developpement d`un vecteur lentiviral spécifique

ALMA POSVANDZIC
DEVELOPPEMENT D'UN VECTEUR LENTIVIRAL
SPÉCIFIQUE AUX MACROPHAGES CÉRÉBRAUX
ACTIVÉS POUR LA THÉRAPIE GÉNIQUE
APPLIQUÉE À DES MALADIES DU SYSTÈME
NERVEUX
Mémoire présenté
à Ja Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en physiologie-endocrinologie
pour l'obtention du grade de Maître es Sciences (M.Se.)
FACULTE DE MEDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
DECEMBRE 2007
© Aima Posvandzic, 2007
Résumé
Le but général de ce projet de recherche était de valider la faisabilité de la méthode qui
consiste en l'introduction d'un gène extrinsèque dans les macrophages cérébraux à l'aide
d'un lentivirus, placé sous contrôle d'un promoteur connu pour être actif préférentiellement
dans ces cellules. Plus spécifiquement, nous avons : 1) identifié le gène de la galectine-3
comme étant exprimé de façon préférentielle dans les macrophages cérébraux activés dans
différentes conditions pathologiques du cerveau ; 2) caractérisé son promoteur ; 3) utilisé ce
promoteur pour la conception d'un vecteur lentiviral ; et 4) vérifié la possibilité d'utiliser
des cellules microgliales transduites comme vecteurs pour la thérapie génique. Nous avons
obtenu des résultats prometteurs quant à une utilisation potentielle des cellules microgliales
en thérapie génique ex vivo. Toutefois, pour confirmer que le vecteur lentiviral assure une
expression spécifique et durable du transgène dans un contexte inflammatoire, il faudrait
entreprendre d'autres analyses.
Avant-Propos
J'aimerais tout d'abord remercier mon directeur de recherche, le Dr Luc Vallières, pour ses
encouragements, ses précieux conseils, sa constante implication, sa grande disponibilité,
son enthousiasme contagieux, sa bonne humeur et bien plus encore. Vous avez ma plus
grande admiration et toute ma reconnaissance.
Je tiens aussi à remercier Pierrot Tremblay, notre précieux assistant de recherche, qui m'a
tout appris, ou presque, et m'a accordé tout au long de ma maîtrise une aide inestimable.
Un gros merci pour ta compétence, ta disponibilité et ton inépuisable sens de l'humour.
Je remercie chaleureusement tous mes coéquipiers, Hugo, Jérôme, Julie A., Caroline, Julie
P., Andréanne, Marie-Josée et Naika avec qui travailler était une pure joie, ainsi que mes
nombreux collègues de laboratoire que j'ai eu le bonheur de côtoyer quotidiennement.
Merci pour votre aide, vos sourires, vos fous rires et, surtout, votre amitié.
Merci à tous mes amis, d'ici et de loin, pour votre patience, support, encouragements,
amour et amitié qui m'ont aidé à aller au bout de ce projet. Je vous en serai toujours très
reconnaissante.
Finalement, et avant tout, je tiens à remercier mes parents et mon frère, pour leur soutien et
leur amour inconditionnel. Marna, tata i Alêne, volim vas najvise na svijetu !
