Examens virologiques en pratique médicale

Examens virologiques en pratique médicale
Moyens techniques pour faire un diagnostic positif:
n 
n 
Diagnostic direct
Diagnostic indirect
Pr V. Giordanengo
Examens virologiques en pratique médicale
n 
Est-il encoredirect
là ???=
Diagnostic
recherche du virus ou d un
de ses constituants
(protéines virales ou
génome viral)
n 
Serait-il passé
par là =
???
Diagnostic
indirect
recherche des anticorps
Diagnostic Indirect =
Diagnostic Direct =
Détection d Ac par différentes techniques
Détection du virus ou de ses composants
- Technique ELISA
Isoler le
virus
Détecter
les Ag
Détecter
le génome
- Western-blot
Culture
cellulaire
« Dater l infection »
Infection récente
« Déjà vu le virus »
Statut sérologique
PCR
RT-PCR
Immunofluorescence
Diagnostic indirect ou sérologie: Prélèvement
n 
Diagnostic indirect
n 
n 
n 
Sérum
n 
n 
n 
n 
n 
Détecter les Ac
Ac spécifiques dirigés contre le virus
Simple
Prélèvement de sang en tube sec gélosé
Facile ….
Acheminé au laboratoire à température ambiante.
Centrifugé au laboratoire
Le sérum est utilisé pour réaliser les sérologies prescrites.
Autres liquides biologiques :
n 
n 
n 
n 
liquide céphalo-rachidien (LCR),
liquide amniotique,
liquide pleural,
liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) ...
Diagnostic indirect ou sérologie: recherche AC
n 
Techniques:
Épitopes viraux
n 
AC
du sérum à tester
ELISA (tests unitaires ou en
plaques) = Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay
n 
n 
n 
AC
anti AC-humain
Puits colorés = Positifs
AC sont-ils des IgG ou IgM ?
Si AC anti IgM => puits colorés
si présence d IgM
Diagnostic indirect ou sérologie: recherche AC
A
ati
n
i
t
gglu
n 
ELIS
n 
A
late
(
n
o
x
ole
é
b
u
r
n 
)
Tes
de
i
p
a
tr
n 
Wes
bl
n
r
e
t
ot
En conclusion: rechercher des AC
n 
Pour le diagnostic d une infection
en cours:
n 
2 prélèvements à 15 jours
d intervalle
n 
n 
n 
Titre ou taux AC augmente
IgM signe une infection récente
Pour diagnostic des primo-infections
+++
n 
n 
Apparition des Ac entre deux
sérums prélevés à 15 jours
d intervalle
Pour connaître le statut sérologique
(« cicatrice laissée par le passage
du virus »)
= savoir si un patient a déjà
rencontré un virus précis
n 
n 
Pour le HIV et le HCV une sérologie
positive pour la première fois
n 
n 
2 sérums : sérum précoce (neg) –
sérum tardif (pos)
Recherche d IgG
Obligatoire de vérifier le résultat sur
un second prélèvement
Diagnostic Indirect =
Diagnostic Direct =
Détection d Ac par différentes techniques
Détection du virus ou de ses composants
- Technique ELISA
Isoler le
virus
Détecter
les Ag
Détecter
le génome
- Western-blot
Culture
cellulaire
« Dater l infection »
Infection récente
« Déjà vu le virus »
Statut sérologique
PCR
RT-PCR
Immunofluorescence
Diagnostic direct :
détection du virus ou de ses composants
n 
Prélèvements:
n 
n 
n 
n 
La qualité du prélèvement conditionne le
résultat
n 
n 
n 
Récipient sec stérile
(Aspiration naso-pharyngée, selles, urines,
LCR…)
Écouvillon stérile immergé dans un milieu
de transport
(gorge, vésicules, conjonctives)
Tube de sang ou de plasma
héparinate de lithium (CMV) ou EDTA
(EBV, HIV)
Il faut des cellules ++++
gratter sur les berges afin de récupérer des
cellules vivantes et non de la nécrose
Acheminer au laboratoire dans les 4
heures
Divers
difficile
fragile….
