 16, 17 et 18 sont associés sans distinction aux trois stades de gestation 13, 14 et 15 de la notation de Carnegie. Cela suggère un grand nombre d’événements au cours de cette période de la gestation. On peut également remarquer une différence quasi constante de 1,5 jours de gestation entre la souris et le rat pour chaque stade de gestation. On remarque également que le système de notation de Carnegie n’est utilisable que pour la période 22 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL F IG . 1.3 – Bouchon vaginal de souris. Par l’observation d’un liquide blanc vaginal le matin, l’âge de l’embryon est alors approximé à 0.5 jours de gestation (ED 0.5). correspondant au développement embryonnaire (16 jour de gestation pour la souris), tandis que la notation de Theiler couvre toute la durée du développement intra utérin et le début de la période post-natale de développement de la souris. Les principaux fournisseurs de souris normales ou modifiées sont les laboratoires Charles River, Harlan Sprague Dawley et Taconic basés aux État-Unis et également implantés en Europe. Charles River domine le marché avec 49 animaleries réparties dans 18 nations. Chaque fournisseur offre de 25 à 75 souches différentes. Le laboratoire Jackson, créé en 1929 par C. Little, est parmi les laboratoires les plus connus bien qu’ayant un chiffre d’affaire beaucoup moins élevé. Il offre à lui seul pas moins d’un millier de souches différentes et de loin la "meilleure sélection". De plus, il est le seul à investir ses bénéfices dans la recherche. Cependant, il ne peut entretenir tous ses stocks sans interruption ce qui motive de nombreux laboratoires à développer leurs propres animaleries pour maintenir à un niveau stable la population des souches qu’ils étudient [Malakoff 00]. 23 1.2. LA SOURIS F IG . 1.4 – Les principaux organes de la souris male (souris en position dorsale). Anatomie de la souris L’imagerie de la souris nécessite de connaître son anatomie et, plus particulièrement, la localisation des principaux organes et de celle des embryons dans le cas de souris gestantes. Le schéma 1.4 donne la position de quelques organes vitaux chez la souris (foie, intestins, appareil génital, . . .). Dans le cas de la souris gestante, les embryons se développent à l’intérieur de la corne utérine, illustrée sur la Figure 1.5, qui généralement se situe à la périphérie abdominale, lorsque la souris est en position dorsale. Cependant, la corne utérine n’est pas fixée à la paroi abdominale et il n’est donc pas rare qu’elle occupe, à différents moments de la gestation, une position ventrale plus qu’à la périphérie de l’abdomen. De plus, elle subit des déformations à un âge de gestation plus avancé. A ED 6.5, elle peut se situer en dessous des intestins comme illustré par les Figures 1.5 et 1.6. 24 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL F IG . 1.5 – Localisation de la corne utérine. F IG . 1.6 – Souris gestante à ED 6.5 (position dorsale). Localisation des principaux organes RG pour rein gauche. La corne utérine est sous les intestins. 25 1.2. LA SOURIS TAB . 1.1 – Comparaison des stades de gestation pour différentes espèces selon la notation de Carnegie. Les âges de gestation sont approximatifs. Valeurs issues de (a) [Butler 87], (b) [Theiler 72], (c) [Witschi 62], (d) [Bryden 72], (e) [Hamburger 51] et (f) [O’Rahilly 79]. Stades de gestation âges de gestation ED1 Theiler Carnegie Souris Rat Mouton Poulet 13 10 9.5 11 16 1.5 22 14 11 10 11.5 17.5 2 24 15 12 10.5 12 18.5 2.25 28 16 13 11 12.5 19.5 2.5 30 17 14 11.5 13 20.5 3 33 18 15 12 13.5 22 3.25 36 19 16 12.5 14 23 3.75 40 20 17 13 14.5 24.5 4.75 42 21 18 13.5 15 25.5 5.5 44 19 14 15.5 27.5 6.25 48 20 14.5 16 29.5 7.25 52 30 7.75 54 22 21 Humain 22 15.5 17 33 8.5 55 23 23 16 17.5 34 10 58 24 N/A 17 18.5 - - - 25 N/A 18 19.5 - - - 26 N/A 19 20.5 - - - 27 N/A 20-21 21.5 - - - 26 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL Quelques ordres de grandeur de la souris Ces données sont pour la plupart issues du livre de Mark A. Suckow [Suckow 01]. Les valeurs du facteur d’échelle (ratio) séparant la souris de l’homme sont données et des difficultés à surmonter pour les différentes modalités d’imagerie (Tableau 1.2). Les battements cardiaques sont 10 fois plus rapides chez la souris que chez l’homme. Ils sont une difficulté à surmonter pour l’imagerie temps réel comme l’imagerie ultrasonore. Une cadence image très élevée est alors nécessaire pour pouvoir étudier la systole et la diastole. Compte tenu de la taille des organes de la souris, l’imagerie devrait avoir une résolution spatiale meilleure que 100 pour observer leur morphologie. 1.2.2 Le développement embryonnaire L’embryon de souris La durée de gestation étant de 18 à 21 jours, l’anatomie de l’embryon de souris évolue donc très rapidement tout au long de son développement (Tableau 1.2). La Figure 1.7 représente schématiquement l’environnement de l’embryon à un stade de sa gestation relativement avancé. L’embryon baigne dans le liquide amniotique retenu par le sac amniotique et est connecté par son cordon ombilical au placenta. Le placenta est le lieu d’échanges permanent avec la mère, échange de nourriture de la mère vers l’embryon et aussi évacuation des déchets du foetus vers la mère. L’observation d’embryons de souris, à différents âges de gestation, nous a permis de mieux appréhender la taille et les organes qui pourront être imagés. La Figure 1.8 présente des embryons de souris de souche OF1 à différents âges de gestation. Nous avons réalisé ces images de microscope au Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire à l’ENS de Lyon, France. Le modèle animal de souris a également été validé par les biologistes pour ce qui concerne le développement embryonnaire qui montre une grande similitude avec le développement humain. Nous avons pu observer la présence de sang dans le cœur dès ED 8.5 (Fig.1.8.c). En terme d’imagerie par ultrasons, les Figures 1.5 et 1.6 montrent que les intestins peuvent gêner l’observation des embryons, en particulier parce qu’ils sont chargés en bulles d’air. Selon la littérature, la taille des embryons de souris est d’environ à ED 0.5 et 2.5 cm à la naissance pour finalement atteindre une taille de 7 cm à l’âge adulte. Le Tableau 1.3 fournit la taille de l’embryon de souris au cours de sa gestation selon les travaux réalisés par Theiler K. [Theiler 89] et Kaufman M.H. [Kaufman 92]. Les mesures que nous avons réalisées sur des embryons disséqués de souche OF1 sont en accords avec ces valeurs. 27 1.2. LA SOURIS F IG . 1.7 – Schéma d’un embryon de souris dans son sac de gestation TAB . 1.2 – Comparaison de mesures réalisées chez la souris et l’humain. Valeurs issues de The Laboratory Mouse de [Suckow 01], [Tankersley 99], [Reiss 96] et [Hartley 95] pour la souris et de [Forster 86] pour les données pulmonaires de l’homme. Paramètres généraux Unité Souris Humain ratio Taille cm 7 170 24 Poids g 25 70 000 2800 Espérance de vie année 2-3 85 35 Poids à la naissance g 1 2400-3500 2400-3500 Poids du cœur g 0,15 250 Age de la Maturité sexuelle semaine 7à8 676 à 832 Durée d’un cycle jour 4à5 28 Gestation ou grossesse jour 18 à 21 270-279 Période embryonnaire jour 0.5-9.5 1-92 10 Période foetale jour 10.5-18.5 93-274 22 Période de sevrage jour 21 à 28 - - Pseudo gestation jour 10 à 13 - - Portée nombre 10 à 15 1à2 0.1 Respiration (rythme) min 106-163 12 0.1 Capacité pulmonaire ml 0.90-1.44 6000 5500 Volume résiduel ml 0.11-0.14 1500 1200 pH sans 5-7.34 7.4 1 28 100 7 14 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL (a) (b) (c) (d) (e) (f) F IG . 1.8 – Dissection d’embryons de souris réalisée à différents âges de gestation.(a) ED 6.5, (b) ED 7.5, (c) ED 8.5, (d) ED 9.5, (e) ED 10.5 et (f) ED 11.5. Le fond est quadrillé et représente des surfaces de . 29 1.2. LA SOURIS TAB . 1.3 – Tailles de l’embryon de souris d’une part d’après les travaux de [Kaufman 92] et [Theiler 89] et d’autre part d’après les mesures (grand axe) que nous avons réalisées sur des images obtenues par microscopie (Figure 1.8). NR : mesures non réalisées. ED 0.5-2.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 11.5 12.5-13.5 16 Né Taille (mm) 0.08 0.46 0.87 1.23 2.7 4.08 6.7-8 9-11 12.3 28 NR 0.45 0.81 2 3.7 4.5 6.5 NR-11 NR NR littérature Taille (mm) mesurée Dans le paragraphe suivant, nous nous intéresserons particulièrement au système cardiovasculaire et à la vascularité du fœtus. L’un des tous premiers organes à se former est le système cardio-vasculaire ([Vuillemin 89a] et [Vuillemin 89b]). C’est un domaine que nous avons choisi d’approfondir dans ce travail, que ce soit en collaboration avec la plateforme ANIMAGE, avec le laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire de l’ENS et lors de mon séjour à Toronto au Sunnybrook and Women’s College Health Sciences Centre. Le système cardio-vasculaire Un nombre important de gènes et de protéines liés au développement du cœur a été découvert [Lyons 90, Kubalac 94, Milano 94], toutefois, peu de données sont actuellement disponibles concernant les retentissements anatomiques [Rossant 96] des modifications de ces gènes. Par ailleurs très peu de retentissements fonctionnels de la modification de gènes, à part la mort de l’embryon, n’ont été répertoriés. Dans la littérature, la microscopie électronique fournit des données de type anatomique, cependant celles-ci restent limitées à des images 2D obtenues de manière très invasive et donc ne peut fournir des données fonctionnelles. Anatomie et principe de base Le schéma 1.9 rappelle les principales structures qui composent le cœur. Nous rappelons très succinctement la circulation du sang dans ses cavités. Le sang non oxygéné entre dans le cœur droit depuis les veines caves inférieure et supérieure, transite dans l’oreillette droite et est éjecté dans l’artère pulmonaire par le ventricule droit. De façon similaire, le sang oxygéné parvient au cœur gauche via les quatre veines pulmonaires, transite dans l’oreillette gauche, et est éjecté dans l’aorte par le ventricule gauche. Chaque ventricule 30 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL possède deux valves qui imposent au sang de circuler dans une seule direction. Ainsi, le ventricule droit (VD) est constitué des valves tricuspide et pulmonaire et, le ventricule gauche (VG) est constitué des valves mitrale et aortique. Ce mécanisme et ces structures se mettent progressivement en place au cours de la gestation. Une description détaillée est donnée dans le paragraphe suivant. F IG . 1.9 – Schéma anatomique du cœur. La morphogenèse du cœur Le cœur est l’un des tous premiers organes à se développer chez l’embryon de souris. Sa formation commence à la semaine et se termine à la semaine chez l’homme [Sissman 70] tandis que chez la souris, celle-ci débute à ED 8.5 et s’achève à ED 15.5 [Kaufman 92]. Au cours de ces 7 jours, le système cardiovasculaire et la circulation sanguine vont se mettre en place. Les Figures 1.10 et 1.11 donnent quelques étapes de la morphogenèse du cœur de l’embryon de souris, de la mise en place et de l’évolution de la vascularisation. Le lien entre la fonction cardiaque et la forme des cavités cardiaques a été reconnu par de nombreux investigateurs. Ces derniers étaient intéressés par la pathogenèse des anomalies congénitales cardio-vasculaires [Clark 90]. Ainsi, un intérêt croissant a été porté à la période de la morphogenèse du cœur aussi bien chez le mammifère [Nakazawa 88] que chez le volatile [Pelster 91]. Afin de pouvoir comparer les différentes espèces étudiées, notamment les correspondances dans les stades de gestation ou développement embryonnaire, les caractéristiques externes et internes du cœur de poulet [Pexieder 84a], de la souris [Theiler 89] et de l’homme [Pexieder 84b] ont été largement 31 1.2. LA SOURIS TAB . 1.4 – Correspondances approximatives des temps de gestation pour la morphogenèse des chambres cardiaques chez différentes espèces. Valeurs issues de a- [Sissman 70] ; b[Vuillemin 89a] et [Vuillemin 89b] ; c- [Pexieder 84a]. Embryon humain souris rat Période (jours) 28 à 56 10.5 à 15.5 12.5 à 17 étudiées en microscopie électronique et ont fourni des données anatomiques. Ces études ont permis de montrer des similarités entre les espèces mais aussi des différences significatives à des ages de gestation équivalents (voir Tableau 1.4). Ainsi, chez la souris et entre les âges de gestation EDs 8.5 et 9.5 (Figure 1.10 (a)), le cœur se présente sous la forme d’un tube où l’on retrouve les principales structures (ventricule et oreillette sont sous leurs formes primaires 7 ). Le développement important de la région bulboventriculaire ne peut se faire que par une inflexion du tube qui conduit le bulbe à adopter une position ventrale, le ventricule une position caudale et l’oreillette une position dorsale. La présence des flèches sur le schéma indique cette inflexion. Entre les âges de gestation EDs 8.5 à 10.5 (Figures 1.10 (a) et (b)), le sang ne circule que dans un sens, du système veineux (sinus venosus) vers le système aortique (aortic roots) en traversant les chambres cardiaques en formation (circulation sanguine du bas vers le haut sur la Figure 1.10 (a)). La circulation sanguine normale (voir paragraphe 1.2.2) se met en place lorsque les ventricules droit et gauche sont séparés par le septum interventriculaire. Cette séparation intervient entre les jours de gestation ED 10.5 et ED 14.5. L’évolution du système cardio-vasculaire est représentée sur la Figure 1.11. Trois paires de vaisseaux veine-artère, cardinale, l’ombilicale et la vitelline sont formées à EDs 8.5-9.5 et véhiculent le sang dans la totalité du corps de l’embryon de souris (diagramme 1.11(a)). Le système vasculaire se développe au cours de la gestation et vient progressivement irriguer les principaux organes de l’embryon (Figure 1.11(b)). A la naissance, la circulation sanguine est légèrement modifiée par la perte de la paire des vaisseaux ombilicaux. Ainsi, le lien entre le ductus arteriosus et l’aorte est stoppé. De plus, le retour veineux des poumons vers le cœur augmente et se traduit par l’interruption de la circulation sanguine entre les oreillettes gauche et droite. 7 respectivement ventricle et atrium en anglais sur le schéma 32 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL (a) (b) (c) F IG . 1.10 – Formation du système cardiaque de l’embryons de souris à différents âges de gestation. (a) Cœur de l’embryon de souris à ED 8-ED 9. Le schéma illustre le mouvement du cœur lors des premiers battements cardiaques ; (b) Coupe des chambres cardiaques à ED 10 ; (c) Coupe identique à ED 14. La paroi interventriculaire ou septum est formée. Schémas issus des travaux de K.K. Sulik et P.R. Bream Jr (http ://www.med.unc.edu/embryo_images/). 33 1.2. LA SOURIS (a) (b) (c) F IG . 1.11 – (a) Diagramme montrant la vascularisation de l’embryon à ED 8-ED 9 ; Le système cardiovasculaire de l’embryon de souris avant la naissance (b) et quelques jours après la naissance (c). Schémas issus des travaux de K.K. Sulik et P.R. Bream Jr. 34 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL 1.2.3 Préparation de la souris en vue de l’imagerie Comme précédemment évoqué, les biologistes ont une longue expérience de l’étude du modèle animal de la souris. Les travaux de recherche sont réalisés le plus souvent après le sacrifice de la souris et ne peuvent donc pas fournir des données concernant le développement du système cardiovasculaire des embryons chez la même souris au cours de la gestation. L’imagerie est une technique qui peut réduire de manière significative le nombre de sacrifices et permettre un suivi dans le temps des embryons d’une même souris. Cependant les techniques d’imagerie sont actuellement très peu utilisées par les biologistes. Concernant plus particulièrement l’imagerie ultrasonore nous avons été amenés à faire de nombreux choix, dans le respect des lois liées aux expérimentations animales, afin de réaliser l’imagerie de la souris, et plus précisément, le suivi du développement du système cardiovasculaire de l’embryon de souris au cours de la gestation. L’imagerie des petits animaux nécessite un moyen de contention pour faciliter le travail de l’opérateur et éviter les mouvements de l’animal, pouvant gêner voir empêcher l’examen. La reproductibilité des données lors d’un examen rend également nécessaire l’usage d’un moyen de contention. Ce paragraphe décrit les solutions proposées. La souris est un animal de petite taille ce qui rend possible la contention manuelle dans une main et laisse libre l’autre main pour agir ([Suckow 01] p.115). Un cylindre, prévenant l’expérimentateur de toute morsure du rongeur, est utilisé dans le cas d’injection intraveineuse, qui chez la souris s’effectue le plus souvent sur les veines latérales de la queue ([Suckow 01] p.124). Ces techniques se révèlent très utiles pour contenir la souris dans le cas d’une expérience de courte durée ( 3 minutes), mais permettent difficilement l’imagerie de la souris et deviennent rapidement inadéquates lors d’expérimentations dont la durée avoisine l’heure. A ce jour, l’anesthésie qui est, par définition, la perte de sensation semble être le moyen le plus approprié pour l’imagerie de la souris adulte. Cependant, l’imagerie de la souris non anesthésiée n’est pas impossible mais nécessite un entraînement de l’opérateur afin que la souris s’habitue à la contention manuelle. Une étude, évaluant la fonction cardiaque chez la souris adulte avec et sans anesthésie, a été réalisée en ultrasons et rapporte ces difficultés [Yang 99]. L’anesthésie semble toutefois être inévitable pour l’imagerie de l’embryon de souris. Nous nous limiterons, dans ce manuscrit, aux informations concernant les anesthésiques couramment utilisés pour l’étude des petits animaux. Il existe deux types d’anesthésie : – l’anesthésie par injection – l’anesthésie par inhalation 35 1.2. LA SOURIS Anesthésie par injection L’anesthésie par injection est utilisée dans de nombreuses expérimentations médicales chez le petit animal. Elle consiste en l’utilisation d’une seringue remplie d’une dose d’anesthésique. Cette dose dépend du poids de la souris et est injectée par différentes voies dans le corps de la souris. Les produits les plus souvent utilisés sont les barbituriques injectables, le thiopental et le pentobarbital. Ces anesthésiques sont associés, d’après la littérature, à une dépression cardiaque et éventuellement à des arrythmies cardiaques ([Suckow 01] p.101-4). Ainsi, pour le suivi du développement cardiovasculaire et plus précisément la mesure de paramètres hémodynamiques, ils apparaissent comme désavantageux. Cependant, une récente étude en ultrasons sur les embryons de souris a conclu que l’usage d’un tel anesthésique, pentobarbital associé à du sulfate de magnésium, ne semblait pas donner de résultats abérants [Phoon 00]. Par ailleurs, les anesthésiques injectables possèdent une faible marge de sécurité, c’est à dire que la différence entre la dose efficace et la dose létale8 est faible. Des informations complémentaires sur les effets de l’anesthésie par injection sont données dans le Tableau 1.5. Anesthésie par inhalation L’anesthésie par inhalation gazeuse est également très répandue dans les protocoles expérimentaux. L’inhalation gazeuse permet, entre autre, un excellent contrôle de la profondeur d’anesthésie. Le circuit d’anesthésie consiste en l’utilisation d’un vaporisateur, d’un approvisionnement en oxygène, d’un absorbeur de dioxyde de carbone et d’un circuit de thermorégulation. La souris respire le mélange gaz-oxygène par un masque adapté à sa tête. Les principaux anesthésiques utilisés sont l’halothane et l’isoflurane. Suckow défend que l’isoflurane est un bien meilleur anesthésique que l’halothane ([Suckow 01] p. 99100), surtout pour l’étude du système cardiovasculaire ou cérébral. En effet, l’halothane peut provoquer des disfonctionnements cardiaques beaucoup plus importants que l’isoflurane. Des études comparatives d’anesthésiques injectables et inhalants ont également été menées. Par exemple, une étude comparant les effets hémodynamiques respectifs d’anesthésiques injectables (association kétamine-valium) opposés à l’halothane a montré que l’halothane apparaissait plus efficace lors de l’étude cardiaque par échocardiographie de la souris. En effet, Chao et al. [Chaves 01] ont montré que l’halothane provoquait moins de bradycardie, diminuait moins la fraction de raccourcissement du ventricule gauche et le débit cardiaque chez la souris, à un état d’anesthésie comparable. Quelques commen8 dose entraînant la mort de l’embryon 36 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL TAB . 1.5 – Tableau comparatif des anesthésiques pour la souris. Les doses sont données en fonction du poids de la souris (i.e. par gramme du poids du corps de la souris). Ip :Intraperitonéale ; Im : Intramusculaire ; Inhal :Inhalation. Anesthésique Commentaires Dose Voie Réf Pentobarbital Tachycardie, Hypotension 0.05-0.08 mg/g Ip [Furukawa 98] Hypothermie [Sarin 90] Urethane et préférable pour des études 0.012 mg/g Ip [Dalkara 95] chloralose cardiovasculaires et cérébrales 0.075 mg/g Azaperone Sédatif excellent, 0.025-0.1 mg/g Im [Olson 88] 3 % vol/vol Inhal [Rohrer 98] 1-2% vol/vol Inhal [Desai 97] [Tanaka 96] réflexe non éliminée Isoflurane Utile pour des études cardiovasculaires et cérébrales Methoxyfluorane Utile pour des études cardiovasculaires et cérébrales taires généraux, issus de plusieurs travaux concernant la souris et utilisant un ou plusieurs anesthésiques, sont donnés dans le Tableau 1.5. Pour plus d’information, le lecteur se reportera à [Rao 00]. L’anesthésie par inhalation apparaît donc la plus appropriée pour les études cardiaques. Cependant, elle nécessite des appareillages permettant de contrôler tout le long de l’expérimentation la physiologie de la souris. Son utilisation implique donc une dépense financière plus importante et également une formation de l’utilisateur à ces instruments. Finalement, le choix des anesthésiques est conditionné par la nature de l’étude envisagée et par les effets connus de ces anesthésiques. Pour les études menées au cours de ce travail de thèse, l’anesthésie par inhalation gazeuse à l’isoflurane a été privilégiée. 