À ma grand-mère Paula
Table des matières
Résumé
i
Avant-Propos
ii
Table des matières
iv
Liste des abréviations
vi
Liste des figures
ix
Liste des tableaux
x
Chapitre 1 : Introduction
1
1.1 Thérapie génique
2
1.1.1 Historique
2
1.1.2 Thérapie génique et système nerveux central : problèmes et solutions
3
1.1.3 Transfert de gènes in vivo et ex vivo
4
1.1.4 Vecteurs de transfert en thérapie génique
5
1.1.4.1 Vecteurs non-viraux
6
1.1.4.2 Vecteurs viraux
7
1.1.4.2.1 Virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1)
7
1.1.4.2.2 Adénovirus
8
1.1.4.2.3 Virus adéno-associé (AAV)
9
1.1.4.2.4 Rétrovirus
10
1.1.4.2.5 Lentivirus
12
1.1.4.2.5.1 Génome lentiviral
12
1.1.4.2.5.2 Avantages et limitations des vecteurs lentiviraux
14
1.1.4.2.5.3 Production de vecteurs lentiviraux
15
1.1.4.2.5.4 Pseudotypage des lentivirus
17
1.2 Macrophages cérébraux
17
1.2.1 Origine et caractéristiques des macrophages cérébraux
18
1.2.2 Rôle des macrophages cérébraux dans des maladies du système nerveux
19
1.2.2.1 Macrophages et tumeurs cérébrales
21
1.2.3 Thérapie cellulaire des maladies du système nerveux
22
1.2.3.1 Macrophages cérébraux comme véhicules cellulaires dans la thérapie génique
des maladies du système nerveux
23
1.3 Utilisation d'un promoteur spécifique aux macrophages cérébraux pour la thérapie
génique
24
1.3.1 Galectine-3
24
1.3.2 Fonctions biologiques de la galectine-3
25
1.3.2.1 Galectine-3 et inflammation
26
1.3.3 Galectine-3 dans le cerveau
27
1.4 Objectifs du projet
28
Chapitre 2 : Matériel et méthodes
29
2.1 Étude de l'expression de la galectine-3
29
2.1.1 Hybridation in situ
29
2.1.2 Immunofluorescence
29
2.1.3 RT-PCR
30
v
2.2 Analyse du promoteur de la galectine-3
30
2.2.1 Purification de l'ADN génomique
30
2.2.2 Construction des vecteurs Gal3-pCAT
30
2.2.3 Culture cellulaire
31
2.2.4 Transfection
31
2.2.5 Essai CAT
32
2.2.6 Dosage de la hGH
32
2.2.7 Dosage des protéines
33
2.3 Conception du vecteur lentiviral et validation de son efficacité
33
2.3.1 Construction du vecteur lentiviral pHR-Gal3-EGFP
33
2.3.2 Production de lentivirus
33
2.3.3 Culture primaire de cellules microgliales
34
2.3.4 Transduction in vitro
34
2.3.5 Immunocytofluorescence
35
2.3.6 Cytométrie en flux
35
2.3.7 Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo avec ou sans cellules
tumorales
36
2.3.8 Préparation de tissus
36
Chapitre 3 : Résultats
37
3.1 Étude de l'expression de la galectine-3
37
3.1.1 Expression de la galectine-3 est induite dans les macrophages cérébraux activés..37
3.1.2 Galectine-3 est exprimée par des cellules microgliales in vitro
37
3.2 Analyses de délétion du promoteur du gène de la galectine-3
38
3.2.1 Choix du promoteur minimal le plus robuste et spécifique : -2157Gal3
38
3.3 Conception du vecteur lentiviral et validation de son efficacité
39
3.3.1 Expression de la protéine EGFP sous le contrôle du promoteur du gène de la
galectine-3 dans des cellules microgliales transduites par le vecteur lentiviral in vitro...39
3.4 Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo avec ou sans cellules
tumorales
40
Chapitre 4 : Discussion
48
Chapitre 5 : Conclusion
51
Bibliographie
53
Liste des abréviations
4-PB
AAV
ADN
ADNc
ARN
ARNm
BH1
CAT
CMH
CMV
CNTF
cpm
cPPT
CTS
DAPI
db
DMEM
DNA
DPBS
DPX
EAE
EDTA
EGFP
EIAV
FACS
FIV
FV
g
Gal-3
GCV
GFP
GM-CSF
h
hGH
HIV
HSV-1
IFN
IL
IRMA
ITR
JNK
kb
KC1
4-butyrate de phényle
Virus adéno-associé
Acide désoxyribonucleique
Acide désoxyribonucleique complémentaire
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique messager
Domaine d'homologie avec Bcl-2
Chloramphénicol-acétyltransférase
Complexe majeur d'histocompatibilité
Cytomégalovirus
Facteur ciliaire neurotrophique
Coup par minute
Central polypurine tract
Séquence de terminaison centrale
Diamidinophénylindole
Double brin
Milieu de culture Eagle de type Dulbecco
Acide désoxyribonucleique
Tampon phosphate salin de type Dulbecco