n 
Techniques:
n 
n 
n 
Diagnostic direct « rapide »
Diagnostic direct par culture
Diagnostic direct par biologie
moléculaire
Diagnostic direct « rapide »
détection du virus ou de ses composants
n 
Résultats en quelques heures
n 
Technique:
n 
n 
n 
Cellules déposés sur une lame
de verre
Ag sont détectés par
immunomarquage
Indications
n 
n 
n 
Prise en charge rapide
Infections respiratoires (grippe,
VRS)
Chez les patients
immunodéprimés (CMV)
AC
Protéines
virales
Négatif
Positif
Diagnostic direct « rapide »
détection du virus ou de ses composants
n 
Résultats en quelques heures
n 
Technique:
n 
n 
n 
Cellules déposés sur une lame
de verre
Ag sont détectés par
immunomarquage
Indications
n 
n 
n 
n 
Prise en charge rapide
Infections respiratoires (grippe,
VRS)
Chez les patients
immunodéprimés (CMV)
Femme enceinte (HSV)
AC
Protéines
virales
Négatif
Positif
Diagnostic direct : Immunofluorescence
IF grippe A
Diagnostic direct : Immunofluorescence
IF VRS
Diagnostic direct : Immunofluorescence
Diagnostic Indirect =
Diagnostic Direct =
Détection d Ac par différentes techniques
Détection du virus ou de ses composants
- Technique ELISA
Isoler le
virus
Détecter
les Ag
Détecter
le génome
- Western-blot
Culture
cellulaire
« Dater l infection »
Infection récente
« Déjà vu le virus »
Statut sérologique
PCR
RT-PCR
Immunofluorescence
Diagnostic direct par culture:
détection du virus ou de ses composants
n 
Les différentes étapes du
diagnostic par culture virale:
n 
n 
n 
Inoculation du prélèvement sur
différents supports cellulaires
Recherche 3 fois/sem d un
effet cytopathique
Si ECP: identification
n 
n 
n 
Coloration
Immunomarquage spécifique
Neutralisation
Diagnostic direct par culture:
détection du virus ou de ses composants
n 
Les différentes étapes du
diagnostic par culture virale:
n 
n 
n 
Inoculation du prélèvement sur
différents supports cellulaires
Recherche 3 fois/sem d un
effet cytopathique
Si ECP: identification
n 
n 
n 
Coloration
Immunomarquage spécifique
Neutralisation
Diagnostic direct par culture:
détection du virus ou de ses composants
n 
Les différentes étapes du
diagnostic par culture virale:
n 
n 
n 
Inoculation du prélèvement sur
différents supports cellulaires
Recherche 3 fois/sem d un
effet cytopathique
Si ECP: identification
n 
n 
n 
Coloration
Immunomarquage spécifique
Neutralisation
Diagnostic direct par culture:
détection du virus ou de ses composants
n 
Avantage:
n 
n 
n 
n 
Sensibilité
Prouve le caractère infectieux
du virus
Permet d isoler la souche
Contraintes:
n 
n 
Hotte à flux laminaire,
Matériel jetable et stérile
Diagnostic Indirect =
Diagnostic Direct =
Détection d Ac par différentes techniques
Détection du virus ou de ses composants
- Technique ELISA
Isoler le
virus
Détecter
les Ag
Détecter
le génome
- Western-blot
Culture
cellulaire
« Dater l infection »
Infection récente
« Déjà vu le virus »
Statut sérologique
PCR
RT-PCR
Immunofluorescence
Diagnostic direct par biologie moléculaire:
détection de ses composants
n 
Par amplification génique:
n 
n 
n 
n 
Par PCR ou RT-PCR…suivant le génome
Permettant le recopiage d une portion limitée du génome viral
=> Détection possible:
PCR qualitative (pos ou nég)
Quantitative (HIC, HBV, HCV, EBV) = charge virale
Suivi parfois du séquençage nucléotidique = séquence exacte
dNTP!
Taq polymérase!
Amorces!
Tampon!
Matrice!
ADN!
30 cycles"
95°C
!55°C
Dénaturation
"Hybridation
!72°C!
"Elongation!
Diagnostic direct par biologie moléculaire
n 
Avantage:
n 
n 
n 
Sensibilité
Technique quantitative
= Charge virale
Séquence exacte …
adaptation thérapeutique
Quantité d ADN
Synthétisé
Au cours du temps
n 
Contraintes:
n 
Risque de contamination
Séquence exacte de l ADN synthétisé
Diagnostic Indirect =
Diagnostic Direct =
Détection d Ac par différentes techniques
Détection du virus ou de ses composants
- Technique ELISA
Isoler le
virus
Détecter
les Ag
Détecter
le génome
- Western-blot
Culture
cellulaire
« Dater l infection »
Infection récente
« Déjà vu le virus »
Statut sérologique
PCR
RT-PCR
Immunofluorescence
UN EXEMPLE
VHB et marqueurs directs
Protéines de
surface portant
l Ag HBs
Capside
portant
l Ag HBc
Génome : ADN
Sang
Ag HBs
Ag HBe
ADN VHB
VHB et marqueurs directs + indirects
Protéines de
surface portant
l Ag HBs
Capside
portant
l Ag HBc
Génome : ADN
Sang
Ag HBs Ac anti-HBs
Ac anti-HBc
Ag HBe Ac anti-HBe
ADN VHB