37 1.3. ANIMAGE : PLATEFORME MULTIMODALE D’EXPLORATION IN VIVO DU PETIT ANIMAL 1.3 ANIMAGE : Plateforme multimodale d’exploration in vivo du petit animal Prenant en compte la nécessité de développer des techniques et des méthodes spécifiques pour l’étude in vivo des petits animaux, le projet de plateforme d’imagerie multimodale ANIMAGE, a été lancé, sous la direction de Marc Janier, médecin à Creatis, durant mon travail de thèse. Dans le cadre de cette plateforme, plusieurs études en imagerie ultrasonore ont été réalisés. Deux de ces études seront introduites dans la suite de ce chapitre. 1.3.1 Les objectifs d’ANIMAGE L’originalité de ce projet tient à la mise en place d’une plateforme multi-modale dédiée à l’imagerie du petit animal de laboratoire que ce soit pour aider les biologistes développant des modèles de souris transgéniques ou les biologistes utilisant le petit animal de laboratoire comme outil d’étude d’une pathologie. Il n’existe pas à l’heure actuelle de technique d’imagerie idéale dans cette indication, de la même façon que pour répondre aux besoins d’exploration chez l’Homme, plusieurs méthodes complémentaires peuvent être utilisées. Disposer d’une plateforme d’imagerie multimodale permet de proposer aux biologistes la ou les méthodes complémentaires qui répondront le mieux à leurs besoins. Plusieurs équipes participent au développement d’ANIMAGE. Creatis (UMR 5515) pour l’échographie et le traitement de l’image, le laboratoire de RMN (UMR 5012) pour l’IRM, le CERMEP pour la TEP, l’Ecole Vétérinaire de Lyon pour la prise en charge des animaux et le Génopole Rhône-Alpes pour le développement d’animaux. Les principaux objectifs d’ANIMAGE sont : – le développement de méthodes adaptées aux préoccupations des biologistes, permettant entre autres : 1. le suivi de la gestation en IRM et échographie 2. l’évaluation non-invasive de l’expression d’un gène par adaptation des méthodes de type "gène rapporteur" en IRM et TEP 3. l’exploration de la trame osseuse et de son métabolisme en Rayons X, IRM et TEP 4. le suivi du métabolisme tumoral 5. l’étude de la fonction cardio-vasculaire 38 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL – La participation aux développements d’appareils d’imagerie adaptés au petit animal Les systèmes disponibles sur le marché à l’heure actuelle commencent à proposer des solutions orientées "petit animal", mais des améliorations notables doivent encore être apportées. ANIMAGE s’est engagé dans plusieurs projets de recherche dont nous citons quelques exemples ici : – définition d’un cahier des charges spécifique pour le développement d’un microTEP et validation pour l’étude des souris transgéniques. Ces développements rentrent dans le cadre de la collaboration européenne Crystal Clear. Cette démarche devrait permettre la commercialisation d’un microTEP européen. – développement de séquences IRM rapides permettant de réaliser des études de micro-imagerie en IRM fonctionnelle ou anatomique. Cette orientation est liée au fait que les aimants RMN haut champ commencent à devenir accessibles dans le commerce, mais qu’ils ne disposent pas de séquences d’acquisition d’images adaptées à l’étude du petit animal. L’exploitation de ces nouvelles séquences nécessite de quantifier la résolution et la précision des images IRM obtenues. Une démarche de validation des outils développés en microTEP et en IRM par la réalisation d’acquisition de fantômes et le développement de simulateurs sera envisagée de façon à évaluer les erreurs obtenues sur la quantification des phénomènes observés. – développement de traceurs TEP ou IRM adaptés à l’exploration des voies métaboliques, de l’expression du gène ou autres. Des travaux portent actuellement sur l’adaptation de la méthode du gène rapporteur à la TEP et à l’IRM. Les besoins biologiques déjà exprimés sont très nombreux, c’est pour cette raison qu’une démarche spécifique de développement de méthodes automatisées est envisagée. Elle vise à permettre de façon automatique l’exploration anatomique de souris vivantes ou mortes en intégrant toutes les étapes allant de l’acquisition à l’extraction de données afin d’augmenter les possibilités de "screening". Au cours de mon travail de recherche, ANIMAGE s’est doté de deux machines ultrasonores haute fréquence (ATL, Philips, 7-15 MHz ; Ultrasons Technologies, 20 MHz), d’un Micro-scanner RX haute résolution, d’un IRM 7T champ horizontal. Une animalerie de transit a également été réalisée. 39 1.3. ANIMAGE : PLATEFORME MULTIMODALE D’EXPLORATION IN VIVO DU PETIT ANIMAL 1.3.2 Projets en imagerie ultrasonore à ANIMAGE Fonction cardiaque de l’embryon Le laboratoire LBMC (Laboratoire de Biologie Moléculaire et Cellulaire, ENS Lyon) a développé une souche particulière de souris transgéniques. Cette souche 129 permet d’étudier les effets de l’hormone thyroïdienne. Les effets connus de cette hormone sont principalement issus de données histologiques et les seules données plus proches de la réalité physiologique ont été étudiées chez la souris adulte. Les résultats suggèrent que le récepteur joue un rôle majeur dans la régulation de la fréquence cardiaque et du métabolisme normal. Il a été démontré que l’hormone thyroïdienne est impliquée dans la régulation de processus physiologiques et agit par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques. Ces récepteurs augmentent ou diminuent l’expression de gènes cibles (le TR et le TR ). Le rôle du récepteur a pu être évalué en utilisant des souris déficientes en récepteur . Les conséquences de ces délétions spécifiques n’ont pour l’instant été évaluées que sur des souris adultes et principalement sur des données histologiques. Les éventuels effets de ces mutations chez l’embryon ne sont pas encore connus. L’étude proposée a donc pour objectif d’étudier les conséquences de ces délétions chez les embryons in vivo. Dans une première étape, les paramètres quantitatifs pouvant être déduits par l’utilisation des potentialités de l’imagerie ultrasonore et susceptibles de décrire l’état physiologique de la souris doivent être déterminés. Dans une seconde étape, la création d’une base de données de référence pour la souche étudiée doit être créée pour des souris normales et pathologiques. Enfin l’effet de l’hormone thyroidienne pourra être évalué sur ces souris. Au cours de mon travail de recherche, j’ai participé en collaboration avec W. Mai (thèse de doctorat à ANIMAGE) à la première étape et à la création d’une base de paramètres quantitatifs de référence pour la souche . Les résultats relatifs à cette étude sont présentés dans le chapitre 2. Suivi du développement embryonnaire Ce projet a pour principal objectif d’identifier des paramètres quantitatifs pouvant décrire le développement normal de l’embryon au cours de la gestation. En ultrasons, nous nous sommes intéressés à la visualisation et à la quantification 3D de l’embryon de souris. Les résultats de ce travail sont présentés dans le chapitre 2. 40 CHAPITRE 1. IMAGERIE POUR LE PETIT ANIMAL 1.4 Conclusion La souris est un modèle animal de plus en plus étudié et plusieurs modalités d’imagerie peuvent convenir à son exploration in vivo. L’imagerie du petit animal a donc un avenir prometteur pour les raisons suivantes : – le génome de la souris est entièrement séquencé et est très proche de celui de l’homme (99%). Cela rend donc envisageable la compréhension du rôle des gènes dans un organisme aussi complexe que celui de l’homme, – le développement de maladies et la réponse aux traitements de ces maladies chez la souris sont également proches de celle de l’homme. La compréhension des mécanismes de ces maladies peut donc être envisagée par l’étude de modèles chez la souris. – des modalités d’imagerie existent et apportent chacune leurs avantages pour l’exploration anatomique et fonctionnelle de la souris. Les difficultés de l’imagerie de la souris et du système cardiovasculaire de ses embryons sont principalement liées à la petite taille des organes (Tabs. 1.2 et 1.3) et à un développement intra-utérin des embryons. La fréquence cardiaque très élevée des embryons, comme nous le verrons au chapitre 2, est également une sérieuse difficulté. La contention de la souris est également un problème pour les différentes modalités d’imagerie. La solution la plus adaptée, pour nos études en imagerie ultrasonore, est l’anesthésie par inhalation. Dans la suite du manuscrit, les résultats de mes différents travaux de recherche obtenus en imagerie ultrasonore à haute fréquence seront présentés. Le suivi du développement du système cardiovasculaire de l’embryon et la visualisation 3D, travaux menés à ANIMAGE, à relativement hautes fréquences (7.5-15 MHz) sont présentés dans le chapitre 2. Mes travaux de recherche menés à Toronto et concernant l’étude des variations d’échogénicité du sang dans les chambres cardiaques des embryons de souris à haute fréquence (19-40 MHz) sont présentés dans les chapitre 3 et 4. 41 1.4. CONCLUSION 42 Chapitre 2 Imagerie quantitative de la souris adulte et gestante en ultrasons Ce chapitre définit les principaux modes d’imagerie appliqués à la souris adulte et gestante en imagerie ultrasonore. Un état de l’art de l’imagerie ultrasonore quantitative de ces modes est dressé. Cet état de l’art s’intéresse principalement aux travaux concernant le système cardio-vasculaire. Les paramètres quantitatifs associés à chacun des modes sont définis et les résultats obtenus à différentes fréquences ultrasonores, avec des systèmes ultrasonores différents, sont présentés. La première section s’attache aux travaux menés en mode B et M, la seconde aux travaux menés en mode Doppler et la troisième aux mesures quantitatives 3D. Les résultats de nos travaux de recherche, en mode Doppler et 3D menés sur la plateforme d’imagerie ANIMAGE, sont présentés dans les sections correspondantes. 43 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M 2.1 Mesures quantitatives en mode B et mode M Le mode B est une représentation 2D du milieu imagé par une sonde ultrasonore. C’est une image de coupe pour laquelle un des axes correspond à la distance de pénétration des ultrasons dans les tissus et l’autre axe représente la largeur d’exploration de la sonde. Le mode M produit également une image 2D mais cette fois, une ligne de tir de la sonde est observée au cours du temps. Un des axes correspond donc à la pénétration des ultrasons dans les tissus et l’autre axe est le temps. Les mesures quantitatives en mode B et en mode M concernent principalement des mesures anatomiques (dimensions des organes ou des tissus biologiques). Des paramètres fonctionnels peuvent également être déduits à partir de ces mesures. La qualité de l’image du milieu insonifié dépend largement de la sonde ultrasonore utilisée. Une sonde ultrasonore est principalement caractérisée par sa géométrie, sa largeur de bande et sa fréquence centrale. Nous présentons brièvement les deux principaux types de sonde ultrasonore ainsi que les récentes applications de ces deux modes à la souris et plus particulièrement aux embryons de souris. 2.1.1 Les différentes sondes ultrasonores et les paramètres mesurés Sonde ultrasonore mono-élément Dans le cas, d’une sonde ultrasonore (transducteur) mono-élément, l’image 2D est le résultat d’une juxtaposition de signaux ultrasonores obtenus lors du déplacement mécanique du transducteur. Ces signaux, également définis comme signaux radio-fréquences (RF), subissent une chaîne de traitement numérique qui est résumée sur la Figure 2.1. Ce type F IG . 2.1 – Chaîne de traitement des signaux ultrasonores dans le cas d’une sonde monoélément. 44 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS de sonde permet d’atteindre des fréquences très élevées, ce qui est très intéressant pour les domaines médicaux nécessitant une imagerie superficielle, principalement l’ophtalmologie et la dermatologie. L’imagerie de l’intérieur des vaisseaux peut également être réalisée avec un transducteur mono-élément (CVIS à 40 MHz). Des images ont déjà été réalisées jusqu’à des fréquences de 200 MHz [Knapik 97] mais aucun prototype d’imagerie n’est à ce jour disponible au-delà de 65 MHz. Sonde ultrasonore multi-éléments Dans le cas d’une sonde multi-éléments, l’image 2D est le résultat de la mise en forme de signaux ultrasonores obtenus par les différents éléments. Les traitements numériques subis par les signaux ultrasonores sont résumés sur la Figure 2.2. F IG . 2.2 – Chaîne de traitement des signaux ultrasonores dans le cas d’une sonde multiéléments. Y et Y représentent des images indépendantes, formées en faisant varier le nombre des éléments de la sonde. La plupart des systèmes d’imagerie ultrasonore utilisés dans les centres hospitaliers sont équipés de sonde multi-éléments. On trouve une grande variété de type de sondes (sondes linéaires 1D et 1.5D, circulaires, annulaires, . . .) permettant de s’adapter aux spécialités médicales (cardiologie, pédiatrie, . . .). Très récemment, la faisabilité d’une sonde linéaire de fréquence centrale de 30 MHz a été démontré par Ritter [Ritter 02] mais à ce jour uniquement des bandes de fréquence jusqu’à 15 MHz sont disponibles et utilisées en routine clinique. Une seule exception est toutefois à noter avec les échographes endovasculaires qui réalisent une imagerie à des fréquences de 20 MHz (Endosonics Inc. intracoronary imaging arrays). 45 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M Comparaison des 2 types de sonde Le but commun des sondes mono-élément et multi-éléments en imagerie mode B est l’affichage de la meilleure qualité d’image pour l’application envisagée. En mode B, un compromis est toujours réalisé entre la résolution spatiale et la profondeur d’exploration. En effet, les hautes fréquences correspondent à une meilleure résolution axiale et latérale mais à une profondeur d’exploration réduite. Les hautes fréquences sont donc privilégiées dans le cas d’une imagerie superficielle. Cette diminution en profondeur d’exploration s’explique principalement par l’atténuation qui est directement liée au tissu imagé. Ainsi, la fréquence et les résolutions axiales et latérales du faisceau ultrasonore des sondes mono-éléments et multi-éléments sont des paramètres déterminants suivant le type d’imagerie à réaliser. Dans le cas de l’imagerie de la souris adulte et gestante, on se place dans le cas d’une imagerie superficielle. Plus précisément, les signaux RF provenant d’une profondeur supérieure à 1,5 cm n’ont pas d’intérêt. Les sondes multi-éléments équipent l’ensemble des échographes commerciaux utilisés en routine clinique. Les avantages de ce type de sonde sont nombreux car la gamme de choix de ces appareils est vaste. Les modes d’imagerie les plus avancés sont disponibles sur de tel système : mode B classique, imagerie harmonique, mode M, différents modes Doppler (pulsé, couleur, puissance). Ces machines conventionnelles équipées des sondes multi-éléments permettent également la sélection de zones focales à différentes profondeurs (focalisation dynamique). De plus, elles possèdent une cadence image très élevée (jusqu’à plusieurs centaines d’images par seconde). Ce paramètre est un paramètre déterminant dans le cas des applications cardiaques. Toutefois, les systèmes basés sur le déplacement mécanique d’un élément ou sonde monoélément offrent des performances bien plus élevées sur des points précis avec le plus souvent un coût moindre. L’excellente résolution axiale et latérale obtenue en augmentant la fréquence centrale et la possibilité de mesurer des vitesses très faibles avec une plus grande précision sont les principaux avantages. Le Tableau 2.1 illustre la comparaison entre la sonde mono-élément à 40 MHz, utilisée dans le système de Visual Sonics (Toronto, CANADA), la sonde mono-élément à 20 MHz, utilisée dans le système DERMCUP 2020 de la société Ultrasons Technologie de Tours, et la sonde multi-éléments 15L8 de la société Acuson. 46 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS TAB . 2.1 – Comparaison des caractéristiques d’une sonde mono-élément et multiéléments hautes fréquences. Les valeurs sont issues de [Zhou 02]. a- transducteur large bande (Visual Sonics VS40) ; b- transducteur large bande (DERMCUP 2020) ; c- sonde linéaire Acuson 15L8. Paramètres Sondes mono-élément Fréquence d’imagerie(MHz) Sonde linéaire 40 20 Profondeur d’exploration (mm) 8 5.1 Cadence image (nbimages.s 8 10 Résolution latérale ( ) 68.2 210 200-500 Résolution axiale ( ) 38.5 80 50-100 40 - 6 64-257 - 500 0.233-0.932 - 1-23.5 - ) Fréquence Doppler (MHz) Échantillon Doppler (axial)( ) Volume Doppler( ) Vitesse sanguine détectable ( ) 8-15 (13) 20 - ?- Paramètres mesurés sur l’image pour caractériser le système cardiovasculaire En prenant pour exemple des mesures réalisées chez l’homme lors d’examens en échographie, plusieurs paramètres permettent également de quantifier l’activité cardiovasculaire chez la souris. Sur modèle animal, il est ainsi possible de répondre à des questions concernant le développement du système cardiaque, les maladies cardio-vasculaires ou les retentissements dus à des manipulations génétiques. Les principaux paramètres mesurés sur les images ultrasonores en mode B et mode M, chez la souris adulte sont des paramètres anatomiques. Ces paramètres permettent l’étude de la fonction cardiaque par des formulations mathématiques basées sur des considérations géométriques de la forme du cœur. Les techniques de mesure sur les images mode B ou mode M sont bien connues [Sahn 78] et ont été validées chez l’homme et plus récemment chez la souris. Les paramètres anatomiques à partir desquels sont calculés des paramètres fonctionnels sont : – surface des ventricules gauche et droit (SVG et SVD) à partir d’images en coupe transversale enregistrées pendant la diastole (SVGD) ou la systole (SVGS). – dimension du ventricule gauche à la fin de la diastole (VGD) et à la fin de la systole (VGS) sur des images en coupe transversale en mode B. A partir de cette vue, un mode M proche des muscles papilaires est généralement utilisé pour la mesure des dimensions des chambres cardiaques et des paramètres suivants : – épaisseur du septum interventriculaire (SI) – épaisseur de la paroi postérieure (PP) 47 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M F IG . 2.3 – Paramètres anatomiques mesurés à partir d’un affichage en mode M. Image obtenue sur un rat normal avec une sonde L12-5 Acuson, ATL image modifiée à partir de [Behr 00]. – diamètre des vaisseaux (D) La Figure 2.3 illustre quelques paramètres dans le cas d’un mode M réalisé chez un rat normal. A partir de ces mesures quantitatives, des paramètres fonctionnels sont déduits. Il s’agit de la masse ventriculaire (MV), la fraction d’éjection (FE), la fraction de raccourcissement (FR). Ces paramètres peuvent être définis de la manière suivante : ! lumique du myocarde. & & – "#$%& (' & ) – "*%& ' ) – où 1.055 est la masse vo- ,+ Le débit cardiaque (DC) est généralement calculé en multipliant la surface d’une coupe 2D de l’aorte par la vitesse moyenne ( ) du sang dans ce vaisseau et par la fréquence cardiaque (F ). La surface est estimée en supposant que l’aorte est un cylindre dont le diamètre (D) est directement mesuré sur la coupe 2D. La vitesse moyenne et la fréquence $-. 0/ 1 32 , + " cardiaque sont estimées en mode Doppler. Ainsi, . Le débit est le plus souvent exprimé en cm .min chez l’homme. D’autres formulations peuvent être trouvées dans la littérature pour le calcul de ces paramètres. 48 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS 2.1.2 Applications à la souris et aux embryons de souris Applications à la souris adulte et principaux résultats Chez la souris adulte, la structure et la fonction cardiaque ont été principalement étudiées. La plupart de ces études ont été réalisées en utilisant le mode M alors que le mode B servait principalement à guider l’opérateur. Le mode M semble être en effet le plus approprié pour effectuer la mesure des paramètres précédemment cités chez la souris adulte comme dans les travaux de Hoit et Walsh [Hoit 97a]. Son efficacité a tout d’abord été démontrée à des fréquences comprises entre 7 et 7.5 MHz par les travaux de [Manning 94] et de [Gardin 95]. Ces travaux ont montré qu’il est possible d’étudier la fonction cardiaque de manière non-invasive et d’effectuer des mesures précises et répétées de la masse ventriculaire (MV) du VG sur des souris normales et sur un modèle de souris d’hypertrophie du VG. A 9 MHz, Tanaka a réalisé le même type d’étude en effectuant les mesures sur différents modèles de souris trangéniques tandis que Hoit a étudié la fraction de raccourcissement (FR) du VG après injection de dobutamine et verapamil. Ainsi les sur-expressions du récepteur et du gène H-ras ont été quantifiées, notamment, par la mesure de l’épais- seur de la paroi postérieure (PP) [Tanaka 96]. Le remplissage du VG a également été étudié dans différentes conditions [Hoit 97b]. Ces études ont toutes montré une bonne reproductibilité des mesures par comparaison des mesures effectuées par le même expérimentateur plusieurs fois (intraopérateur) et en les confrontant à une mesure effectuée par un autre expérimentateur (interopérateur). Elles ont également soulevé quelques limitations de la technique d’imagerie, notamment la faible résolution axiale des systèmes d’imagerie utilisée et l’utilisation du "standoff". Ce dernier est un couplant entre la surface du transducteur et l’objet. Il a pour but de positionner l’organe étudié à la distance focale lorsque celle-ci est fixée par le système d’imagerie et a donc une impédance acoustique très proche de celle des tissus. Très récemment le développement des machines ultrasonores hautes fréquences, entre 12 et 15 MHz, semble en partie résoudre ces limitations. Fentzke a étudié le facteur de transcription -*# et a montré qu’il jouait un rôle important dans le développement de la cardiomyopathie dilatée 1 . Il a montré qu’il pouvait conduire à un modèle de souris transgénique de cette maladie [Fentzke 98]. Les hautes fréquences semblent même permettre l’évaluation de certains paramètres en s’affranchissant du mode M. Autrement dit, l’augmentation de la résolution latérale et la bonne résolution temporelle de ces appareils 1 défaillance du ventricule gauche ou bi-ventriculaire 49 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M (sondes multi-éléments) suffisent pour mesurer certains paramètres cardiaques en mode B. Par exemple, l’utilisation d’une sonde multi-éléments à 12 MHz a permis d’estimer la taille du VG et la masse ventriculaire (MV) du VG en mode B chez des souris normales et des souris développant une hypertrophie du VG [Fard 00]. Cependant, le mode M reste le mode d’imagerie le plus utilisé pour la mesure des paramètres cardiaques. En effet, les dimensions du VG de souris adultes (129SvEv/Tac) conscientes et anesthésiées ont été évaluées à l’aide d’une sonde ultrasonore (8-15 MHz) en mode M, au cours du cycle cardiaque [Yang 99]. Cette étude montre que les mesures du VG, des épaisseurs du septum interventriculaire (SI) et de la paroi postérieure (PP) réalisées sur souris anesthésiées diffèrent de celles réalisées sur souris conscientes. Par exemple à la diastole, le VG mesurait chez la souris consciente alors qu’il mesurait chez la souris anesthésiée. On peut remarquer que le ventricule droit a été très peu étudié, principalement parce qu’il est très difficile à imager en ultrasons. En effet le VD, chez la souris adulte, est localisé trop en profondeur pour pouvoir être imagé par les sondes ultrasonores conventionnelles. Sa géométrie est également une source de problème. Cependant, une équipe a réalisé l’imagerie du VD [Scherrer-Crosbie 98] en utilisant un transducteur intravasculaire, introduit dans l’oesophage de la souris, et de fréquence centrale 30 MHz. Cette technique d’imagerie est connue sous le nom d’imagerie transoephagienne et est utilisée en routine clinique chez l’homme. Cette étude s’intéressait aux mécanismes qui pourraient être à l’origine de l’hypertension pulmonaire. Elle a permis de détecter et de quantifier les effets de l’hypoxie chronique par le calcul du volume du VD. Les principaux résultats de la mesure des paramètres anatomiques de ces différentes études sont présentés dans le Tableau 2.2. Ce tableau permet de comparer les mesures réalisées à différentes fréquences par différentes équipes et donne les dimensions des chambres cardiaques de la souris adulte. Il suggère la nécessité d’utiliser des fréquences au dessus de 15 MHz pour la mesure des paramètres anatomiques de l’embryon de souris. Les différences observées suivant les études ne sont pas liées aux fréquences utilisées, elles sont plutôt à attribuer aux souches étudiées, aux types d’anesthésiques utilisées et aux différents expérimentateurs. Nous avons vu au chapitre 1, Tableau 1.5, que les anesthésiques pouvaient entraîner des troubles cardiaques et donc les dimensions cardiaques peuvent être sous ou sur-estimées suivant les troubles (bradycardie ou tachycardie). Il est également intéressant de noter que les débits cardiaques n’ont pas été calculés à des fréquences en dessous de 9 MHz, cela est certainement lié au fait qu’à ces fréquences la mesure du diamètre des vaisseaux n’est pas réalisable. 