Bromure di/7-xylène-bis-pyridinium
Encéphalomyélite allergique expérimentale
Acide ethylène-diaminetetraacétique
Protéine verte fluorescente améliorée
Virus de l'anémie infectieuse équine
Cytométrie en flux
Virus de l'immunodéficience féline
Virus spumeux
Gramme
Galectine-3
Gancyclovir
Protéine verte fluorescente
Facteur de stimulation de colonies de granulocytes et de macrophages
Heure
Hormone de croissance humaine
Virus de l'immunodéficience acquise humaine
Virus de l'herpès simplex de type 1
Interféron
Interleukine
Dosage radioimmunologique
Séquence terminale inversée
Kinase c-jun amino-terminale
Kilo paire de bases
Chlorure de potassium
kDa
KPBS
LAMP
LAP
LCMV
LPS
LTR
Luc
M
MAG
MAPK
MBP
MFI
mg
ml
mm
MOI
MuLV
NaCl
N-CAM
NF-KB
NGF
NK
nm
PBS
PCR
PE
PGK
PMSF
PPT
rAAV
rpm
RRE
RSV
RT-PCR
sb
SD
sec
SIN
SIV
TAM
TAR
Tat
Th2
Tk
TU
VIH
Kilodalton
Solution saline tamponnée au phosphate de potassium
Protéine membranaire lysosomale
Promoteur associé à la latence
Virus de la chorioméningite lymphocytaire
Lipopol ysaccharide
Longue séquence terminale répétée
Luciférase
Molaire
Glycoprotéine associée à la myéline
Protéine kinase activée par un mitogène
Protéine basique de la myéline
Intensité de fluorescence moyenne
Milligramme
Millilitre
Millimètre
Multiplicité d'infection
Virus leucémogène murin
Chlorure de sodium
Molécule d'adhésion neurale
Facteur nucléaire KB
Facteur de croissance neuronale
Cellule tueuse naturelle
Nanomètre
Site de liaison des amorces
Réaction de polymérisation en chaîne
Phycoérythrine
Phosphoglycérate kinase
Phénylméthanesulphonylfluoride
Polypurine tract
Virus recombinant adéno-associé
Rotation par minute
Élément de réponse à la protéine Rev
Virus du sarcome de Rous
Polymérisation en chaîne par transcriptase inverse
Simple brin
Site donneur d'épissage
Seconde
Auto-inactivant
Virus de l'immunodeficience simienne
Macrophage associé aux tumeurs
Élément de réponse de transactivation
Protéine transactivatrice de la transcription
Lymphocyte T auxiliaire de type 2
Thymidine kinase
Unité de transduction
Virus de l'immunodeficience acquise humaine
vin
VSV-G
WPRE
X-SCID
fiCi
Hg
Hl
Protéine G du virus de la stomatite vésiculaire
Élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l'hépatite de la
marmotte
Déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X
Microcurie
Microgramme
Microlitre
Liste des figures
INTRODUCTION
Figure 1. Essais cliniques de thérapie génique au niveau mondial depuis 1989 : indications.
Figure 2. Utilisation clinique des vecteurs de transfert.
Figure 3. Schéma de l'ADN proviral des rétrovirus.
Figure 4. a) Schéma général du génome lentiviral; b) Schéma du vecteur lentiviral
LentiGaBEGFP.
Figure 5. Production de lentivirus.
Figure 6. Cycle viral abortif d'une particule virale contenant un virus défectif véhiculant un
gène d'intérêt.
Figure 7. L'activité des macrophages dans les tumeurs : anti- ou pro-tumorale ?
RÉSULTATS
Figure 8. Galectine-3 est exprimée dans les macrophages activés dans des conditions
pathologiques du système nerveux central.
Figure 9. Expression de l'ARNm du gène de la galectine-3 dans différentes lignées
cellulaires in vitro.
Figure 10. Analyse de délétion du promoteur du gène de la galectine-3.
Figure 11. Analyse de transduction in vitro des vecteurs LentiGaBEGFP et
LentiCMVEGFP.
Figure 12. Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo.
Figure 13. Expression de la protéine EGFP dans des cellules microgliales transduites avec
le vecteur lentiviral CMVEGFP et co-injectées avec des cellules tumorales GL261.
Liste des tableaux
INTRODUCTION
Tableau 1. Vecteurs de transfert utilisés en thérapie génique et leurs principales
caractéristiques.
Tableau 2. Différents éléments régulateurs de l'expression et de la réplication du
lentivirus.
Tableau 3. Principales cytokines produites par les macrophages et leurs effets biologiques
dans l'inflammation et l'hématopo'tèse.