50 réalisées. Fréquence d’imagerie mode B et mode M 30 MHz [Scherrer-Crosbie 98] [Fentzke 98] NR [Fentzke 98] NR NR SI (mm) 0.8 [Gardin 95] NR [Yang 99] NR [Yang 99] [Williams 98] PP (mm) [Pollick 95] NR NR VDS NR NR NR Paramètres fonctionnels ) NR NR Sondes multi-éléments [Yang 99] NR [Yang 99] NR NR DC du VD( [Pollick 95] NR ) DC du VG( NR [Fentzke 98] FE (%) NR [Williams 98] FR (%) NR NR NR 1.5 [Yang 99] MV du VD (mg/mg) NR [Gardin 95] MV du VG (mg/mg) 51 VDD [Williams 98] VGS (mm) 12-15 MHz [Manning 94] VGD (mm) 9 MHz [Hoit 95] 5-7.5MHz Paramètres anatomiques Sonde mono-élément CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS TAB . 2.2 – Comparaison de mesures de paramètres anatomiques chez la souris adulte, obtenues à différentes fréquences. NR : mesures non 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M Applications à l’embryon de souris et principaux résultats A plus haute fréquence avec une sonde mono-élément (40 MHz), l’imagerie du développement embryonnaire de la souris a été entreprise aux stades de gestation correspondant aux développements d’organes vitaux, principalement le cœur et le cerveau, par l’équipe de D.H. Turnbull [Turnbull 99] qui est la première à avoir publié des résultats concernant l’imagerie des embryons de souris par les US [Turnbull 95]. En effet, à cette fréquence, une résolution axiale de l’ordre de 40 de 100 et une résolution latérale de l’ordre sont obtenues comme précédemment évoqué et ces résolutions permettent de visualiser l’anatomie des embryons. La première étude publiée par ce groupe en 1998, a été menée sur des souris normales et des souris hétérozygotes mutantes VCAM-1 2 . Cette étude réalisée par [Srinivasan 98] montre qu’il est possible d’étudier le développement du cœur dès ED 8.5, d’effectuer la mesure des dimensions du VG et du VD à partir de ED 10.5 et de rendre compte des défauts cardiaques induits par la non-expression du VCAM1. Le dispositif expérimental mis en place pour la réalisation de cette étude est illustré sur la Figure 2.4 (a). D’autres études ont également été réalisées à ces fréquences pour étudier la cardiomyopathie dilatée chez les nouveaux-nés [McConnell 99]. Finalement, les hautes fréquences ont également permis de réaliser la manipulation in vivo des embryons de souris en guidant l’expérimentateur par l’imagerie en mode B. Plusieurs études, tel que le suivi du développement du cerveau après injection d’un virus provoquant une croissance anormal du cerveau de l’embryon [Gaiano 99], ont été menées en utilisant le dispositif illustré sur la Figure 2.4 (b). Ainsi, sans sacrifice de l’embryon, le développement du cerveau a pu être étudié à différents stades de gestation. 2 vascular cell adhesion molecule-1 est un gène dont le rôle est déterminant dans la fusion du chorion et de l’allantois. La fusion entre ces deux tissus est indispensable pour la survie du fœtus. 52 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS (a) (b) F IG . 2.4 – (a)- Schéma du banc d’acquisition utilisé pour l’imagerie du cœur de l’embryon de souris et des mesures Doppler. (b)- Schéma du banc d’acquisition pour le guidage d’injection de cellules chez l’embryon d’après [Turnbull 02]. 53 2.1. MESURES QUANTITATIVES EN MODE B ET MODE M TAB . 2.3 – Comparaison d’une approche en microscopie électronique [Keller 96] et d’une approche par les ultrasons [Srinivasan 98] concernant la mesure de la surface des chambres cardiaques de l’embryon de souris à ED12.5. Référence [Keller 96] Période de gestation Souche EDs 10.5-16.5 C3HeB Anesthésie ex vivo C57B1/J6 ICR [Srinivasan 98] EDs 8.5-13.5 CD1 pentobarbital + mutation du VCAM-1 magnésium Microscopie électronique VG diastole (mm ) diastole (mm ) systole (mm ) systole (mm ) VD in utero Ultrasons à 40 MHz La mesure des VD et VG des embryons de souris a également été réalisée en microscopie électronique (ME) par Keller. Cette étude a fourni des données de référence intéressantes à comparer avec les résultats publiés en US. Le Tableau 2.3 permet de comparer les résultats obtenus en microscopie électronique et en US. On remarque que les mesures effectuées en US sont toutes supérieures à celles estimées par microscopie électronique mais elles sont du même ordre de grandeur. Les différences observées ( et à la diastole, pour le VG et VD respectivement) peuvent être attribuées aux méthodes d’imagerie employées. La microscopie électronique est invasive car les embryons sont exposés après avoir subi une opération chirurgicale, contrairement aux US où les embryons sont étudiés in utero. Les projections utilisées pour déterminer la surface des ventricules ne sont pas exactement les mêmes. La souche des souris utilisées (voir Tableau 2.3) peut également expliquer ces différences. Finalement, les seules mesures quantitatives réalisées à partir du mode B concernent la mesure des chambres cardiaques. Aucun travail utilisant le mode M n’a été publié sur l’embryon. C’est une des raisons pour lesquelles j’ai été amené à travailler sur ce sujet. Le travail de recherche que j’ai pu réaliser dans le laboratoire de Stuart Foster a consisté à quantifier les variations d’échogénicité du sang à haute fréquence au cours de la formation du cœur de l’embryon de souris. Pour ce travail, nous avons, entre autre, développé et utilisé la visualisation en mode M à haute fréquence (40 MHz). Ce travail est présenté dans les chapitres 3 et 4. 54 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS 2.2 Mesures quantitatives en mode Doppler Les mesures quantitatives en mode Doppler concernent la mesure des flux sanguins intracardiaques et intravasculaires. Les flux normaux et les flux pathologiques peuvent ainsi être repérés et leurs vitesses enregistrées, ce qui permet de suivre la progression d’une anomalie en temps réel. Ces mesures sont réalisées sur une zone géométrique, appelée échantillon Doppler, délimitée par l’opérateur à partir de l’échographe. La précision de ces mesures dépend de la sonde ultrasonore utilisée (voir Tableau 2.1). A partir de ces mesures, un grand nombre de paramètres hémodynamiques peut être déduit. Dans ce qui suit, nous présentons brièvement les trois principaux modes Doppler. Les récentes applications de ces techniques à la souris et plus particulièrement aux embryons de souris sont également présentées. 2.2.1 Les différents modes Doppler et paramètres mesurés Doppler pulsé et continu Le principe du mode Doppler est de détecter des décalages fréquentiels liés à la vitesse du sang dans les vaisseaux. L’équation Doppler qui lie les différents paramètres est la , (2.1) est le décalage en fréquence, est la fréquence transmise par le transducteur, est suivante : où , l’angle entre la direction du flux sanguin et la direction du faisceau Doppler ultrasonore, est le demi-angle entre les directions des faisceaux transmis et reçus, est la vitesse du sang, et c la vitesse du son dans le milieu insonifié. Dans le cas du Doppler pulsé, un transducteur fonctionne en émission et en réception ( vaisseau insonifié se déduit de l’équation 2.1 : , ), ainsi le flux à l’intérieur du (2.2) La Figure 2.5 illustre les modes Doppler pulsé et Doppler continu dans le cas de l’interrogation d’un vaisseau sanguin. Il faut noter que dans le cas du Doppler pulsé, le décalage en fréquence n’est pas mesuré directement, c’est un décalage en phase entre deux signaux reçus qui est mesuré. Les principales limitations du Doppler Pulsé sont la vitesse maximale mesurable et la profondeur à laquelle la mesure peut-être réalisée. Un signal n’est transmis dans le tissu qu’après réception du dernier signal émis dans ce tissu. La fréquence de répétition des 55 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER F IG . 2.5 – Illustration du Doppler pulsé et continu, schéma modifié de la Figure 2 dans [Aristizabal 98]. tirs successifs est connu sous le nom de PRF pour Pulse Repetition Frequency. Elle détermine le décalage en fréquence maximale ou fréquence Doppler qui est mesurable et donc la vitesse maximale [Routh 96]. Le Doppler continu apporte des solutions à ces limitations mais l’opérateur ne peut alors déterminer avec précision la position des vitesses mesurées. Doppler couleur Le Doppler couleur est une technologie plus récente. Il s’agit d’une forme sophistiquée de Doppler pulsé qui est appliquée à une plus grande région d’intérêt. La vitesse moyenne est estimée par corrélation temporelle des échos entre deux tirs ultrasonores successifs puis est assignée à une couleur. Ce mode permet une visualisation directe des flux sanguins intracardiaques et intravasculaires, qui vient se superposer à l’image en échographie bidimensionnelle (mode B). La couleur varie en fonction du flux sanguin. Par convention, les flux positifs qui s’approchent du transducteur (correspondent à un décalage fréquentiel positif, fréquence centrale du signal reçu plus importante que celle du signal transmis) sont codés du rouge au blanc et les flux qui s’en éloignent (correspondent à un décalage fréquentiel négatif, fréquence centrale du signal reçu plus faible que celle du signal transmis) sont codés du bleu au blanc. Les flux turbulents apparaissent ainsi en «mosaïque», sous forme de multiple petits carrés juxtaposés de toutes les couleurs. La Figure 2.6 illustre ce codage en couleur des mouvements de fluide. Ainsi, une anomalie pourra être mise en évidence et ensuite analysée plus finement par le Doppler à codage continu ou le Doppler pulsé conventionnel. Ces différents modes Doppler sont implantés dans la plupart des appareils commerciaux conventionnels. 56 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS F IG . 2.6 – Illustration du Doppler couleur - système vasculaire thyroïdale chez l’Homme. Sonde L12-5 38 mm (Fréquence Doppler 6 MHz). Paramètres mesurés Les méthodes Doppler permettent d’estimer l’évolution temporelle de la distribution des vitesses dans le volume échantillon. Cette mesure met en évidence le caractère pulsatile ou constant du flux dans un vaisseau. A partir du profil de vitesse (Fig. 2.7), de nombreux paramètres sont déduits. Le temps d’accélération (TA), le temps de décélération (TD) et le temps de non éjection (TNE) peuvent être calculés. Ces paramètres sont généralement normalisés par le cycle cardiaque (CC). La fréquence cardiaque (F inverse de CC) et le temps d’éjection (TE) sont également déduits de cette mesure. Tous ces paramètres sont définis sur la Figure 2.7. Contrairement aux mesures des vitesses ces pa- ramètres ne sont pas influencés par l’angle d’insonification . La mesure de la vitesse san- guine dans les canaux oreillette-ventricule est particulièrement intéressante pour évaluer le remplissage des ventricules. Le rapport (E/A) est notamment utilisé comme index de la fonction diastolique où E représente la vitesse sanguine au début de la diastole pendant la relaxation du ventricule et A à la fin de la diastole pendant la contraction de l’oreillette. Ces paramètres sont représentés sur la Figure 2.7. 57 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER (a) (b) F IG . 2.7 – Paramètres hémodynamiques mesurés à partir d’un profil de vitesse. (a) Doppler pulsé : artère (vitesses négatives) et veine ombilicale (vitesses positives) d’un embryon de souris ED 14.5. Les réglages étaient les suivants : profondeur de l’échantillon Doppler 0.4 cm, échantillon Doppler 0.5 mm, fréquence Doppler 6 MHz, PRF 2500 Hz. Etude réalisée sur la plateforme ANIMAGE. (b) Doppler continu : pics de vitesse lors du remplissage d’un ventricule pour un embryon de souris à ED 10.5 (fréquence Doppler 43 MHz, d’autres détails peuvent-être trouvés dans [Aristizabal 98]). 58 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS 2.2.2 Applications à la souris et aux embryons de souris Applications à la souris Hartley et son équipe ont utilisé plusieurs sondes mono-élément (20 MHz et 10 MHz) en Doppler pulsé pour déterminer les vitesses sanguines de l’aorte ascendante chez des souris normales. Le pic de vitesse à la systole dans l’aorte et le temps d’accélération (TA) ont été mesurés pour évaluer la fonction cardiaque [Hartley 95]. Les pics de vitesse E et A ont également été mesurés par cette technique pour déterminer la fonction diastolique [Taffet 96]. La principale limitation de leurs travaux est que leurs systèmes ultrasonores n’étaient pas capable de fournir une image en mode B. Ce qui rend plus difficile la détection des vaisseaux. La position du transducteur était donc modifiée jusqu’à l’obtention d’un profil de vitesse supposé correct. A plus basse fréquence, 5-7.5 MHz dans [Hoit 95] et 9 MHz dans [Tanaka 96], les flux transmitraux E et A ont été évalués, fournissant des valeurs comparables à celles obtenues aux plus hautes fréquences. Avec un système possédant une sonde de 9 MHz, Pollick a, entre autre, imagé et quantifié la régurgitation aortique en utilisant le Doppler couleur [Pollick 95]. Plus récemment, à très haute fréquence (50 MHz) avec une sonde mono-élément, Goertz a démontré la faisabilité de détecter le flux sanguin dans des capillaires aussi petit que 15 et 20 [Goertz 00]. Quelques résultats quantitatifs, obtenus par ces équipes, par le biais des mesures Doppler sont résumés dans le Tableau 2.4 qui propose également une comparaison avec des mesures réalisées chez l’homme. TAB . 2.4 – Paramètres hémodynamiques de la souris et de l’homme. Valeurs issues de (a) [Thuroff 84] et [Leung 91], (b) [Hoit 95], (c) [Hartley 95], (d) [Taffet 96]. Ao : pic de vitesse dans l’aorte ascendante. Paramètres hémodynamiques Unité F Batt.min Ao cm.s Souris Humain 60-75 0.12 112 1 E/A ET sans % 59 Ratio - 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER Applications aux embryons et principaux résultats La première étude non-invasive a été réalisée par Gui en utilisant un transducteur Doppler en échocardiographie à 7.5 MHz, permettant la mesure des vitesses intracardiaques (vitesses du sang entrant et sortant des ventricules) des embryons de souris normaux et trisomiques in utero de ED 10 à ED 19 [Gui 96]. Keller a effectué la mesure de ces mêmes flux au niveau des ventricules en utilisant un transducteur à 20 MHz en Doppler pulsé [Keller 96]. Plus tard, la même équipe a réalisé la mesure des vitesses sanguines dans l’artère ombilicale de l’embryon de ED 10.5 à ED 16.5, permettant d’estimer le débit sanguin et la fréquence cardiaque des embryons pendant un fonctionnement cardiaque "normal" et anormal [MacLennan 99]. Contrairement au travaux de Gui, ces travaux sont invasifs car réalisés avec l’abdomen de la souris ouvert. Plus récemment, des mesures de la vitesse sanguine dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale ont été réalisées in vivo à 43 MHz [Phoon 00], donnant lieu à une proposition de modélisation du flux sanguin dans l’aorte [Phoon 02]. Les stades de gestation étudiés n’ont malheureusement pas été exactement les mêmes bien que tous s’intéressent à la mise en place du système cardiovasculaire. Le Tableau 2.5 permet toutefois de comparer quelques paramètres mesurés au cours de ces travaux à des âges de gestation équivalents (ED 10.5 et ED 13.5) selon les fréquences émises utilisées. On peut remarquer que la fréquence cardiaque varie énormément d’une étude à l’autre (90 à 100 ). Cela peut s’expliquer par les techniques utilisées (non-invasive versus invasive), par les souches étudiées et par l’embryon lui-même. On remarque également des différences importantes entre les vitesses mesurées qui pourraient ne pas seulement être dues aux raisons précédemment énumérées. Il apparaît que les pics de vitesse sanguines mesurées sont plus faibles lorsque la fréquence émise est faible à âge équivalent. Il est également intéressant de noter qu’à 7.5 MHz le pic de vitesse du remplissage passif des ventricules (E) n’a pas été détecté alors qu’à plus haute fréquence (43 MHz) celui-ci est loin d’être nul. Les différents systèmes de mesures Doppler utilisés peuvent donc être une autre source d’explication des différences observées sur les résultats obtenus. On peut constater que peu de mesures Doppler ont été réalisées sur les embryons de souris et que les travaux menés jusqu’à présent ont fourni des mesures sur des paramètres hémodynamiques différents. Peu de comparaisons peuvent donc être réalisées à ce jour. 60 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS TAB . 2.5 – Comparaison des paramètres hémodynamiques chez l’embryon de souris à ED10.5 et ED13.5 obtenus à différentes fréquences ultrasonores et dans les conditions précisées ci-dessous. Pics de vitesse dans l’artère et la veine ombilicale (ArO et VO), dans l’aorte dorsale (AoD) et d’éjection du sang par les ventricules (éjection). Pour E, A, CC, F , TA et TE se reporter au paragraphe 2.2.1. Tra : transmitraux. N pour les paramètres non mesurés. Référence Période de gestation Souche Type d’anesthésie EDs 10-19 (ED ) C57B1/6J pentobarbital in utero pentobarbital ex vivo pentobarbital+ in utero a : [Gui 96] Trisomy 16 b : [Keller 96] EDs 10.5-13.5 C3HeB C57B1/J6 ICR c : [MacLennan 99] EDs 10.5-16.5 ICR d : [Aristizabal 98] EDs 9.5-13.5 Swiss-Webster e : [Phoon 00] magnésium Doppler échocardiographie pulsé pulsé et continu Fréquence (MHz) ED ArO ( 7.5 10.5 ) 20 13.5 10.5 13.5 10.5 13.5 25 87 N N N N N N 12 37.5 N N N 50 137 N N 50 N 120 N TE/CC AoD N N N TE/CC ArO N N TE/CC Tra 0.35 TA AoD(ms) N TA ArO(ms) N E/A 0 VO ( ) AoD( ) E ) A ) éjection F ( ) N 0 N 212 262.5 N 0.37 0.46 N N 0.44 0.58 0.28 N N N N N N N 35 37.5 N N 46 41 N N 0.4 N N 61 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER 2.2.3 Mesures Doppler chez l’embryon de souris 129 L’objectif de cette étude est de dresser une base de référence de paramètres quantitatifs pour la souche de souris (129 ) que nous étudions à ANIMAGE. Pour cela nous avons choisi de mesurer les paramètres hémodynamiques définis précédemment. A la suite de plusieurs études de faisabilité pour déterminer les potentialités des machines ultrasonores conventionnelles équipées de sondes ultrasonores hautes fréquences et fournissant plusieurs modes d’imagerie, l’échographe ATL HDI5000 équipé de la sonde CL15-7 (7-15 MHz), a été choisi. Les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane pour faciliter les travaux et obtenir des résultats reproductibles (Tab. 1.5). Pour améliorer la qualité de l’image en mode B et faciliter la pénétration des ultrasons dans la souris, l’abdomen des souris était rasé. Pour assurer des mesures indépendantes 4 embryons par souris étaient sélectionnés à des endroits différents de la corne utérine (Fig. 2.8). Après repérage de l’aorte dorsale et de l’artère ombilicale, voir Fig. 1.11 pour situer ces vaisseaux, les paramètres hémodynamiques précédemment cités ont été mesurés. Afin d’obtenir une population d’embryon représentative, 12 embryons pour chaque âge de gestation entre ED 11.5 et ED 19.5 ont été étudiés. Un total de 108 embryons chez 15 souris a ainsi été étudié (une souris pouvait être étudiée pour un seul âge de gestation, afin d’obtenir le nombre d’embryon souhaité). F IG . 2.8 – Sélection de 4 embryons distincts. 62 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS Mesures des paramètres hémodynamiques dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale La visualisation en mode B seule ne peut pas convenir à l’imagerie des principaux vaisseaux sanguins. Par contre, ce type d’imagerie combinée avec le Doppler couleur permet de distinguer les principaux vaisseaux dont l’aorte dorsale et l’artère ombilicale (Fig. 2.9 (a)). L’affichage du profil des vitesses, réalisé en Doppler pulsé, était effectué avec la plus petite taille d’échantillon possible (0.5 mm) et un angle de mesure acceptable (inférieur à 60 ). La PRF était ajustée suivant les pics de vitesse dans les vaisseaux interrogés. Dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale, les paramètres hémodynamiques suivants étaient automatiquement mesurés par l’ATL HDI5000 : les vitesses maximales, le temps d’accélération TA et le temps de décélération TD (Fig. 2.9 (b)). Les fréquences cardiaques et le TNE ont été mesurés manuellement sur 3 cycles cardiaques consécutifs. Les mesures ont également été répétées deux fois dans chaque vaisseau. Résultats de nos mesures et comparaison avec les résultats d’autres équipes Contrairement aux études précédemment menées [Phoon 00, MacLennan 99, Keller 96], nous avons étudié l’ensemble de la période de gestation (période embryonnaire et fœtale), ED 19.5 correspondant au dernier jour de gestation de la souche 129 . Seul Gui a réalisé des mesures cardiaques tout au long de la gestation de la souris, cependant il n’a réalisé aucune mesure dans les principaux vaisseaux sanguins [Gui 96]. Les fréquences cardiaques mesurées variaient de la manière suivante, une augmentation de 155 à 188 battements par minute entre ED 11.5 et ED 13.5, puis une oscillation entre ED 13.5 et ED 16.5 entre 185 et 203 battements par minute et une augmentation jusqu’à ED 19.5 pour atteindre 295 battements par minute (Fig. 2.10 (a)). De plus, nos résultats montrent une certaine variabilité sur la mesure de la fréquence cardiaque, l’erreur quadratique moyennée sur la période étudiée étant égale à 31 battements par minute. La F est un paramètre susceptible de varier lors de l’étude de l’injection de l’hormone thyroïdienne. Nous pensons qu’en moyenne et pour un âge de gestation donné, la fréquence cardiaque peut-être pertinent pour évaluer une bradycardie ou tachycardie significative. Dans l’étude réalisée par [Gui 96], les fréquences cardiaques publiées étaient inférieures à nos valeurs. Une des causes de cette différence pourrait provenir du type d’anesthésie utilisé (pentobarbital dans son étude). Comparées aux études de Phoon et MacLennan réalisées sur une plus courte période, nos mesures sont intermédiaires, plus faibles que celles publiées dans [Phoon 00] et plus élevées que dans [MacLennan 99]. Ici encore les souches étudiées pourraient expliquer cette différence. Les expériences de MacLennan 63 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER (a) (b) F IG . 2.9 – Imagerie ultrasonore d’embryon de souris : (a) Image en mode B & Doppler couleur d’un embryon de souris à ED 14.5. (b) Image en mode B & Doppler couleur d’un embryon de souris à ED 14.5 et interrogation en Doppler pulsé de l’ombilicale. 64 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS (a) (b) F IG . 2.10 – Résultats des mesures de paramètres hémodynamiques à partir de mesures en Doppler pulsé (6 MHz, échantillon Doppler 0.5 mm). Les moyennes sont calculées sur 12 embryons pour chaque âge de gestation entre ED 11.5 et ED 19.5. L’erreur affichée correspond à l’écart type de la moyenne. (a) Evolution de la fréquence cardiaque. (b) Evolution des vitesses maximales mesurées dans l’aorte dorsale (AoD) et l’artère ombilicale (ArO). 65 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER (a) (b) F IG . 2.11 – Résultats des mesures de paramètres hémodynamiques à partir de mesures en Doppler pulsé (6 MHz, échantillon 0.5 mm). Les moyennes sont calculées sur 12 embryons pour chaque âge de gestation entre ED 11.5 et ED 19.5. L’erreur affichée correspond à l’écart type de la moyenne. Evolution des paramètres hémodynamiques : temps d’accélération (TA) et temps de décélération (TD), (a) dans l’artère ombilicale (ArO) et (b) dans l’aorte dorsale (AoD). 66 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS TAB . 2.6 – Paramètres hémodynamiques mesurés chez l’embryon de souris à ED10.5 et ED13.5 avec la sonde CL15-7. Pics de vitesse dans l’artère et la veine ombilicale (ArO) et dans l’aorte dorsale (AoD). Pour F , TE, CC et TA se reporter au paragraphe 2.2.1. Période de gestation Souche EDs 10.5-19.5 129 Type d’anesthésie isoflurane in vivo Doppler Fréquence (MHz) ED 6 10.5 13.5 N TE/CC AoD N 0.38 TE/CC ArO N TA AoD(ms) N TA ArO(ms) N ArO ( AoD ( F ( ) ) N ) N 0.38 19.5 0.53 0.88 sont très invasives et peuvent donc également expliquer la différence observée. Les vitesses sanguines que nous avons mesurées dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale (Fig. 2.10 (b)) variaient de la même façon que la fréquence cardiaque. Les vitesses mesurées dans l’aorte dorsale étaient toujours plus élevées que dans l’artère ombilicale sur la période étudiée. Dans l’artère ombilicale (ArO), le TD normalisé par le cycle cardiaque variait très peu entre ED 11.5 et ED 16.5, puis augmentait de manière importante entre ED 16.5 et ED 19.5. Le TA variait très peu tout le long de la période étudiée (Fig. 2.11 (a)). Dans l’aorte dorsale (AoD), les variations du TD et du TA étaient similaires à celles observées dans l’ArO. Cependant, l’augmentation du TD entre ED 16.5 et ED 19.5 était moins marqué (Fig. 2.11 (b)). Quantitativement, nous pouvons remarquer que les valeurs prises par le TA et le TD diffèrent selon le vaisseau étudié, surtout à partir de ED 16.5. La comparaison de ces résultats (Tableau 2.6) avec ceux précédemment obtenus (Tableau 2.5), dans des conditions expérimentales similaires [Phoon 00], montre que les vitesses maximales obtenues dans l’artère ombilicale et dorsale et à âge équivalent sont légèrement supérieures à celles obtenues à plus hautes fréquences. Les différences peuvent s’expliquer par la souche de souris étudiée et le type d’anesthésie utilisé. Le TA et TD 67 2.2. MESURES QUANTITATIVES EN MODE DOPPLER dans l’aorte et l’ombilicale n’avaient été étudiés qu’entre ED 9.5 et ED 14.5 et ne montraient aucune variation entre ces âges [Phoon 00]. Nos mesures montrent que le TD dans l’artère ombilicale augmente de façon importante après ED 16.5. Ce résultat suggère que cette importante augmentation du TD est liée à un flux diastolique. Il est très intéressant de noter que ce flux diastolique a été également observé dans le cas des fœtus humain entre la 11 et 16 semaine [Wladimoroff 92]. Discussion et perspectives Dès ED 11.5 et jusqu’à ED 19.5, les paramètres hémodynamiques ont été mesurés dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale. Selon la littérature, le sang commence à circuler dès ED 8.5. Comme nous l’avons vu au chapitre 1, le cœur à cet âge de gestation est un tube et les cavités cardiaques ne sont pas encore séparées mais il maintient une circulation sanguine. Les mesures avant ED 11.5 n’ont pas été réalisables. La résolution spatiale est à l’origine de cette limitation. La gamme de fréquence utilisée (7-15 MHz) devient alors trop faible pour procurer une image en Doppler couleur permettant de distinguer les vaisseaux nettement. La mesure des paramètres hémodynamiques en Doppler pulsé dans l’aorte dorsale et l’artère ombilicale devient alors très difficile. Cependant des mesures en Doppler pulsé sont possibles à ED 9.5 et elles ont permis de détecter les battements cardiaques de l’embryon en plaçant le volume échantillon dans la région du cœur. La machine conventionnelle utilisée dans cette étude (ATL HDI5000) permet à l’utilisateur de placer l’échantillon Doppler dans une large zone de l’image en mode B contrairement aux VS40. En effet sur cette machine ultrasonore haute fréquence le positionnement de l’échantillon Doppler n’est pas facilement réalisé. Dans le cas du VS40, les vaisseaux de l’embryon doivent donc être placés à une distance fixée par la sonde, ce qui peut rendre l’examen plus compliqué. Cependant l’utilisation des hautes fréquences en Doppler pulsé permet de mesurer des vitesses sanguines à des endroits très précis tel qu’à la sortie des ventricules et dès ED 9.5. La connaissance des valeurs moyennes d’un ou plusieurs paramètres hémodynamiques à un âge de gestation donné pourraient contribuer au développement d’une aide à l’identification des vaisseaux sanguins. La valeur moyenne de la fréquence cardiaque pourrait par exemple convenir pour la période entre les EDs 11.5 et 13.5 puis entre les EDs 16.5 et 19.5 tout comme les vitesses sanguines dans l’aorte dorsale ou l’artère ombilicale. Pour la mesure des vitesses sanguines et des autres paramètres (TA, TD, TNE) entre ED 68 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS 8.5 et 11.5, l’utilisation de plus hautes fréquences est inévitable pour deux raisons. D’une part, l’imagerie en mode B aux fréquences (7- 15 MHz) ne permet pas de discerner les vaisseaux à ces âges de gestation et les structures cardiaques au cours de la gestation, et d’autre part les vitesses sanguines sont plus faibles, il devient alors plus difficile de les mesurer. 2.3 Mesures quantitatives en visualisation 3D 2.3.1 Acquisition et visualisation 3D Autant pour l’homme que pour la souris, l’acquisition d’un volume 3D de données ultrasonores peut apporter une meilleure compréhension de l’anatomie des organes mais également une quantification plus précise des paramètres mesurés. Le moyen le plus simple d’acquérir des données 3D est de déplacer mécaniquement la sonde. Des capteurs de position électromagnétiques, optiques ou acoustiques permettent maintenant de déplacer librement la sonde à travers le volume de tissu. Toutefois, l’acquisition n’est que la première étape pour réaliser des mesures en 3D. Il est nécessaire de réduire le speckle, d’interpoler entre les coupes 2D, de sélectionner les organes d’intérêts et d’appliquer des méthodes de segmentation afin de réaliser des mesures fiables sur la région d’intérêt. Une fois ces traitements réalisés, il sera alors possible d’analyser in vivo l’évolution de certaines maladies ou le développement des organes grâce à la mesure de paramètres volumiques. Dans un premier temps les travaux issus de la littérature sont présentés et dans un second temps nos premiers résultats obtenus sur la visualisation 3D d’un embryon de souris in vivo sont donnés. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à la quantification du volume occupé par l’embryon dans la corne utérine. 69 2.3. MESURES QUANTITATIVES EN VISUALISATION 3D 2.3.2 Applications à la souris et aux embryons de souris Applications à la souris La littérature fait état de quelques travaux qui ont proposé une visualisation 3D chez la souris. Turnbull a réalisé à très haute fréquence (40 MHz) la visualisation 3D et la quantification d’une tumeur provoquée par injection de cellules cancéreuses chez la souris adulte (tumeur superficielle) [Turnbull 96]. Cette étude est parmi les premières à étudier la progression d’une tumeur in vivo au moyen des ultrasons. La segmentation du volume était réalisée manuellement sur des coupes 2D juxtaposées pour former le volume 3D. Cependant, la quantification du volume 3D des tumeurs n’a pas été comparée à une estimation histologique. Selon l’auteur, des erreurs non négligeables sont dues aux mouvements respiratoires de la souris. L’auteur suggère une acquisition des signaux synchronisée avec la respiration de la souris. Par la suite Kruse et Foster se sont intéressés à la mesure des vitesses sanguines à très haute fréquence (50 MHz), dans les vaisseaux de petites tailles, de l’ordre de dans [Kruse 97] et de l’ordre de dans [Foster 00a]. Ils ont fourni une cartographie couleur 3D de la vascularisation de tumeurs préalablement injectées chez la souris. Enfin la reconstruction 3D du VG de la souris a été réalisée en utilisant la même technique que Turnbull par juxtaposition des coupes 2D. Ces images ont été obtenues avec la sonde 15L8, 13 MHz, Acuson et la reconstruction 3D a été validée par la corrélation des débits cardiaque et sanguin calculés avec les valeurs mesurées au moyen d’un fluxmètre implanté directement dans l’aorte [Scherrer-Crosbie 99]. 70 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS F IG . 2.12 – F- Imagerie 2D à 40 MHz du cerveau de l’embryon de souris dans l’utérus à abdomen ouvert et après injection d’un produit de contraste. Les flèches montrent la présence de l’agent de contraste dans les ventricules du cerveau après son injection. H- Visualisation 3D de l’agent de contraste dans les cavités du cerveau d’un embryon de souris à ED 10.5 (h :hindbrain, m :midbrain et f :forebrain). Le rectangle blanc correspond à 500 [Turnbull 99]. Applications aux embryons de souris Comme précédemment, la quantification en 3D appliquée aux embryons de souris n’a été que très peu développée. L’équipe de Turnbull a réalisé la visualisation 3D d’une partie du cerveau d’un embryon de souris à ED 10.5 par injection d’un produit de contraste [Turnbull 99]. Par ailleurs, cette injection était guidée par les US et a été réalisée in utero, l’abdomen de la souris étant ouvert pour permettre à l’expérimentateur d’exposer directement la corne utérine aux ultrasons (voir le schéma expérimental de la Figure 2.4 (b)). Le produit de contraste était composé de micro-bulles de diamètres compris entre 0.1 et 5 . La visualisation 3D, illustrée sur la Figure 2.12, a été réalisée avec le logiciel Voxel- view et a permis de déterminer la distribution du produit de contraste dans le cerveau. Une approximation du volume réel du cerveau a été déterminée par cette technique. 71 2.3. MESURES QUANTITATIVES EN VISUALISATION 3D 2.3.3 Quantification 3D de l’embryon de souris à ED 14.5 L’objectif de cette étude est de réaliser des mesures en 3D à partir d’images ultrasonores. A la suite de résultats satisfaisants de nos méthodes d’acquisition et de segmentation, obtenus sur fantôme, nous avons appliqué ces méthodes in vivo à la quantification 3D de l’embryon de souris. Pour l’obtention d’un volume de données 3D in vivo, nous avons utilisé l’échographe ATL HDI 5000, équipé de la sonde linéaire CL15-7 (7-15 MHz). La sonde était déplacée à vitesse constante perpendiculairement au plan de coupe de l’image échographique. Un modèle déformable 3D a ensuite été utilisé pour segmenter les données. Après convergence de ce modèle déformable vers les données, des paramètres quantitatifs 3D sont déduits [Vray 02]. Méthodes d’acquisition et de segmentation Acquisition des images ultrasonores in vivo En vue de la segmentation, des embryons de souris à ED 14.5 ont été choisis pour cette étude. A cet âge de gestation, l’embryon est à un stade de développement avancé et les images ultrasonores en mode B, obtenues à des fréquences de 7 à 15 MHz, permettaient de visualiser 3 principaux tissus dans la corne utérine de la souris : l’embryon de souris, le placenta et le liquide amniotique (Figure 2.13 b). Pour l’embryon de souris in vivo, l’acquisition s’effectuait après anesthésie de la souris dont les conditions physiologiques étaient maintenues constantes par une table de thermorégulation (Fig. 2.13 a). Pour faciliter la pénétration des ultrasons, l’abdomen de la souris était rasé et un gel ultrasonore était appliqué entre la sonde et l’abdomen. Ce gel permettait également de faciliter le déplacement automatique de la sonde. Ce déplacement était assuré mécaniquement par le moteur pas à pas HSI (XC 460, Hayden Switches & Instruments, Oméga Dynamic) (Fig. 2.13). Les réglages étaient ceux définis par défaut par l’option "TSI" (superficial imaging tissue) de l’ATL. La profondeur d’exploration était fixée à 1.4 mm et une focale à 5 mm était sélectionnée. Les images étaient enregistrées sans interruption au moyen du "ciné loop" de l’échographe. Cette procédure permettait d’enregistrer les images ultrasonores successives. Le temps d’acquisition et la course de la sonde nous permettaient de déduire la distance entre les images ultrasonores. Suivant la position de l’embryon dans la corne utérine ces paramètres pouvaient changer. La séquence d’images sélectionnée en vue de la segmentation de l’embryon était composée de 536 images pour une course totale de nombre de pixels de ces images étaient de 256 la sonde de 13.4 mm. Les images 2D acquises étaient de 2.56 cm 72 1.4 cm. La taille en 160 pixels. Ainsi, les dimensions d’un CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS a b F IG . 2.13 – a- Photographie du banc d’acquisition d’images ultrasonores. A : Appareil d’anesthésie. T : plaque de thermorégulation. M : Moteur HSI. b- Image ultrasonore en mode B de l’embryon de souris à ED 14.5 obtenue avec la sonde CL15-7 de l’ATL HDI5000.P : placenta, E : embryon, LA : liquide amniotique, A : abdomen de la souris et artefacts. pixel d’une image correspondaient à 100 en latéral et à 90 tance entre les coupes était de 25 . en profondeur. La dis- Méthodes de segmentation des données Un modèle déformable élastique 3D développé à Creatis a été adapté pour la segmentation automatique de l’embryon de souris dans les volumes de données [Pham 02]. Ce modèle déformable est une combinaison : – d’un modèle à priori topologique et géométrique de l’objet à segmenter. Dans notre cas, un ellipsoïde 3D a été choisi. – d’une équation définissant le comportement du modèle soumis à des forces externes issues du volume à segmenter. Ces forces appliquées aux interfaces déforment le modèle pour le faire coïncider avec les zones de fort gradient de l’image. L’équilibre du modèle est obtenu par la minimisation de l’énergie de la fonctionnelle globale suivante (Equation 2.3). # # # (2.3) où, # représente l’énergie interne de déformation élastique de l’ellipsoïde et # représente l’énergie externe issue des données à segmenter. 73 2.3. MESURES QUANTITATIVES EN VISUALISATION 3D Terme d’énergie interne L’objet (ellipsoïde) est considéré comme un matériau linéaire, élastique et isotrope. Son énergie élastique peut alors être exprimée par : où # (2.4) et sont respectivement les vecteurs de contrainte et de déformation 3D, sur le do- maine définissant l’objet. Terme d’énergie externe L’ellipsoïde est soumis à un champ de force surfacique t. L’énergie externe est donnée par le travail de ces forces au cours du déplacement : # t (2.5) où est le bord du domaine . Le champ de force dérive d’une fonction de potentiel V (t=-grad(V)), calculée à partir de carte de contours. Un champ de force particulier appelé GVF, gradient vector flow ([Xu 98]) a été également utilisé et a fourni de bons résultats. La segmentation est obtenue par la minimisation de l’énergie globale E qui repose sur une discrétisation par éléments finis de [Zienkiewicz 89]. Le volume de l’objet a été ainsi décomposé en éléments tétraèdriques à l’aide du logiciel GHS3D (INRIA). Ce processus de segmentation requière une phase d’initialisation qui consiste à positionner le modèle déformable 3D (ellipsoïde) dans le volume de données ultrasonores. Ce prépositionnement est ici effectué manuellement. Résultats de la segmentation et perspectives Une fois la segmentation du volume des données ultrasonores réalisée, des mesures peuvent être faites sur le modèle ainsi déformé et plusieurs plans de coupes peuvent être visualisés (Figs. 2.14). Les plans de coupe permettent de conclure que la poche embryonnaire, embryon baignant dans le liquide amniotique, a été segmentée (Figs. 2.14 (a)-(c)). Ainsi, la taille de l’embryon in vivo à ED 14.5 a été estimée à 11.4 mm pour la longueur et 6 mm pour la largeur. Seuls des résultats histologiques sont disponibles dans la littérature, à ED 14.5 la taille de l’embryon est estimée entre 9 et 10 mm dans sa longueur et entre 3 et 6 mm dans sa largeur (http ://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/Diagrams/). A l’âge de gestation suivant, la longueur de l’embryon est estimé à 12 mm et sa largeur à 8 mm. Par 74 CHAPITRE 2. IMAGERIE QUANTITATIVE DE LA SOURIS ADULTE ET GESTANTE EN ULTRASONS (a) (b) (c) (d) F IG . 2.14 – Visualisation du résultat de la convergence du modèle 3D déformable sur un embryon de souris à ED 14.5 : (a) coupe 2D correspondant au plan d’acquisition, (b) coupe 2D perpendiculaire au plan d’acquisition, (c) coupe 2D (Mode C) perpendiculaire aux 2 coupes précédentes et (d) visualisation 3D. comparaison à ces données, la segmentation donne donc des résultats conformes. Le volume estimé de la poche embryonnaire à ED 14.5 était égal à . Il est intéressant de noter que dans cette étude la segmentation visait le volume occupé par l’embryon. Au vu des images ultrasonores et de la robustesse de l’algorithme utilisé, il semblerait que d’autres tissus tel que le placenta pourraient également être segmentés. Le placenta est le lieu de nombreux échanges entre la mère et le fœtus et des changements de volume de ce tissu pourraient survenir au cours d’un développement anormal de l’embryon. 75 2.4. CONCLUSION 2.4 Conclusion Ce chapitre a permis de dresser l’état de l’art des travaux réalisés chez la souris adulte et gestante en US, et de présenter la contribution des études réalisées au cours de mes travaux de recherche. Il met en évidence les limitations en terme de fréquence des sondes ultrasonores et donc des systèmes ultrasonores pouvant convenir à l’imagerie ultrasonore quantitative du suivi du développement de l’embryon de souris. L’état de l’art montre qu’en dessous de 12-15 MHz et en mode B, seuls des travaux sur la souris adulte ont été réalisés et ont permis la mesure de paramètres anatomiques. A des fréquences comprises entre 5 et 7.5 MHz et en combinant les modes B et Doppler (couleur et pulsé) les flux sanguins chez la souris adulte ont pu être étudiés. A 7.5 MHz, en mode B et Doppler, quelques paramètres de la fonction cardiaque de l’embryon de souris ont été étudiés. A 40 MHz, en mode B et Doppler pulsé, le développement du système cardiaque de l’embryon de souris a été étudié sur une période réduite de la gestation. Nos mesures réalisées sur embryons de souris par l’utilisation de plusieurs modes d’imagerie, dans la bande de fréquence 7-15 MHz, démontrent les potentialités de ces fréquences pour le suivi du système cardiovasculaire de l’embryon de souris. Pour l’objectif que nous nous sommes fixé, les mesures acquises en Doppler pulsé sur la souche 129 pourront servir de données de référence pour étudier les effets de l’hormone thy- roïdienne chez l’embryon de souris génétiquement modifié. Les résultats de notre étude, notamment l’apparition d’un flux diastolique à la fin de la gestation, suggèrent également que des maladies vasculaires, génétiques ou non, survenant au cours de la période fœtale chez l’humain, pourraient également être étudiées chez la souris à ces fréquences. La visualisation 3D en US est à ce jour très peu développée. Les mesures quantitatives en 3D sont en conséquence difficile à obtenir. Nous avons proposé des résultats préliminaires de quantification de taille et de volume à partir de données ultrasonores 3D acquises in vivo sur embryon de souris. La méthode de segmentation basée sur modèle déformable a montré la faisabilité de cette approche. Le suivi du volume de l’embryon pourrait permettre d’évaluer le développement normal ou pathologique de l’embryon de souris. Une diminution de volume d’un embryon pouvant-être assimilée à un développement anormal ou à la mort précoce de l’embryon de souris. Toutefois, les limites de la quantification 3D basées sur la segmentation par un modèle déformable en terme d’âge de gestation restent à définir. 