Tableau 4. Rôle de la galectine-3 dans l'inflammation.
Chapitre 1 : Introduction
Les macrophages sont des cellules multifonctionnelles impliquées dans différents
mécanismes de défenses immunitaires. Ils exercent leur rôle indispensable essentiellement
par leur propriété de phagocytose, par la capacité de dégrader les microorganismes ingérés
et de présenter des antigènes aux cellules T. De plus, ils sécrètent une centaine de
substances différentes, comprenant des cytokines impliquées dans la régulation des
réponses immunitaire et inflammatoire [1]. Toutefois, les macrophages détiendraient
également un potentiel pernicieux en contribuant à l'établissement et/ou à la progression de
plusieurs neuropathologies dont la sclérose en plaques [2-4] et la sclérose latérale
amyotrophique [5-8].
Issus des cellules souches hématopoïétiques, les progéniteurs des macrophages, les
monocytes, passent de la moelle osseuse vers le sang périphérique, puis pénètrent dans les
différents tissus où ils se différencient en macrophages. Dans le système nerveux central,
les monocytes peuvent se transformer en deux principaux types de macrophages : les
cellules microgliales et les macrophages périvasculaires. Il a été proposé que ce trafic
cellulaire pourrait être exploité afin d'introduire des gènes thérapeutiques à l'intérieur du
tissu nerveux affecté par une blessure ou une maladie [9-13]. Une des stratégies envisagées
serait d'introduire un gène dans ces cellules à l'aide d'un virus et de placer ce gène sous le
contrôle d'un promoteur connu pour être actif uniquement dans les macrophages cérébraux.
L'expression du transgène serait ainsi limitée à cette population cellulaire. Cependant, l'une
des difficultés majeures rencontrées dans le développement de cette stratégie est la
méconnaissance d'un gène spécifique aux macrophages cérébraux.
2
1.1 Thérapie génique
Le terme thérapie génique désigne un traitement qui consiste à introduire un gène dans des
cellules dans le but de restaurer une fonction ou d'en incorporer une nouvelle. L'intérêt que
suscite la thérapie génique pour le traitement des maladies neurodégénératives est soutenu
par de nombreux travaux expérimentaux qui ont démontré que cette reprogrammation
génétique peut protéger le système nerveux contre la mort cellulaire naturelle et celle qui
résulte d'un processus pathologique [14-17].
1.1.1 Historique
Depuis la première étude clinique de thérapie génique effectuée chez l'humain en 1989,
dans laquelle un retrovirus portant le gène de résistance à la néomycine fut utilisé pour
marquer les lymphocytes infiltrant les tumeurs chez des patients atteint d'un mélanome
[18], plus de mille autres études ont été entreprises [19]. Si de nombreuses recherches en
laboratoire ont été fructueuses, l'application clinique de la thérapie génique a eu un succès
mitigé. En 1999, un patient atteint d'une déficience en ornithine transcarbamylase (enzyme
impliquée dans le cycle de l'urée) est mort après avoir reçu une injection intrahépatique
d'un vecteur adénoviral [14, 18]. La réponse inflammatoire systémique qui s'en est suivie
était due au grand nombre de particules virales injectées. C'était la première victime
connue de cette technologie. En 2002, des bébés bulles, enfants souffrant d'un déficit
immunitaire combiné sévère lié au chromosome X (X-SCID), caractérisé par une absence
de lymphocytes T matures et de cellules NK, ont été traités avec un retrovirus. Il fut
démontré que la surexpression du transgène facilite le processus de transformation
conduisant à la leucémie [20]. Plusieurs essais ont été interrompus, d'autres ont pu être
repris en limitant la participation aux patients pour lesquels il n'existait pas d'autres
traitements. Malgré ces débuts difficiles, la thérapie génique n'a pas cessé de faire preuve
de son efficacité et de son innocuité dans des modèles animaux ainsi que chez l'homme.
Les traitements de nombreuses maladies considérées incurables ont ainsi pu être améliorés,
la grande majorité d'entre elles d'origine cancéreuse, tel qu'indiqué à la Figure 1.