76 Chapter 3 Backscattering by blood in the mouse embryo: goals and experimental determination The work presented in the two next chapters is the result of a scientific collaboration with Pr. F.S. Foster and E. Chérin, Associate Researcher, during my thesis work conducted at the Sunnybrook and Women’s College Health Sciences Centre (SWCHSC) in Toronto. A part of this study was also realized at the Mount Sinai Hospital in collaboration with C. Kolb, Master student, and Doctor L. Adamson. The EURODOC grant from the Région Rhône-Alpes and funding from the SWCHSC made this work possible. In this Chapter, the goals for studying the backscattering by blood at high frequency in the mouse embryo are presented as well as the methodologies used to calculate the backscatter coefficient. In the first part, blood and blood formation are presented as well as a theoretical definition of the backscattering by blood. These definitions introduce the factors that are known to influence the backscattering by blood. In the second part, the experimental set-up used for the imagery of the mouse embryos over time is described. In the third part, the methodologies developed for the calculation of the apparent backscatter coefficient and its experimental determination are presented. This work was presented at the IEEE International Ultrasonics Symposium 2001 [Le Floc’h 01]. 77 3.1. BLOOD AND BACKSCATTERING BY BLOOD 3.1 Blood and backscattering by blood Context and goals The echogenecity of blood has been studied on large species ever since the first attempt initiated by Reid on human blood [Reid 69]. Many studies have been undertaken [Yuan 88a, Yuan 88b, Cloutier 95] since then, to better understand the ultrasound scattering properties of blood. However, these studies were mostly performed at low frequencies, 2 MHz and up to 10 MHz, were mainly performed on red blood cells (RBCs) suspension and, most of the time, they were performed in vitro using mock flow loops. Very few experimental studies have been performed on whole blood and at higher frequencies. Foster and Van Der Heinden have studied the backscattering by human whole blood between 30 to 70 MHz [Foster 94, Van Der Heiden 95] and only De Kroon has studied the backscattering by blood at 30 MHz in vivo in the human iliac artery [De Kroon 91]. There is therefore a lack of ultrasound data to understand the mechanism of backscattering by blood at higher frequencies than 10 MHz. This work presents backscattered signals from blood at very high frequency collected in vivo in mice. High frequency ultrasound images of the embryonic cardiac chambers have been performed in [Srinivasan 98] at 40 MHz. It was mentioned that embryonic blood was very bright at EDs lower than ED 14.5. Moreover, it was observed that at lower frequencies, in adult mice and in juveniles, blood echogenicity was very low (dark on ultrasound images). During the gestation of the mouse, blood forms and the morphology of red blood cells changes. We therefore hypothesized that blood echogenicity is related to gestational age and the developmental changes of the red blood cells. The objective of this work is therefore to quantify changes in backscatter of embryonic blood with gestational age in vivo in mice. The high frequency ultrasound prototype, known as UBM (Ultrasound Bio-Microscopy), was used in this study. Because of its range resolution, this scanner allows detailed imaging of the mouse embryo. The study of the backscattering by blood at high frequency non-invasively and in vivo in mice was undertaken. In this study, we focused on changes in backscattering by blood within the embryonic mouse heart between EDs 12.5 and 17.5. During this time range, the formation of RBCs or hematopoiesis in mice is at a particular stage called erythropoiesis. 78 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Table 3.1: Comparison of blood analysis in mice and in human. Values from (a)[Barbee 92] and (b) [Russell 66]. Haematology Adult Mice Blood Volume (ml/kg) 80 Hematocrit (%) Density of RBCs ( RBCs’ diameter ( ) RBCs volume ( ) ) Human Ratio 60-70 0.8 42.5-50.6 45 1 4-5 5 1 5-6 7-8 1.4 50 90 1.8 3.1.1 Blood and erythropoiesis Blood Blood consists of erythrocytes, or red blood cells, leukocytes, or white blood cells, and platelets suspended in plasma. Plasma is a saline solution containing mainly three proteins: fibrinogen, globulin, and albumin. The white cells are the largest in size, but they account for only 0.8% of the blood volume, while platelets account for about 0.2%. The red blood cells are by far the main population of the cellular component of blood (9798%). Therefore, it is reasonable to assume that the interaction of ultrasound with blood is determined by the scattering of red cells. Table 3.1 summarizes haematological parameters for human and adult mice when the blood is fully formed. Note that the usual ratio of approximately 10 between mice and human, deduced from the Table 1.2 in Chapter 1 in term of linear dimension, no longer holds and that those values are similar or in the order of 2. For example, the hematocrit in mice is as high as in humans, the size in diameter of the RBCs in adult mice are somewhat smaller than in humans (Table 3.1). Erythropoiesis In the human foetus as well as in mouse embryos, the blood, and other tissues, forms progressively. In this study we measured backscattering by blood between EDs 12.5 and 17.5. During this period, RBCs go through erythropoiesis. The following is a precise description of this phenomenon. Erythropoiesis is the development of mature red blood cells (erythrocytes) and is illustrated in Figure 3.1. Like all blood cells, erythroid cells begin as pluripotential stem cells. The first cell that is recognizable is the proerythroblast (diameter of 28 , [Russell 66]). As development progresses, the nucleus becomes somewhat smaller and the cytoplasm 79 3.1. BLOOD AND BACKSCATTERING BY BLOOD becomes more basophilic, due to the presence of ribosomes. In this stage the cell is called a basophilic erythroblast. The cell will continue to become smaller throughout development. As the cell begins to produce hemoglobin, the cytoplasm attracts both basic and eosin stains, and is called a polychromatophilic erythroblast (diameter of 18 ). The cytoplasm eventually becomes more eosinophilic, and the cell is called an orthochromatic erythroblast. This orthochromatic erythroblast will then extrude its nucleus and enter the circulation as a reticulocyte (diameter of 14 ). Reticulocytes are so named because these cells contain reticular networks of polyribosomes. As reticulocytes loose their polyribosomes they become mature red blood cells. In mice, changes in nuclear material of the primitive RBCs proved to start between EDs 13 and 14 (page 358 [Russell 66]). Figure 3.1: Schematic of the erythropoiesis (development of RBCs) from http://www.graphicpulse.com/medill/wblood.html. 3.1.2 Ultrasound scattering by blood To better understand the ultrasound scattering by blood, two theoretical methods have been developed, the particle approach [Brody 74] and the continuous [Angelsen 80] one. In this study, the particle approach was chosen to introduce the factors that are known to influence the backscatter coefficient from blood. The following is a theoretical definition of this coefficient based on the particle approach. The measurements, that have been performed in this study, will allow an estimation of the backscatter coefficient. 80 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Backscatter coefficient of one particle The backscattering from one particle corresponds to the scattering cross section which is the power scattered by one spherical scatterer per solid angle per unit incident intensity. It is an important parameter characterizing ultrasonic signal backscattered by a single scatterer. For weak scatterers1 and for arbitrary shape [Lucas 87], the scattering crosssection at an angle is given by the Equation 3.1: (3.1) 2 , where k is the wave number, is the volume scatterer, and are respectively the density and the compressibility of the medium (subscript 0) and of the scatterer (subscript e). From the Equations 3.1 and introducing as the radius of the scatterer assumed to be a sphere, 3 cases are defined in [Shung 93] as following: 2 , which represents the Rayleigh regime; 2 , which represents the non-Rayleigh regime; 2 , which represents the case when the diameter is one tenth the wave length. By definition, the Rayleigh regime means that the backscattering cross-section is proportional to the fourth power of the incident wave frequency scatterer volume and to the square of the . In contrast, the non-Rayleigh regime shows that the backscatter co- efficient depends on the geometry of the scatterer. In the case of blood (RBCs), as well as in theory, the Rayleigh scattering regime can be applied for frequencies up to 30 MHz because the diameter of RBCs are much smaller than the acoustical wavelength in human and in adult mice (see Table 3.1). At 40 MHz, assuming the speed of sound is 1540 m.s the wavelength is 38.5 in the medium of propagation, and is greater than the size of RBCs (diameter) in adult mice. Acoustically and by simple consideration, the Rayleigh conditions may not hold in the case of adult mice since Rayleigh scattering implies that the dimension (diameter) of the scatterers in the direction of propagation of the ultrasonic waves is less than one tenth of the wavelength [Shung 93]. Note: For a scatterer radius much larger than the wavelength, exact solutions of the backscatter coefficient can be found in [Morse 87, Insana 93]. 1 Weak scatterer means scatterer with density and compressibility that only differ slightly from the sur- rounding medium. In the case of mature RBCs, the surrounding medium is plasma. 81 3.1. BLOOD AND BACKSCATTERING BY BLOOD Backscatter coefficient of several identical scatterers The modeling of the backscatter coefficient found in the literature ([Twersky 87, Berger 91, Mo 92, Shung 93, Lim 99, Fontaine 99]) do not perfectly match the experimental and in vivo results obtained by various groups studying the backscatter coefficient of blood. However, the works of the different researchers introduce the factors which influence this coefficient and its trends. The backscatter coefficient of a random distribution of small identical particles is defined as the sum of the contribution of each particle, i.e., the Born approximation. This definition is valid in the case of weak scatterers and at low concentration. In the case of blood, a hematocrit2 at 6% is considered to be a low concentration. However, for dense concentration and in the case of whole blood, the correlation between particles must be taken into consideration. The backscatter coefficient of blood is therefore also a function of the scatterer spatial arrangement and is defined as the average backscattered power per steradian from a unit volume of blood, insonified by a plane wave unit intensity [Shung 93]. To take into account the number of RBCs in the medium insonified and their correlation, a function named structure factor was introduced by Twersky in the particle model [Twersky 87]. Following the structure factor, packing factor, which is the low-frequency limit of the structure factor, was introduced by Berger and Mo [Berger 91, Mo 92]. This factor is proportional to the variance of the local scatterer concentration and also takes into consideration the shape of the scatterers Equation 3.3. Finally, the backscatter coefficient of blood can be modeled by Equation 3.2. - , (3.2) where is the backscatter cross-section defined in Equation 3.1, H is the hematocrit, V is the average volume of scatterers, and W is the packing factor. !' , (3.3) ) where is related to the shape and correlation among scatterers and represents the variance in the particle size. 2 The hematocrit is the volume occupied by the RBCs in a given volume. Acoustically the hematocrit corresponds to the volume occupied by the RBCs in the volume insonified by the ultrasound beam. 82 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION 3.1.3 Factors influencing the backscatter coefficient Given Equation 3.2, the factors that can influence the backscatter coefficient are the ultrasound frequency, the hematocrit, the size and shape of the scatterers, and the intrinsic properties of the blood. The possible effects of all those factors on the backscatter coefficient values are briefly described in the following paragraphs. Ultrasound frequency The backscattering by porcine RBCs in suspension has been shown to follow a Rayleigh regime in the range of 5 to 90 MHz, that is an ultrasound frequency dependence of the backscatter coefficient close to the fourth power [Kuo 94, Maruvada 02]. Based on the limit of the Rayleigh regime suggested in [Shung 93] and because of the size of porcine RBCs, i.e. 2,5 , these results are surprising at frequencies higher than 40 MHz ( ). In the case of porcine and human whole blood, which is more similar to the in vivo case, and in the range of 7 to 70 MHz, the backscatter coefficient was shown to exhibit a lower dependence in frequency than the fourth power [Yuan 88b, Foster 94, Van Der Heiden 95]. Hematocrit The hematocrit represents the percentage of the volume occupied by the RBCs in a given volume. The dependence of the ultrasound scattering on hematocrit has been studied for many years. A non-linear relationship has been observed and is not yet fully understood. The influence of the hematocrit on the backscatter coefficient has been studied in the 5 to 30 MHz frequency range, at hematocrit (HCT) from 6% [Kuo 94] to 30 % [Wang 97], and in the 30 to 90 MHz at hematocrit ranging from 6% to 30% [Maruvada 02]. Briefly, these studies showed that, for porcine red blood cells in saline suspension, the backscatter coefficient was reaching a maximum between 10% HCT and 15% HCT, and then decreased with increasing hematocrit (Figure 5 and, Figures 8 and 9 respectively in [Wang 97] and [Maruvada 02]). Shung et al. found the backscattering coefficient from RBCs, suspended in saline solution under steady laminar flow, to peak at a HCT of about 13%. However, the peak was shifted to a HCT of 25% for whole blood, with small variation in the range 14-34%. A plateau in the Doppler power was observed for HCT higher than 13% in whole blood. This plateau was more pronounced under low shear rates [Shung 92]. Turbulent flow not only increases the backscattered power, but also shifts the backscattered power maximum to 20% HCT for erythrocytes in saline so83 3.2. EXPERIMENTAL SET-UP DESCRIPTION FOR MOUSE IMAGING lution [Shung 92]. As stated in the introduction, little work has been performed under the realistic pulsatile flow conditions. Cloutier showed that the HCT dependence of the Doppler power was similar to what was observed under steady flow conditions. The Doppler power maximum was found to be a function of the flow cycle position. At early systole this maximum was found to be about 13%, at peak systole it was about 17%, and at early diastole it was found to be about 22% [Cloutier 93]. Size and shape of the scatterers The size and shape of the scatterers are also factors that can influence the backscatter coefficient as soon as the wavelength is of the order of the scatterers’ size (diameter). Based on the Equation 3.1, the scattering cross-section depends on the square of the volume of the individual scatterer, and based on Equation 3.2, the backscatter coefficient of several particles depends on the volume of the scatterer (individual RBCs or aggregate). It is now stated that the volume of the scatterer and the packing factor cannot be seen separately and that the backscatter coefficient is directly related to the volume of the scatterer weighted by the packing factor [Cloutier 97]. Intrinsic properties of the blood The influence of the proteins (fibrinogen) within the blood have been shown to increase the backscatter coefficient when their concentration was increased in the frequency range of 7 to 30 MHz [Yuan 88b] and [Van Der Heiden 95]. 3.2 Experimental set-up description for mouse imaging 3.2.1 A high frequency ultrasound scanner For the requirements of this study, a US scanner prototype, an oscilloscope, and a computer were used and are described in the next paragraphs. Presentation of the ultrasound scanner A new prototype of a US scanner, originally known under the name of UBM (Ultrasound BioMicroscopy), was used in this study. It is a high frequency scanner, with 3-D scan head micro-positioning, controlled by software on a Windows NT multiprocessor PC platform. The scanner produces 2D images of 8*8 mm (512*512 pixels) at a maximum frame rate 84 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION (a) Figure 3.2: (a)-Illustration of (b) the Ultrasound scanner (Toronto, Canada, http://www.visualsonics.com), (b) a broadband SMA 40 MHz transducer. of 8 images per second and with a frequency range from 19 MHz to 55 MHz (Figure 3.2 (a)). Additional technical specifications are shown in Table 3.2 and other details can be found in [Foster 02]. The system was also equipped with an RF output allowing the acquisition of RF signals by 8-bit digital oscilloscope. Note: At the time of the experiments, this scanner was in development and has been recently commercialized by VisualSonics company as the VS40. Transducer characteristics For this study, the prototype was equipped with a broadband SMA 40 MHz transducer shown in Figure 3.2 (b). This probe is based on the polymer ferroelectric polyvinylidene fluoride (PVDF). It has a diameter of 3 and its focus is at 6 . The main quality of the transducers made in PVDF is its large bandwidth. The frequency of the transmitted electric pulse can be modified (see Table 3.2). For the experiments of this study, two transmitted pulses were used: 19 MHz and 40 MHz. 85 3.2. EXPERIMENTAL SET-UP DESCRIPTION FOR MOUSE IMAGING Table 3.2: Specification of the VS40 scanner. At the time of the experiments the VS40 was a prototype and some of the specifications were different and/or not available. Feature Specification B-scan frequency 19, 25, 40, 55 MHz Frame rate 2,4,8 Hz Line spacing Analog-to-digital conversion 125 MHz, 12 bits Micropositioning x,y,z Doppler mode pulsed Doppler frequency 20-55 MHz Pulse repetition frequency Maximum unaliased velocity at 1-20 kHz 37.5 cm.s 1 mm.s Minimum velocity Transfer functions of the ultrasound scanner To characterize the frequency response of the system and allow the calculation of the backscatter coefficient in a phantom, the signals backscattered from a perfect reflector positioned at the focal zone were digitized and Fourier transformed. Figures 3.3 represent the transfer functions in amplitude of the apparatus with a pulse respectively at 19 MHz and 40 MHz. The central frequency of the acoustic pulses were measured around 28 MHz and 35 MHz at the focus of the transducer. The peak amplitude of the 40 MHz transmitted pulses is stronger than the peak amplitude of the 19 MHz transmitted pulses. The frequency bandwidth (-6dB) is 19.5 MHz at 19 MHz and 26 MHz at 40 MHz. 86 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION 8 14 x 10 95 (27.83; 90.90) 90 Amplitude (dB) Amplitude (mV) (27.83; 1.23E09) 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 (15.14; 85.01) 80 75 70 65 60 55 5 45 (34.67; 85.12) 85 10 15 20 25 30 35 Frequency (MHz) Frequency (MHz) (a) (b) 40 45 8 18 x 10 95 (35.16; 92.07) (35.16; 1.61E09) 90 Amplitude (dB) Amplitude (mV) 16 14 12 10 8 6 4 (24.90; 86.05) (50.78; 86.10) 85 80 75 70 2 0 10 20 30 40 50 60 65 10 70 20 30 40 50 Frequency (MHz) Frequency (MHz) (c) (d) 60 70 Figure 3.3: Calculated power spectra of the system response in mV (a) and (b) in dB for the 19 MHz transmitted pulses and for the 40 MHz transmitted pulses (c) and (d).These power spectra were calculated selecting signals reflected by a plan reflector positioned at the focal distance in a window of 256 samples. 87 3.2. EXPERIMENTAL SET-UP DESCRIPTION FOR MOUSE IMAGING 3.2.2 Mice studied and apparatus of anaesthesia The strain The mice used in this study were female and male CD1 mice purchased from Charles River in Canada. These mice were chosen because, first of all, they are normal mice and thus provide reference data. These mice are also very prolific and inexpensive to house. For this study, six pregnant mice were used between 4 to 5 months old. This age corresponds to adult mice and is required for these experiments (see Table 1.2 in Chapter 1). Timed pregnancies were determined by vaginal plug observation, with midday time of plug observation counted as embryonic day ED 0.5. Apparatus of anaesthesia and ECG monitoring For these experiments, pregnant mice were anaesthetized with a mixed of enflurane (same family as isoflurane) and oxygen for reasons discussed in the first chapter in 1.2.3. The apparatus of anesthesia is composed with a mixing tank, a bottle of oxygen and connecting tubes. Before starting the experiments, the mice were rapidly anesthetised in a tank (Figure 3.4 (a)). They were then positioned on the mouse pad in supine position (Figure 3.4 (b)) and were kept anesthetized inhaling an appropriate mix of enflurane and oxygen (The marker of the recipient containing the enflurane was between 1.5 and 2 during the experiments). As explained in the first chapter 1.2.3, the physiology of the mice must be continuously monitored. For this requirement, the Indus Instruments THM100 was used (http://www.indusinstruments.com/Products/THM100/THM100.html). This mouse pad allows to electronically control a heating element while simultaneously monitoring temperature and ECG activity. Blood analyser For the purpose of this study, the analysis was performed on embryonic mouse blood using a haematology analyser (model AT Diff, Beckman Coulter, Mississauga). These experiments were undertaken at the Mount Sinai hospital using a method described later in this chapter. A microscope was used to facilitate the collection of blood from mouse embryos. Microsurgical equipment (cannula, forceps) and ice bath illustrated in Figure 3.5 were also used. 88 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION (a) (b) Figure 3.4: a- Mixing enflurane and oxygen. b- An anaesthetised mouse during experimentations. (a) (b) Figure 3.5: (a) Microsurgical equipments. (b) Uterus corn in Phosphate Buffered Saline solution surrounded by ice. Examples of visible anatomical details Organs of the mouse embryo The images that are presented in Figure 3.6 give a precise idea of the organs that can be imaged by this scanner. Mouse embryos could be imaged as early as ED 6.5. Vital bodies in the mouse embryos were also imaged as soon as ED 12.5. For more details, refer to the caption of Figure 3.6. 89 3.2. EXPERIMENTAL SET-UP DESCRIPTION FOR MOUSE IMAGING (a) (b) (c) (d) Figure 3.6: (a)- E represents the embryo’s body at ED 6.5 (40 MHz). (b)- This Figure corresponds to several images combined in one image representing a longitudinal view of an embryo at ED 12.5. From left to right, S represents the mouse skin, NC represents the neural canal, L represents the liver, V the ventricles, B the brain, and T the tail. (c)- This is the combination of two images, the first part of the final image corresponds to the first 4 mm in depth of the image acquired with a pulse at 55 MHz and the second part, the other 4 mm, with a pulse at 19 MHz, K shows the kidneys. (d) Eyes (E) and fingers of one paw (P) of an embryo at ED 15.5 (40MHz). Images of M.Y. Zhang’s. 90 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Figure 3.7: A. Images of the anatomy of the mouse embryo in vivo at ED 13.5 and 19 MHz on the left. B. The same embryo at 40 MHz on the right. Primitive right ventricle (RV), left ventricle (LV), right atrium (RA) and left atrium (LA). Amniotic liquid (AL), spinal column (SC), mouse skin (MS). Embryonic mouse heart Since the biggest organ where blood circulates is the heart, high frequency ultrasound images of the embryonic mouse heart were performed from embryonic day (ED) 12.5 to ED 17.5. A typical in vivo, B-scan image at 19 MHz and at 40 MHz of a mouse embryo heart obtained at ED 13.5 is shown in Figure 3.7. These images demonstrate how the anatomy of the heart chambers can be visualized with the ultrasound scanner for the 19 MHz and 40 MHz transmitted pulses. In the figure on the left, the shaved mouse skin (MS) is visible on the right top of the image, as well the spinal column (SC). The embryo is inside the uterus, surrounded with amniotic liquid (AL). Part of the placenta (P) is also imaged and in the centre the 4 cavities of the heart chambers which are the primitive right ventricle (RV), left ventricle (LV), right atrium (RA) and left atrium (LA) are visible. In figure on the right, the same mouse embryo is pictured when imaged at 40 MHz. The cavities of the heart are also visible. 91 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT 3.3 Experimental methodologies for the calculation of the backscatter coefficient 3.3.1 Experimental methodologies to estimate the backscatter coefficient To correctly estimate the backscatter coefficient of soft tissues by means of RF signals, the effects of the ultrasound scanner (the electromechanical transfer functions of the system and diffraction effects) must be removed from the signals. Diffraction effects are mainly caused by the geometry of the transducer and are known to affect the brightness of the ultrasound images acting as a low-pass filter [Fink 84], especially when using a focused transducer. The following is a short summary of the main methods found in already published works. Sigelmann and Reid [Sigelmann 73] proposed a substitution method in which the backscattered power from a scattering volume, located in the farfield zone of an unfocused transducer, is compared to the power received by the same transducer, as the scattering volume is replaced by a perfect reflector. This method was used to measure the backscatter coefficient of blood [Shung 76, Shung 84]. In this method, the tissue to characterize and the flat reflector are positioned in the far field of the transducer under the same experimental conditions. The signals backscattered from the tissue to characterize are then gated, Fourier Transformed, and then divided by the calculated Fourier Transform of the gated signals backscattered by the flat reflector. The duration of the windows used for this normalisation is the same. The calculation of the echo from the flat reflector is done assuming that the transducer acts as a point source emanating energy confined in a cone. This substitution method is known as the standard substitution method. This method was shown to be inappropriate when using focused transducers because errors result from using the mirror theory to calculate the reflected wave from a planar reflector [Yuan 86]. Yuan and Shung showed that the calculated values of backscattering coefficients from RBC suspension at low hematocrit, obtained with nonfocused transducers at 5, 7.5 and 10 MHz, were always lower than those obtained with focused transducers at equivalent frequencies when the standard substitution method was used for backscattering measurements [Yuan 86]. This discrepancy was shown to be caused by the complicated beam behavior of the focused transducer. They concluded that focused transducers yield misleading results when a standard substitution method is used for absolute backscattering measurements [Yuan 86]. 92 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Other methods, based on the use of a reference scattering medium instead of a perfect flat reflector, have been proposed in order to estimate the backscatter coefficient with focused transducers [Hall 89, Yao 90, Insana 94, Wang 97]. Except in [Wang 97], where the authors have demonstrated experimentally that these corrections can be done using red blood cells suspensions at low hematocrit, they all use a phantom as a reference. In the case of the phantom, these methods are highly computing intensive because of the calculation of the backscatter coefficient of the reference phantom that must be known in order to estimate accurately the backscatter coefficient of the tissue of interest. Roberjot et al. [Roberjot 96] addressed to this issue in measuring the backscatter coefficient of the reference phantom. They validated their approach over a very broad range frequency, from 2 to 60 MHz, using three transducers with different focusing characteristics, and taking into consideration the ultrasonic beam characteristics whereas [Wang 97] validated their method in the frequency range 5 to 30 MHz making an approximation of the ultrasonic beam. Roberjot and colleagues demonstrated that system-dependent effects, that are, the electromechanical transfer functions of the system and the diffraction effects, were well removed. In our experiment, we used a phantom as a reference scattering medium and we adapted the method from Roberjot. We also compared the standard method (taking into consideration the correction for the volume insonified by the ultrasonic beam) with the adapted method. Experimental formulation of the backscatter coefficient Experimentally and in the case of the chosen method, the backscatter coefficient of a phantom, considered homogeneous and isotropic [Roberjot 96], can be estimated within the focal zone by the Equation (3.4) and is expressed in "" 2 * : (3.4) " is the spatially averaged power spectra of the signals backscattered from the subsurface layer of the phantom, positioned at the focus of the transducer. " is the power spectra of the signal, reflected from a quartz plate located perpenwhere dicularly in the focal plane to the ultrasonic beam. The second term, on the right hand side, compensates for the frequency dependence of the volume insonified. This term is a function of the transducer radius a, the focal distance F, the reflection coefficient at the * surface of the quartz [Kino 87], the wave number k, and the thickness d of a subsurface layer of the phantom (see Figure 3.8). The thickness d is related to the duration 93 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT of the signal selected for the calculation of " and to the speed of sound in the phantom. This compensating factor is valid only within the focal zone and assumes that the directivity of the transducer in the focal plane is very close to a Gaussian profile ([Ueda 85]). The apparent backscatter coefficient In vivo, the tissue of interest, located at a distance z from the surface of the transducer, is usually surrounded by other tissues. These tissues influence the propagation of the ultrasound wave, and in this case, the backscatter coefficient & is expressed as: (3.5) is the apparent backscatter coefficient in the tissue and corresponds to the effect of the attenuation characterized by . In our experiment, we calculated where the apparent backscatter coefficient from the measurements. We therefore assumed that the attenuation was constant, in other words, that its possible variations would not significantly modified our results. is estimated dividing the averaged power spectrum of the signals backscattered from the tissue by the spatially averaged power spectrum of the signals backscattered from the phantom at equivalent positions. This calculation leads to Equation (3.6), which relates the apparent backscatter coefficient in the tissue to the backscatter coefficient and the spatially averaged power spectra corrected for the electromechanical transfer functions of the system and for the diffraction effects . , (3.6) where is defined in Equation (3.4) and is the ratio of power spectra in the phantom of the signals acquired from a volume located at the same distance z in the tissue and in the phantom. This ratio corrects the diffraction effects and the effects associated with the duration of the windowed signals used for this calculation. This last term is given according to Equation (3.7). where , (3.7) is the spatially averaged power spectrum of the RF signals backscat- tered from the subsurface layer of the reference phantom and is the spatially averaged power spectrum of the RF signals backscattered from the tissue to be characterized. 94 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Finally, combining (3.4), (3.6) and (3.7), the experimental apparent backscatter coefficient is expressed in Equation (3.8): & "" 2 * (3.8) Introducing the following term, * - & " " 2 / " 1 , (3.9) Equation (3.8) becomes, - Thus, - (3.10) can be seen as a correction factor of the diffraction effects and the elec- tromechanical transfer function of the system. Note that depends on the frequency f and on the depth z. The depth corresponds to the distance between the surface of the transducer and the location of the measurements. In other words, it corresponds to the distance of propagation of the ultrasonic wave in the insonified medium. When the standard method is used, the correction factor - is simplified and the av eraged power spectra from tissue is divided by the power spectra of the quartz at the focus and multiplied by the factor compensating for the frequency dependence of the insonified volume. The apparent integrated backscatter coefficient The apparent integrated backscatter coefficient (AIB) is deduced in integrating the Equation (3.8) over a frequency bandwidth [ , ] and is given by the Equation (3.11). The frequency bandwidth over which the (3.11) is integrated can be defined using the properties of the backscattered signals from the given tissue. However, it can also be the frequency bandwidth of the transducer. 95 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT 3.3.2 Experimental development Acquisition technique The estimation of the backscatter coefficient in the phantom requires the calculation and " as explained in the previous paragraphs. To calculate , the phantom is insonified under normal incidence and RF signals are stored of during the three directional displacement of the transducer (see Figure 3.8). The RF signals used for the calculation are windowed just under the interface water-phantom. As a result, the specular echo of the interface water-phantom is not taken into consideration. To obtain RF signals at different depth z, the transducer is moved in the z-axis direction. The spatial averaging is obtained by moving the probe in the plane (x,y). In our case, this plane was (1071 independent RF lines were acquired by plane). Furthermore, for each location of the transducer, several pulses are emitted into the medium to improve the signal to noise ratio. In our case, 16 pulses were sent. Thus, for each position of the probe on the z-axis, a set of RF signals were acquired. Note that in using this procedure, attenuation in phantom is superfluous since all measurements are performed in a window just under the interface water-phantom. This also means that the attenuation between the interface water-phantom and the windowed signals in the phantom is ignored. " , changing the phantom by a plane re- The same technique is used to calculate flector and positioning it within the focal zone of the transducer. The spatial averaging is not necessary in this case because the scatterers are not randomly distributed as in the case of a phantom. Figure 3.8: Principle of RF acquisition technique for the calculation of and " (in place of the phantom a perfect reflector is positioned at the focal distance F). Measurements are performed for different positions z, by step of the phantom and for for the quartz, during the transducer displacement from the FF to the NF (NF:near field, FF:far field). 96 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Experiment requirements and results For our experiments, the phantom used as a reference scattering medium was made up of silica particles embedded in a Gelatin based matrix and bigger particles than the wavelength (see Figure 3.9). The densities of these scatterers of different sizes were not known and were not necessary for our goal. For its production, the recipe can be found in [Ryan 97]3 . The blood within the embryonic heart chambers was the tissue to characterize and was located within the focal region. The method and experiments require that: Figure 3.9: Phantom used as a reference scattering medium ( silica particles and bigger particles). 1. the windowed RF signals correspond to signals backscattered from blood, 2. the distance from the transducer to the blood and from the transducer to the subsurface layer of the reference phantom is identical, 3. the calculation of the backscatter coefficient in the phantom is computed from measurements performed within the focal zone. The directivity of the transducer in the focal zone must be close to a Gaussian profile, 4. the power spectra of the selected signals backscattered from the subsurface layer and from the blood are spatially averaged and statistically independent. 5. the duration of the windows used for the calculation of the apparent backscatter coefficient in the case of in vivo data and in the case of the phantom experiment are identical. 3 and obviously the help of experienced people in the laboratory is necessary to properly handle formalde- hyde ! 97 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT 180 ) 140 167 166.5 Amplitude (cm ) 160 Amplitude (cm 120 100 80 60 40 166 165.5 165 164.5 164 20 163.5 0 0 10 20 30 40 50 163 15 60 20 25 30 35 40 Frequency (MHz) Frequency (MHz) a b 45 Figure 3.10: Factor compensating for the frequency dependence of the volume insonified at the focus of the transducer. To satisfy the first requirement, further modifications of the software controlling the motion of the transducer were performed and an M-Mode visualisation of the stored signals was developed. This latter development is explained in Chapter 4. To satisfy the second requirement, only the signals backscattered from the phantom within the focal region are taken into account. Given the acquisition technique, RF signals were processed in order to detect the set of data corresponding to the focal zone. This was performed by detection of the set given the maximum averaged amplitude. The third requirement is valid in the focal plan of a focused transducer for , with a the radius of the focused trans- ducer, as shown in [Ueda 85]. Given the dimensions of the transducer and its frequency range, the range of values of are from ( ( ) to ). The values of the second term of Equation 3.4 are plotted in Figure 3.10 (a) in the frequency range 0 to 60 MHz. They range from 163,35 cm to 166,75 cm in the frequency range 16 to 42 MHz as shown in Figure 3.10 (b). Given the experimental procedure, the fourth requirement is obtained for the calculation of . In the case of the in vivo experiment and according to the dimensions of the heart and the motion of the embryo as well as that of its mother, the transducer is fixed at one position and only signals backscattered from a window covering the focal region are selected. We therefore assume that the spatial averaging is created by the physiological condition, that is, flowing conditions within the heart chambers. 98 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Thus Equation (3.10) can be written as follow: and the correction factor, - & * & - 2 / " 1 (3.12) " " , (3.13) This last expression was calculated taking into consideration the fifth requirement, that is, the duration of the windows for the calculation of the averaged power spectra ( , " and and of the factor compensating for the frequency dependence of the volume insonified. The effect of the size of this window is studied in Chapter 4. Backscatter coefficient in the phantom In the case of our study, the estimation of the frequency dependence of the backscatter coefficient was performed within the focal region for two different transmitted pulses. In order to verify that the calculation of the backscatter coefficient at the two transmitted pulses was performed correctly, was plotted for 3 different depths, one in the near field (NF), one in the focal zone, and one in the far field (FF). The curves are plotted in Figure 3.11 (a), (b) which shows that for the 19 MHz transmitted pulses (Fig. (a)) the curves are similar in the frequency range [10 MHz, 25 MHz] and the one at the focus becomes higher in amplitude than the others. For the 40 MHz transmitted pulses, however, the curve calculated at the focal distance is always higher than the two others from 25 MHz to 42 MHz (Fig. (b)). These observations might be related to the compensating factor (Eq. 3.4) which is only valid at the focus of the transducer. In Figure 3.11 (c), the backscatter coefficient calculated for the 19 and the 40 MHz transmitted pulses at the focal distance and fit curves, are plotted in the frequency range [16 MHz, 42 MHz]. This frequency band is the one of interest as it is shown in Chapter 4 (4.3). The dependence in frequency is 3,37 for the 19 MHz transmitted pulses and is 2,23 for the 40 MHz transmitted pulses. These powers are both lower than the expected fourth power. This is due to the fact that bigger scatterers than 10 were present in the phantom. The fact that the slope is lower for the 40 MHz transmitted pulses is difficult to explain. It might be due to a lower signal to noise ratio. 99 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT In the coincident frequency range [21 MHz, 35 MHz], there is not an exact overlapping of the two curves. In the NF and the FF this difference is much more pronounced. The observed difference in Figure 3.11 (c) may be explained by: the signals to noise ratio. As the same 40 MHz broadband transducer was used for the two ultrasound pulses, the observed difference might be due to a smaller signal to noise ratio for the 19 MHz transmitted pulses than for the 40 MHz transmitted pulses in this frequency bandwidth. The changes in speed of sound due to changes in temperature. During the experiments at 19 and 40 MHz, no changes in temperature were observed. However, as both experiments were not performed the same day, the temperature of the water bath may have changed. It is possible that a change of 2 C occurred. Correction factor - are illustrated in Figures 3.12 at the two ultrasound pulses and were calculated using gated signals of 256 samples (approximately ). The interpretation of these figures is described in the caption. On the left hand side, - is The correction factors plotted for each ultrasound pulse and its variation is given for different depths and frequencies. The profiles used for each ultrasound pulse to correct the signals backscattered by blood are plotted in dashed line on the right hand side of the Figure 3.12. The frequency bandwidth over which these profiles are plotted corresponds to the frequency bandwidth of the averaged power spectra of the signals backscattered from blood (see Chapter 4 4.3). The two dashed lines are decreasing from the beginning of the given frequency bandwidth of each ultrasound pulse, i.e., 16 MHz for the 19 MHz transmitted pulses and 21 MHz for the 40 MHz transmitted pulses, to the frequency corresponding to the central frequency of each transmitted pulses, i.e., 28 MHz and 35 MHz respectively. They are then increasing to the other extremity of the frequency bandwidth of interest, i.e., 35 MHz and 42 MHz respectively. For the 19 MHz transmitted pulses, C(f,z) varied between -60,5 dB and -67 dB and for the 40 MHz transmitted pulses varied between -60,5 dB and -68,5 dB. The strongest variation (dashed lines) of the correction factors is in the high frequencies range [28 MHz,35 MHz] of the given frequency bandwidth for the 19 MHz transmitted pulses whereas it is in the lower frequencies range for the 40 MHz transmitted pulses [21 MHz, 35 MHz]. The curves in solid line correspond to the correction factor C(f,F) calculated in the phantom at the focus and correspond experimentally to the correction applied by the standard 100 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION Backscatter coefficient (Sr .cm ) −3 3 −3 x 10 3.5 2.5 3 2 2.5 1.5 2 1 x 10 1.5 ur(f) ur(f) NF u (f) FF 0.5 ur(f) ur(f) NF u (f) FF 1 r 0 10 15 20 25 30 r 35 0.5 20 25 30 35 Frequency (MHz) Frequency (MHz) (a) (b) 40 Backscatter coefficient (Sr .cm ) Frequency (MHz) Figure 3.11: (c) is calculated using a window of 256 samples. This window corre- sponds to the one selected just after the interface water-phantom. green = near field (NF) ( from the focal), blue = focal zone and red = far field (FF) ( cal). (a) Backscatter coefficient from the fo- corresponding to these 3 depths with a pulse at 19 MHz. (b) Backscatter coefficient corresponding to these 3 depths with a pulse at 40 MHz. (c) The frequency dependence of the backscatter coefficient in the phantom between 16 MHz and 42 MHz at the focus of the transducer for the 19 and 40 MHz transmitted pulses. Errors represent 1 standard deviation and were calculated taking into account 5 experi- ments. Fitted curves and parameters are also plotted. 101 45 3.3. EXPERIMENTAL METHODOLOGIES FOR THE CALCULATION OF THE BACKSCATTER COEFFICIENT method (correction by a plan reflector positioned at the focus of the transducer and taking into consideration the compensating factor for the insonified volume, see Equation 3.9). The correction factors calculated using the signals reflected by the quartz are plotted for each transmitted pulse with crosses and overlapped perfectly the curve with solid line as it was expected. The curves in dashed line correspond to the correction factor C(f,z) used in the adapted method. Apparent backscatter coefficient The apparent integrated backscatter coefficient of blood is expressed in Equation (3.14). and are determined taking into account the frequency bandwidth at -6 dB of the signals backscattered by blood within the focal region. (3.14) The determination of the frequency limit and the results of the calculation of the apparent and integrated apparent backscatter coefficient are discussed in Chapter 4. 102 CHAPTER 3. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: GOALS AND EXPERIMENTAL DETERMINATION ) Distances around the focus ( −60 −600 −58 C(f,F) standart method (Phantom) C(f,F) standart method (Quartz) C(f,z) Adapted Method −61 −62 −400 −60 −63 −200 −62 −64 0 −65 −64 200 −66 400 −66 −67 −68 600 −68 20 25 −69 15 30 Frequency (MHz) 20 25 30 35 Frequency (MHz) ) Distances around the focus ( −60 −600 −58 C(f,F) standart method (Phantom) C(f,F) standart method (Quartz) C(f,z) Adapted Method −61 −62 −400 −60 −63 −200 −62 0 −64 −65 −64 −66 200 −66 400 −67 −68 −68 −69 600 25 30 35 −70 20 40 Frequency (MHz) 25 30 35 40 Frequency (MHz) Figure 3.12: These figures represent the term C(f,z). On the left hand side, this term is plotted at 700 around the focus of the transducer (Y-axis) and in the frequency range [16MHz, 35MHz](X-axis) for the 19 MHz transmitted pulses and [21MHz, 42MHz] for the 40 MHz transmitted pulses. For each transmitted pulses, 3 profiles (Y constant, corresponding to the focal distance) of C(f,z) are given on the right hand side. Two of these profiles correspond to C(f,F): these profiles can be calculated using both the signals backscattered from the quartz located at the focus (crosses) or the signals backscattered from the subsurface layer of the phantom corresponding to the focal distance (blue line curves). This correction factor C(f,F) corresponds to the one used in the standard method. The third curve C(f,z) corresponds to the one used in the adapted method (blue and dashed lines). 103 45 3.4. CONCLUSION 3.4 Conclusion The factors that are known to influence the backscattering by blood have been introduced in order to better understand the variations of the backscatter coefficient. As reviewed in this Chapter, radio-frequency signals backscattered from tissues must be corrected for the electromechanical transfer functions and for diffraction effects when estimating the backscatter coefficient. Two methods presented in this Chapter will be used to estimate the apparent backscatter coefficient from blood in vivo in the following Chapter. First, the adapted method, i.e. the correction factor C(f,z) calculated at the distance where the signals backscattered from blood were coming from (within the focal region of the transducer). Second, the standard method, i.e. in our case the correction factor at the focus (C(f,F) Phantom experiment in Figs. 3.12). 104 Chapter 4 Backscattering by blood in the mouse embryo: quantification of changes in backscattering within the heart chambers during gestation In this chapter, the changes in backscattering by blood within the embryonic mouse heart are examined for two transmitted pulses, 19 MHz and 40 MHz, and between EDs 12.5 and 17.5. In the first part, the method to collect blood samples on mouse embryos and the blood analysis results are presented. In the second part, the protocol for imaging the embryonic mouse heart in order to calculate the apparent backscatter coefficient in vivo is given. In the third part, an analysis of the power spectra of the signals backscattered from blood is performed. In the fourth part, the results of the methods employed for the calculation of the apparent integrated backscatter coefficient from blood are presented and discussed. 105 4.1. PROTOCOL FOR OBTAINING BLOOD SAMPLES AND HAEMATOLOGY 4.1 Protocol for obtaining blood samples and haematology In order to correlate the behaviour of the integrated apparent backscatter coefficient with the morphological changes of the blood during erythropoiesis, blood samples were collected. These blood samples were performed on mice of the same strain as the one imaged. 4.1.1 Blood samples of mouse embryo The method used to collect blood from mouse embryos has been adapted from a procedure described in [Smith 00]. A short description of this procedure is as follows. The uterus was taken out from the mouse and immersed in cold Phosphate Buffered Saline (PBS) surrounded with ice to keep the temperature at approximately 0 C (see Figure 3.5 (b) in Chapter 3). In cold PBS, the uterus was cut between embryos then each segment was placed in a Petri dish under a heating lamp. To reach the umbilical cord, the uterine muscle wall, the yolk sac and amniotic membranes were cut under a surgical microscope. Warm PBS (40 C), in a syringe, was applied to warm the embryo until pulsations due to heart beats were detectable in the umbilical artery. After applying a drop of a 10 % phosphate buffered formalin to prevent vasoconstriction, a small cut was made in the umbilical artery using dissecting scissors lightly rounded at the tips (see Figure 3.5 (a) in Chapter 3). Blood was withdrawn into a cannula connected to a syringe while the embryonic mouse heart was still beating (see Figure 4.1). Drops of the collected blood were used to make smears for observation under a microscope at 40x magnification. The diameters of the immature RBCs were measured at different stages of gestation using a calibrated microscope and a software (AxioPlan2, Zeiss, Göttingen, Germany). Finally, the hematocrit and the mean cell volume were estimated using a haematology analyser (model AT Diff, Beckman Coulter, Mississauga) when enough blood was pooled from several embryos at a given ED. 4.1.2 Analysis of the blood samples In Figure 4.2, the pictures illustrate the blood smears at ED 13.5 (a), ED 15.5 (b), ED 17.5 (c) and in adult mice (d). In the blood smears obtained at ED 13.5, ED 15.5 and ED 17.5 two types of immature RBCs could be observed: nucleated RBCs and nonnucleated RBCs. The number of nucleated RBCs decreased as the age increased, from 26 % of nucleated RBCs of the population observable at ED 13.5, down to 6 % at ED 15.5, 106 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Figure 4.1: Illustration of the blood withdrawn into a cannula from an embryo at ED 17.5 . (a) (b) (c) (d) age (control group data provided by C. Kolb)(d) magnification Figure 4.2: Blood smears at ED 13.5 (a), at ED 15.5 (b), at ED 17.5 (c) 107 60. 40 and at adult 4.1. PROTOCOL FOR OBTAINING BLOOD SAMPLES AND HAEMATOLOGY Figure 4.3: Diameters of nucleated RBCs and their nuclei at ED 13.5, at ED 15.5 and at SEM where the sample size equals 24 cells at ED 13.5, 6 ED 17.5. Graph shows mean cells at ED 15.5 and 3 cells at ED 17.5. and 2 % at ED 17.5. The diameters of the immature nucleated RBCs and of the nuclei seemed to also decrease with age. They were 10.85 and 9.81 1.67 0.59 at ED 15.5, and 6.70 0.70 nucleus decreased from 3.88 2.21 in diameter at ED 13.5 at ED 17.5. The diameter of the at ED 13.5 to 1.81 0.33 at ED 17.5. These results are also summarized in Figure 4.3. The nucleated RBCs appeared larger than the enucleated RBCs at ED 13.5 and ED 15.5. In adult mice, there are no nucleated RBCs. The results obtained using the Coulter are summarized in Table 4.1. An example of the blood analyser results is given in Annex B. Table 4.1: Mean Cell Volume (MCV), Hematocrit (HCT) and RBC count averaged over 3 calculations performed by the Coulter Analyser. Mean ED 13.5 MCV (fL) HCT (%) - 15.5 RBC (count /mm ) - 122,37 1,21 34 1 108 SEM are presented. 17.5 111,64 37 0,35 1 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION 4.2 Protocol for imaging the embryonic mouse heart As it was mentioned in Chapter 3, the heart is the largest organ of the mouse embryo where blood circulates and can be imaged. The follow is the protocol used to image the embryonic mouse heart, and to acquire radio-frequency signals backscattered by blood (taking into consideration the requirements defined in Chapter 3). 4.2.1 Mouse embryo imaging The mouse embryos were imaged daily. 2D images were obtained while mice were anaesthetised using the equipment described in 3.2.1 in Chapter 3. To allow a better penetration of the ultrasound into the mouse, its abdomen was shaved with a hair remover cream. This region was kept clear of hair during the time of the experiment to facilitate the penetration of the ultrasound into the mouse body and for a better signal to noise ratio. An appropriate delay and gain (23 dB) was used on the ultrasound scanner to optimize the quality of the B-scan images within the focal region. These settings were unchanged for all the experiments. The mouse body temperature was maintained at - using the monitor- ing device previously described in 3.2.1 in Chapter 3. The preparation of the mouse was performed under a heating lamp. Two ultrasound gels of different viscosity were used as a coupling medium between the shaved mouse abdomen and the transducer. They were heated to - before application to the mouse skin and maintained at this temperature using a warmer. The most viscous gel (Aquasonic clear, Parker Laboratories) was used to delineate the region of interest on the abdomen (see Fig. 4.4) and to maintain the less viscous gel (Ecogel 100, Parker Laboratories) over this region. The less viscous gel was used for its efficiency in avoiding air bubbles. The abdomen of the mouse was scanned to locate the position of the embryos in the uterus. After detection of the embryonic mouse heart in B-scan images, the scan head of the ultrasound system and the mouse pad were adjusted to position the heart in the focal zone of the transducer. These adjustments were mostly dependent on the position of the embryos inside the uterus. The relative distance between the surface of the transducer and the heart chambers was kept constant. 109 4.2. PROTOCOL FOR IMAGING THE EMBRYONIC MOUSE HEART Figure 4.4: Application of the viscous heated gel on the shaved mouse skin. 4.2.2 B-scan images of the embryonic mouse heart Using the procedure described above, images of the embryonic mouse heart were obtained from ED 12.5 to ED 17.5. Panels of B-scan images obtained for the 19 and 40 MHz transmitted pulses are shown in Figures 4.5 and 4.6. The cavities of the heart chambers were visible but their boundaries were not clearly defined on B-scan images because of the very similar backscattering by blood and by surrounding tissus at these high frequencies. At both frequencies, it can be observed that the backscattering by blood varies with the age of gestation. The echogenicity in the heart chambers seemed to increase between ED 12.5 and ED 13.5, and seemed to decrease between ED 13.5 and ED 17.5 (arrows on images of Figures 4.5 and 4.6). To ensure that the selected signals used corresponded to the signals backscattered from blood, the M mode images were displayed and the backscattered blood signals were gated. This procedure is detailed in the next paragraph. 110 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Figure 4.5: B-mode images of mouse embryos with a pulse at 19 MHz and from ED 12.5 on the top left to ED 17.5 on the bottom. Note the decreasing intensity of the gray level within the heart chambers (arrows). Scale bar corresponds to 1 mm. 111 4.2. PROTOCOL FOR IMAGING THE EMBRYONIC MOUSE HEART Figure 4.6: B-mode images of the same mouse embryos as in Figure 4.5 with a pulse at 40 MHz from ED 12.5 to ED 17.5. Note the decreasing intensity of the gray level within the heart chambers (arrows). Scale bar corresponds to 1 mm. 112 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Figure 4.7: Protocole imaging summary: 19 MHz B-Scan images and calculated M-Mode (zoomed) at ED 13.5. Smallest scale increments (left of the images) = 100 . 4.2.3 M-mode imaging After the embryonic mouse heart was located within the focal zone in B mode, the transducer was automatically stopped over the heart chambers and 100 RF signals were acquired at the same location, at a PRF of 50 Hz. This PRF allowed to store several heart cycles (see Table 2.5 in Chapter 2). The length of the windowed signals was mm assuming a speed of sound of 1540 m.s ) and a delay of (3.85 was selected on the oscilloscope, allowing to collect RF data from the region of interest (i.e. heart chambers). The vertical white line, labeled 19 MHz and ED 13.5 in Figure 4.7, represents the approximate location from which the signals were collected. Signals were digitized at a sampling frequency of 500 MHz by the oscilloscope and transferred to a PC for data processing. During this storage procedure, B-scan images were not available on the screen of the ultrasound scanner. The position of the heart chambers were then checked again after this procedure. The set of data was stored on the computer when the blood within the heart chambers was at the focus of the transducer. The envelopes of the 100 collected signals were calculated, logarithmically compressed and used to create an M-mode image. In our study, this display allowed to distinguish blood from heart’s walls as shown in Fig. 4.8. It also allowed to verify again the position of the region of interest (i.e. blood). The set of data was stored on the computer when the blood within the heart chambers was at the focus of the transducer. Finally, it permitted to determine the sample size of the window for calculations. 113 4.2. PROTOCOL FOR IMAGING THE EMBRYONIC MOUSE HEART Table 4.2: Measurements of cardiac dimensions of two embryos in . RVD, RVS: right ventricle during diastole and systole. LVD, LVS: Left ventricle during diastole and systole noted D and S on Fig. 4.8 (ED 15.5, 19 and 40 MHz); IS: Interventricular septum; PP: Posterior wall. cardiac dimensions RVD RVS LVD(D) LVS(S) IS PP Embryo 1 1 0.4 0.9 0.6 0.3 0.3 Embryo 2 1 0.5 1 0.6 0.5 0.5 Cardiac dimensions in M mode images As shown in Chapter 2, no measurement has been performed on the embryonic mouse heart because of the lack of resolution of the conventional ultrasound scanners. Although this was not the purpose of this study, we showed that the use of higher frequencies should permit the measurements of usual cardiac parameters (Figs. 4.8). However, this was not performed systematically on every embryo in this study. Cardiac dimensions that were estimated from some embryos allowed us to choose the size of the gated window (see Table 4.2). At ED 12.5 and 13.5, it was not easy to see as much as at ED 15.5, but blood and main structures (heart walls and interventricular septum) could be differentiated. A trade-off was then made between the sample size to ensure that only blood was selected and that the signal to noise ratio was the best possible for calculations. The size of the gated signals used to select the signals backscattered from blood on each of the 100 RF lines was chosen to be around 400 (256 samples), since at ED 12.5 the size of the ventricles was about 500 (assuming a speed of sound of 1540 ). The white boxes in Figures 4.8 represent the windowed RF signals used to estimate the apparent integrated backscatter coefficient (AIB) of the blood. For the purpose of studying the AIB before ED 12.5, the influence of the size of the window was also investigated. The calculations were then carried out using windows of 256 samples and 128 samples, i.e. approximately 400 (0,5 ) and 200 respectively. A total of 73 AIB measurements were performed on 73 embryos from 6 mice. 114 (0,25 ) CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Figure 4.8: M-Mode displays of four mouse embryos at ED 12.5, ED 13.5 and ED 15.5 for both transmitted pulses (19 MHz and 40 MHz). The heart’s walls and interventricular septum proved to be visible as soon as ED 12.5. Other cardiac dimensions of the structures of the embryonic mouse heart were imaged easily at ED 15.5. HW: Heart wall, RV: primitive right ventricle, LV: primitive left ventricle, IS: interventricular septum, PW: posterior wall; D: end diastole and S: end systole. 115 4.3. POWER SPECTRA ANALYSIS 4.3 Power spectra analysis To calculate the AIB, it is necessary to integrate the apparent backscatter coefficient. To compare the values of the AIB obtained between EDs 12.5 and 17.5, the frequency bandwidth must be the same. To determine the most appropriate bandwidth, the averaged power spectra of the signals backscattered from blood were calculated for each ED. These calculations were performed using the gated radio frequency signals used for the calculation of the apparent backscatter coefficient, i.e. the averaged power spectra were calculated using 256 samples (about 400 window size) or using 128 samples (about 200 window size) using a rectangular window and zero-padded to 1024 samples. These averages were calculated for 18 embryos in 4 mice at each age of gestation, except at ED 12.5 where 9 embryos in 2 mice were studied and at ED 17.5 where 10 embryos in 3 mice were studied. The number of embryo studied for each ED is reported as N in the figures presented in this chapter. 4.3.1 Frequential parameters measured with a 400 window (256 samples) For each ED, the power spectra of the signals backscattered by blood were averaged and the following parameters were measured: the frequency bandwidth at -6 dB (under the maximum amplitude of the power spectra). the central frequency (corresponding to the maximum amplitude of the power spec- tra). the maximum amplitude. the boundaries of the bandwidth. All the results are summarized in Table 4.3. The averaged power spectra at EDs 12.5, 13.5 and 17.5 are plotted in Figure 4.9 as examples and for comparisons. The - 6dB bandwidth was around 19 MHz for the 19 MHz transmitted pulses and around 20 MHz for the 40 MHz transmitted pulses from EDs 12.5 to EDs 15.5. It then increased at 30 MHz (see Table 4.3). The central frequency of the mean power spectra was around 27 MHz for the 19 MHz transmitted pulses and around 31 MHz for the 40 MHz transmitted pulses. At 116 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Figure 4.9: Averaged power spectra of the signals backscattered by blood calculated on 256 samples (a) at ED 12.5 (N=9) and at ED 13.5 (N=18), (b) at ED 13.5 (N=18) and at ED 17.5 (N=10). N is the number of embryo for each ED and the error bars are the mean of the standard deviations calculated for each data sample within the averaged power spectra for a given ED and over the frequency bandwidth [7 MHz, 60 MHz]. 117 4.3. POWER SPECTRA ANALYSIS Table 4.3: Parameters deduced from backscattered signals selected in a window of 256 samples. Parameters ED 12.5 ED 13.5 ED 14.5 19 MHz 40MHz 19 MHz 40MHz 19 MHz 40MHz 19.2 20.2 19 21.1 17.7 20.3 28 32.2 27.1 32.2 26.7 31.1 Maximum amplitude (dB) 31.36 29.33 33.40 30.57 32.76 30.06 Boundaries (MHz) 16-35 22-42 16-35 21-42 17-35 21-42 Bandwidth (dB) F (MHz) ED 15.5 ED 17.5 19 MHz 40MHz 19 MHz 40MHz 18 21.3 22.3 29.7 F (MHz) 25.9 30.9 25.2 29.6 Maximum amplitude (dB) 28.98 25.52 21.17 17.37 Boundaries (MHz) 16-34 20-41 12-34 12-41 Bandwidth (dB) both ultrasound pulses, the central frequency of the averaged power spectra exhibited a small dependence on the age and slightly decreased after ED 15.5 (see Table 4.3). The maximum amplitude of the averaged power spectra is strongly dependent on the age. A difference of 12 dB was found between ED 13.5 and ED 17.5 for the 19 MHz transmitted pulses and of 13 dB for the 40 MHz transmitted pulses (see Table 4.3). Calculation of the AIB: given these results, for a pulse at 19 MHz, the apparent backscatter can be integrated between 16 and 35 MHz. For a pulse at 40 MHz, the apparent backscatter can be integrated between 21 and 42 MHz (see Table 4.3). The measurements performed for ED 17.5 suggested that a larger frequency bandwidth should be used. However, we think that information related to noise would then appear for all the other EDs. In Figure 4.9 the average of the differences in amplitude, in the frequency range 16 MHz to 35 MHz, of the averaged power spectra at ED 13.5 (N=18) and at ED 17.5 (N=10) was 11,9 dB for the 19 MHz transmitted pulses and 13,1 dB for the 40 MHz transmitted pulses. Between EDs 12.5 and 13.5, these averages were 2 dB for the 19 MHz transmitted pulses and 1,7 dB for the 40 MHz transmitted pulses. Between EDs 13.5 and 15.5, these differences were 4,8 dB (19 MHz) and 5,1 dB (40 MHz). 118 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION The standard deviations showed an important variability at each age studied in the gestation. In other words, the calculated power spectra are dependent on the mouse embryo studied. For example, at ED 13.5 and at 40 MHz, the standard deviations ranged from 2,1 dB to 2,8 dB in the frequency range [21 MHz, 42 MHz]. 4.3.2 Frequential parameters measured with a 200 window (128 samples) The frequential parameters were not different from those obtained using a larger window. Only the maximum amplitudes were lower for each ED but the relative averages of the differences in amplitude and in the frequency range [16 MHz, 35 MHz] between EDs were the same. Only results using the 400 window (256 samples) will be discussed in the following paragraphs. The results obtained using 128 samples are given in Annex A. 4.4 Apparent integrated backscatter coefficient after corrections 4.4.1 Apparent integrated backscatter coefficient As introduced in Chapter 3, the radio-frequency signals were corrected using both the adapted method and the standard method with the compensating factor for the insonified volume. The results obtained with these two methods are given in this section. Correction by the adapted method The results obtained using the adapted method are summarized in Figure 4.10. All the AIB coefficients are plotted for each ED and for each transmitted pulses. As it was suggested by the power spectra analysis, two similar trends were detected for each transmitted pulses. First a slight increase of the mean AIB between EDs 12.5 and 13.5 and a progressive decrease of the mean AIB between EDs 13.5 and 17.5. The mean AIB was at its maximum at ED 13.5 for both frequencies. The values of the mean AIB between EDs 12.5 and 17.5 were higher for the 19 MHz transmitted pulses than for the 40 MHz transmitted pulses. Between ED 12.5 and ED 13.5, the mean AIB increased from -27,3 dB to -25,3 dB for the 19 MHz transmitted pulses and from - 29,5 dB to - 27,8 dB for the 119 4.4. APPARENT INTEGRATED BACKSCATTER COEFFICIENT AFTER CORRECTIONS 40 MHz transmitted pulses. It then decreased down to -37,2 dB and down to -40,9 dB at ED 17.5, respectively, for the 19 MHz and 40 MHz transmitted pulses. A two-way ANOVA statistic test, with frequency and embryonic day as the two factors, was used to study the significance of the differences between the means. When a test was found significant, a multiple comparison procedure based on the Student-Newman-Keuls method was used to isolate which groups differed from the others. At each ED, the mean of the AIBs measured at 28 MHz (19 MHz transmitted pulses) was significantly higher than the mean of the AIBs measured at 35 MHz (40 MHz transmitted pulses) (p < 0.001, 5 %), except at ED 12.5 (p = 0.082, 5 %). The overall behaviour of the mean AIB from ED 12.5 and ED 17.5 was similar at 28 MHz and 35 MHz and the change due to frequency was the same at all ages. This means that comparing age the AIBs can be pooled for the two frequencies. From ED 12.5 and ED 13.5, an increase of the mean AIB could be detected. From ED 13.5 to ED 17.5, the mean of the AIBs decreased regularly and during a time interval of 2 EDs, the progressive decrease of the mean AIB was significant (p<0.001, 5 %). Correction by the standard method The results obtained using the standard method are summarized in Figure 4.11. Similar trends as those observed with the adapted method were noted. The differences between the mean AIBs calculated using both methods were less than or around 1 dB from ED 12.5 to ED 17.5 for the 19 MHz and 40 MHz transmitted pulses. The main discrepancy compared to the adapted method was the difference between the mean AIBs for the 19 and 40 MHz transmitted pulses at a given ED, each difference became greater than in the adapted method. This discrepancy is explained by the fact that in the adapted method the power spectra in the phantom are taken into consideration (Diffusion) whereas in the standard method only the power spectra in the quartz are taken into consideration (specular reflection). 4.4.2 Discussion on factors influencing the backscatter coefficient Corrections of the radio-frequency signals In our experiments, the signals backscattered from our blood samples came from the focal region and were corrected for the transfer functions of the system and the diffraction effects. Because of heart motion that cannot be controlled, it was therefore more accurate and safer to use the adapted method. In this method, the distance between the surface of 120 and for the 40 MHz transmitted pulses (o) (phantom as a reference). The mean AIBs ( Standard Error of the Mean) are plotted beside the AIBs for each ED. The SEM was calculated on 18 AIBs at ED 13.5, ED 14.5 and ED 15.5, on 9 AIBs at ED 12.5 and on 10 AIBs at ED 17.5. Calculations were performed using 256 samples. CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION 121 Figure 4.10: Apparent integrated backscatter coefficients after correction using the adapted method for the 19 MHz transmitted pulses (+) 122 4.4. APPARENT INTEGRATED BACKSCATTER COEFFICIENT AFTER CORRECTIONS Figure 4.11: Apparent integrated backscatter coefficient after correction using the standard method with the compensating factor for the insonified volume. Results are plotted for the 19 MHz transmitted pulses (+) and for the 40 MHz transmitted pulses (o). The mean AIBs ( Standard Error of the Mean) are plotted beside the AIBs for each ED. The SEM was calculated on 18 AIBs at ED 13.5, ED 14.5 and ED 15.5, on 9 AIBs at ED 12.5 and on 10 AIBs at ED 17.5. Calculations were performed using 256 samples. CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION the transducer and the gated backscattered signals was taken into consideration whereas in the standard method (with the factor compensating for the insonified volume) the distance was always considered to be equal to the focal distance. However, the comparison of the mean AIBs for each ED obtained using these methods suggests that these corrections can be performed using both methods since only small differences (about 1 dB) were found. Ultrasound frequency The mean AIB was found to be higher for the 19 MHz transmitted pulses than for the 40 MHz transmitted pulses. This is in contradiction with Rayleigh theory (see Equation 3.2). The differences between the mean AIBs for the 19 and 40 MHz transmitted pulses from ED 12.5 to ED 17.5 varied between 2,1 dB and 3,7 dB. These differences with ultrasound frequency may be due to broad bandwidth and therefore considerable overlap in ultrasound distributions (see Table 4.3. As our data was only corrected for the electromechanical transfer functions of the system and the diffraction effects, this result may also be due to attenuation in the medium of propagation. Attenuation in tissues is known to increase with depth and frequency and is also known to be strongly dependent on the structure of the tissue [Foster 00b]. In our case, because the measurements were performed at the same depth, the observed differences could be due to the difference in ultrasound frequency. The observed decrease of the mean AIB between ED 13.5 and ED 17.5 may have been influenced by attenuation in the medium. Since the embryo’s tissues grow from conception to birth, and since AIB was not corrected for the attenuation along the propagation path, variations of this parameter or of the path length during the gestation might also have affected the variations in backscatter. However, those variations in total attenuation alone would not explain the -13 dB drop in AIB between EDs 13.5 and 17.5. From our results, an increase of the mean AIB was found between EDs 12.5 and 13.5 which could imply that the attenuation was not consistently affecting the mean AIB, at least within this time range. Moreover, for the 19 and 40 MHz transmitted pulses, no significant shifts of the central frequencies in power spectra, that could indicate the effect of the attenuation between the transducer and our sample of blood, were observed between EDs 13.5 and 17.5 (Table 4.3). 123 4.4. APPARENT INTEGRATED BACKSCATTER COEFFICIENT AFTER CORRECTIONS Hematocrit Our results show a high level of hematocrit and a small increase over time, 34% at ED 15.5 and 37% at ED 17.5. This is in agreement with published data in [Masuoka 02] who showed increasing hematocrit with age from ED 13.5 to ED 18.5 and a hematocrit at 20% at ED 13.5. Assuming that the backscatter coefficient peaks around 20% in pulsatile conditions [Cloutier 93], hematocrit could explain that the mean AIB was at its maximum at ED 13.5. Because of the 15% increase of cell concentration and the 9% decrease of the MCV between EDs 15.5 and 17.5, the increase of 8% of hematocrit is most likely related to the increasing erythrocyte concentration (enucleated RBCs). Assuming Rayleigh conditions and because erythrocyte concentration likely increases from ED 12 until birth in the mouse embryo [Russell 66], the increase in cell concentration should induce a linear increase of the mean AIB between EDs 13.5 and 17.5. However, because of the high level of HCT, the increase in HCT would mean a decrease of the backscatter coefficient between EDs 13.5 and 17.5. Size and shape of the scatterers Assuming that non aggregated RBCs were only present in the heart chamber because of the turbulent flow and high shear rate conditions, a decrease in the size of the RBCs would induce a decrease of the backscatter. Assuming Rayleigh conditions, the 38% relative decrease in diameter of the nucleated RBCs between EDs 13.5 and 17.5 likely contributes to the decrease of the mean AIB. Because nucleated RBCs (bigger cells in our sample of blood) were most likely the main scatterers between EDs 12.5 and 13.5 and because their diameter was only 2 to 5 times smaller than the wavelength for the 40 MHz transmitted pulses (38.5 ) and 19 MHz transmitted pulses (81 ), their shape may have affected the mean AIB [Shung 93] and may be a reason for the difference found between EDs 12.5 and 13.5. At later stages in the gestation, nucleated RBCs’ shape will probably not affect the mean AIB because of the decreasing diameter of the nucleated RBCs and their decreasing number. 124 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION Nucleus of the primitive RBCs In a recent study, Czarnota et al. suggested that changes in density and the arrangement of the nuclear material could be the cause of variations in backscatter during apoptosis [Czarnota 97]. Czanorta et al. also reported a significant decrease in amplitude of the scattered signal after digestion of nucleus DNA [Czarnota 99]. Assuming nuclear scattering in randomly packed cells, recent simulations showed that, the signal strength would decrease in the case of a total loss of the nuclei [Hung 02]. However, in the same study, they surprisingly showed that a small loss of nuclear material can increase the strength of the scattered signal. Over the course of erythropoiesis, the nucleus is ejected from the RBCs. This process can thus be considered a total loss of the nucleus and in turn, a decrease in signal strength. A study performed at high frequency (30 MHz) showed that the blood response to ultrasound was mainly attributed to the difference in acoustic impedance inside and outside the RBCs. A 20 dB drop of the integrated backscatter coefficient was found in this study [Van Der Heiden 95]. The progressive 92% relative decrease of the number of nucleated RBCs between EDs 13.5 and 17.5, in other words, the loss of nuclei and/or the shrinkage of the RBCs during erythropoiesis, could therefore play a dominant role in the drop of the mean AIB. 125 4.5. CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES 4.5 Conclusions and Perspectives Our work shows that measurements of the apparent backscatter coefficient from blood in vivo were influenced by morphological changes occurring during erythropoiesis. This work highlights the fact that the loss of the nucleus during erythropoiesis significantly influences the changes of the backscattering by blood in vivo. However, establishing an exact causal relationship would require a more detailed understanding of cell volume effects and blood hematocrit on the AIB coefficient during the entire period of study. The validation of our conclusion could be performed using appropriate mouse models. For example, ATF4-deficient mouse embryos were shown to have elevated nucleated RBCs compared to normal embryos in [Masuoka 02]. It would also be interesting to make the measurements on mice where the developmental stage of the red blood cells is controlled. As well, it would be interesting to measure the apparent backscatter coefficient before ED 12.5. Although the septation, separation of the heart ventricles (see Figs. 1.10 in Chapter 1) may not be fully completed, calculations could be feasible using a window of 200 (128 samples). At EDs 9.5 and 11.5, only nucleated RBCs were found in blood (see Annex B for figures). Therefore, one can assume that the mean AIB at ED 11.5 would be higher than at older ages. The methods developed here could be valuable for the purpose of better understanding the etiology of blood diseases such as anaemias and hereditary anaemias. Measurement of AIB could be seen as a functional parameter of the developmental stage of the blood in vivo in mice. This work also showed that the mean AIB was lower at the highest frequency and we conclude that it was certainly due to attenuation. Further investigations are therefore needed to estimate the effect of the attenuation on the mean AIB (mouse skin, growing tissues of mouse embryo). Not only does this study show the ability of high frequencies to image the genesis of the embryo heart non-invasively and in vivo, but it also demonstrates the possibility to measure cardiac dimensions using M mode visualisation. This visualisation shows that the cardiac dimensions of the mouse embryo at ED 12.5 are in the order of 500 , 2 to 5 times the sizes that can be found in the adult mouse heart (Tab. 2.2). At ED lower than ED 13.5, it was not easy to visualize the heart beats and thus it became difficult to estimate any cardiac parameters. Another important point is that at EDs lower than ED 13.5, the shape of the heart cannot be precisely determined, as it could be at older ages, since at this time the heart is continuously changing (cardiac morphogenesis). This means that the M Mode visualisation should give more accurate results (at least for early EDs) than the 126 CHAPTER 4. BACKSCATTERING BY BLOOD IN THE MOUSE EMBRYO: QUANTIFICATION OF CHANGES IN BACKSCATTERING WITHIN THE HEART CHAMBERS DURING GESTATION B Mode visualisation combined with any geometrical assumptions about the shape of the heart. An important step in the morphogenesis of the heart, such as the septation, could also be studied using this imaging mode. It is interesting to see that in the images (Figs. 4.8) it was possible to differentiate the dimension of the interventricular segment (IS) during diastole and systole. 127 4.5. CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES 128 CONCLUSION GÉNÉRALE Conclusion générale L’étude des modèles animaux joue un rôle déterminant dans le domaine de la recherche médicale et l’imagerie est amenée à répondre à la question du suivi in vivo du développement normal ou pathologique de ces animaux. Ce travail montre les potentialités de l’imagerie ultrasonore à différentes fréquences d’imagerie pour le suivi du développement de la souris et plus particulièrement de son système cardio-vasculaire. Dans le contexte des études post-génomiques, elles apportent des données quantitatives de référence acquises chez des souris normales. A des fréquences comprises entre 7 et 15 MHz, nous avons démontré qu’il était possible de mesurer les vitesses sanguines dans l’artère ombilicale et l’aorte dorsale de l’embryon de souris à partir de 11,5 jours de gestation et pendant toute la durée de la gestation. Nous avons réalisé la mesure de plusieurs paramètres hémodynamiques, dont la fréquence cardiaque, qui permettent de suivre le développement du système cardio-vasculaire de la souris au cours de la gestation. Ce travail a permis de créer une base de données de référence de paramètres quantitatifs pour la souche . Cette base permettra de suivre le développement du système cardio-vasculaire chez l’embryon de souris transgénique issu de cette même souche. Par ailleurs, ces données pourraient également permettre une aide à l’identification des vaisseaux par des connaissances à priori sur l’âge de l’embryon et de ces paramètres hémodynamiques. Au cours de cette étude nous avons également démontré la faisabilité de la visualisation 3D et la quantification du volume occupé par l’embryon de souris. Cette quantification pourrait être un nouveau critère de viabilité de l’embryon. Une étude sur toute la durée de gestation de la souris et sur un grand nombre d’embryons permettra de quantifier en 3D le développement de la souris. A très hautes fréquences (19-40 MHz) nous avons quantifié les variations d’échogénicité du sang et nous avons démontré la faisabilité d’étudier in vivo la formation sanguine au cours de l’érythropoïèse. Le calcul du coefficient apparent de rétrodiffusion, intégré sur une bande de fréquence spécifique, a montré des variations qui sont liées aux changements morphologiques des globules rouges. Nous avons conclu que la décroissance de ce coefficient est principalement liée à l’expulsion du noyau des globules rouges et à la décroissance en moyenne de la taille des globules rouges pendant la période étudiée (ED 13.5 à ED 17.5). Par ailleurs, la méthode expérimentale mise en place pour le calcul de ce coefficient a montré que les corrections apportées aux signaux radio-fréquences peuvent129 être réalisées aussi bien par la méthode adaptée que par la méthode standard (avec la correction du volume insonifié), lorsque les mesures sont réalisées dans la zone focale du transducteur. Enfin, nos résultats démontrent également que l’étude de la fonction cardiaque des embryons de souris par la mesure de paramètres anatomiques en mode M peut-être réalisée à ces fréquences. Nos travaux de recherche mettent en avant la large bande de fréquence qui peut-être utilisée pour l’imagerie de la souris adulte et gestante. Ils mettent également en évidence les limites actuelles des machines ultrasonores en terme d’imagerie de la souris gestante. Ils démontrent qu’une seule machine ultrasonore peut difficilement répondre à tous les besoins. Ceci s’explique principalement par le fait que chez l’embryon de souris, la forme, la taille et la fonction des organes ne cessent d’évoluer alors que le compromis mis en place dans les systèmes ultrasonores entre la taille des fenêtres d’observations (en mode B et M, Doppler) et la fréquence d’émission est dans certains cas fixé ou ne permet pas une flexibilité suffisante. Le développement des modes Doppler pulsé et couleur à très hautes fréquences sont des perspectives très intéressantes pour une imagerie quantitative de l’embryon de souris. Afin de rendre l’étude de la fonction d’un organe spécifique, comme le cœur, la plus complète possible chez la souris, le développement de sondes ultrasonores adaptées capables de fournir les modes Doppler pulsé et Doppler couleur associés à une imagerie en mode B à très hautes fréquences est souhaitable. 130 ANNEXE A Annexe A AIB calculated with a 200 window (128 samples) The results of the calculations performed using a window of 128 samples are summarized in Figure 4.12 for the adapted method and in Figure 4.13 for the standard method with the factor compensating for the volume insonified. The variations of the mean AIB are identical than for the calculations performed using a larger window. It should then be possible to calculate the apparent integrated backscatter coefficient before EDs 12.5 and to compare it with haematology. 131 132 Figure 4.12: Apparent integrated backscatter coefficients after correction using the adapted method for the 19 MHz transmitted pulses (+) and for the 40 MHz transmitted pulses (o) (phantom as a reference). The mean AIBs ( Standard Error of the Mean) are plotted beside the AIBs for each ED. The SEM was calculated on 18 AIBs at ED 13.5, ED 14.5 and ED 15.5, on 9 AIBs at ED 12.5 and on 10 AIBs at ED 17.5. Calculations were performed using 128 samples. ANNEXE A 133 Figure 4.13: Apparent integrated backscatter coefficient after correction using the standard method with the compensating factor for the volume insonified. Results are plotted for the 19 MHz transmitted pulses (+) and for the 40 MHz transmitted pulses (o). The mean AIBs ( Standard Error of the Mean) are plotted beside the AIBs for each ED. The SEM was calculated on 18 AIBs at ED 13.5, ED 14.5 and ED 15.5, on 9 AIBs at ED 12.5 and on 10 AIBs at ED 17.5. Calculations were performed using 128 samples. 134 ANNEXE B Annexe B In Figure 4.14, typical results from the blood Analyser (model AT Diff, Beckman Coulter) are shown. The number of the cells which constitute a blood sample from a mouse embryo at ED 17.5 are here given. Figure 4.14: Typical results furnished by the Blood Analyser for a mouse embryos at ED 17.5 (model AT Diff, Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canada). 135 Blood smears at EDs 9.5 and 11.5 The blood smears presented in this paragraph were provided by C. Kolb. In Figs. 4.15 all the RBCs were found to be nucleated at ED 9.5 and at ED 11.5. It is also interesting to note that the sizes of the nucleus were found larger at these ages. Although we did not use the same mice, these morphological changes were certainly occurring in the one I was studying. (a) (b) Figure 4.15: Blood smears at ED 9.5 (a), at ED 11.5 (b) magnification 136 60. ANNEXE B Communications et publications en lien avec le travail de thèse Communications avec actes LE FLOC’H J., CHERIN E., ZHANG M.Y., KOLB C., ADAMSON S.L., VRAY D. and FOSTER F.S. Ultrasonic Measurement of Backscatter from Embryonic Mouse Red Blood Cells in Vivo, IEEE Ultrasonics Symposium, Atlanta, USA, 2001, vol. 2, p.1291-1294. VRAY D., DISCHER A., LE FLOC’H J., MAI W., CLARYSSE P., PHAM Q.C., MONTAGNAT J., JANIER M. 3D quantification of ultrasound images : application to mouse embryo imaging in vivo, IEEE Ultrasonics Symposium, Munich, Germany, 2002, p.15571560. Communications sans actes LE FLOC’H J., CHERIN E., ZHANG M.Y., KOLB C., ADAMSON S.L., VRAY D. and FOSTER F.S. Backscatter from Embryonic Mouse Red Blood Cells in Vivo, 11th New England Doppler Conference, Lake Rosseau, Ontario, Canada, 2001. MAI W., LE FLOC’H J., VRAY D., SAMARUT J., BARTHEZ P., JANIER M. Evaluation of cardio-vascular function in mouse fetus using high resolution gray-scale and Doppler ultrasonography - technique and preliminary results, European Association of Veterinary Diagnostic Imaging Annual meeting, Archena, Murcia , SPAIN, 2002. MAI W., LE FLOC’H J., VRAY D., SAMARUT J., BARTHEZ P., JANIER M. Non invasive in vivo evaluation of cardio-vascular function in 129Sv mouse fetus using high frequency gray-scale, color- and pulsed-wave Doppler ultrasonography, Academy of Molecular Imaging Annual meeting, San Diego, California, USA, 2002. Publication soumise MAI W., LE FLOC’H J., VRAY D., SAMARUT J., BARTHEZ P., JANIER M. Non invasive in vivo evaluation of cardio-vascular function in 129Sv mouse fetus using high frequency gray-scale, color- and pulsed-wave Doppler ultrasonography. Soumis à The American Journal of Physiology (Heart & Circulatory Physiology), 2003. 137 138 Bibliographie [Adams 00] A DAMS M. D. et COLLEAGUES . The genome sequence of drosophila melanogaster. 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