3
■ Cancer 67% (n=842)
■ Maladies vasculaires 9% (n=113)
□ Maladies monogéniques 8.4% (n=106)
□ Maladies infectieuses 6.4% (n=81)
■ Marquage génétique 4% (n=50)
■ Autres maladies 3.7% (n=47)
■ Volontaires sains 1.7% (n=21 )
Figure 1. Essais cliniques de thérapie génique au niveau mondial depuis 1989 : indications
(adaptée de The Journal ofGene Médecine Clinical Trial site [19]).
1.1.2 Thérapie génique et système nerveux central : problèmes et solutions
L'application de la thérapie génique pour le traitement des maladies neurologiques est
néanmoins restée plutôt restreinte. Jusqu'en janvier 2007, seulement 29 études cliniques sur
1260 (2,3 %) portaient sur les glioblastomes (25), la sclérose en plaques (2) et la maladie
d'Alzheimer (2) [14, 19]. Plusieurs limites s'imposent toujours devant l'utilisation de ce
genre de traitement : la sécurité, l'inefficacité du transfert génique, la spécificité,
l'efficacité et la durée de l'expression du transgène.
En revanche, l'évolution des vecteurs utilisés en thérapie génique permet d'espérer
l'atteinte d'une expression ciblée, contrôlée et stable des transgènes. Ainsi, un vecteur
idéal :
•
serait facile à produire (pur et à un titre élevé);
•
permettrait l'insertion d'un gène thérapeutique de grande taille;
•
permettrait la transduction de cellules cibles de manière spécifique et efficace;
•
serait en mesure d'infecter des cellules en division et des cellules quiescentes;
I
•
exprimerait le transgène en quantité suffisante pour produire un effet thérapeutique
durable et sans effet secondaire;
•
s'intégrerait dans des loci cellulaires connus et sécuritaires;
•
permettrait la régulation du transgène selon les besoins [21-23].
1.1.3 Transfert de gènes in vivo et ex vivo
La difficulté d'accès des outils thérapeutiques au cerveau demeure un obstacle majeur.
L'existence de la barrière hémato-encéphalique, qui joue un rôle protecteur dans des
conditions normales, empêche le transfert de substances pharmacologiques à partir du sang
périphérique vers le cerveau [24]. Seulement certaines molécules (telles que l'oxygène, le
glucose, les stéroïdes, les nucléotides), certaines cellules immunitaires activées de façon
appropriée, sont capables de traverser cette barrière semi-perméable [25, 26]. Des agents
pharmacologiques, tels la bradykinine, un puissant vasodilatateur, ou le mannitol
hypertonique, ont été employés pour aider les vecteurs à pénétrer dans le cerveau en y
causant une rupture temporaire [27-29]. Cependant, un bris de la barrière hématoencéphalique peut avoir de graves conséquences, incluant la formation d'œdème et
l'introduction de pathogènes dans le cerveau [30].
Il est possible de transférer l'ADN thérapeutique dans le cerveau par l'injection directe du
vecteur (transfection in vivo) ou par le transfert indirect basé sur la transduction de cellules
ex vivo et leur réimplantation chez le patient. Une administration intracérébrale directe, mis
à part la diffusion limitée et la toxicité inhérente du vecteur, comporte des risques de
dommage mécanique pouvant entraîner la mort neuronale, l'inflammation, l'hémorragie,
l'infection et la gliose [14, 31]. D'autre part, la transduction ex vivo est limitée par le
nombre de cellules modifiées génétiquement qu'on peut réinjecter au patient [32]. De plus,
le problème de la cellule implantable est toujours irrésolu. Une solution pourrait venir de la
transplantation de cellules monocytaires ou de leurs précurseurs modifiés ex vivo, qui
migreraient dans le cerveau où ils se différencieraient et y délivreraient des gènes
thérapeutiques.
5
1.1.4 Vecteurs de transfert en thérapie génique
Pour transporter les gènes thérapeutiques et faciliter leur intégration dans la cellule, on peut
avoir recours à des vecteurs de transfert d'origine virale ou non-virale. Les vecteurs le plus
fréquemment utilisés dans les études cliniques sont montrés dans la Figure 2.
■ Adénovirus 26% (n=322)
■ Rétrovirus 23% (n=293)
P ADN nu 18%(n=230)
D Lipofection 7.9% (n=99)
■ Virus de la vaccine 7% (n=88)
■ Poxvirus6.8%(n=85)
■ Virus adéno-associé 3.7% (n=46)
□ HSV-1 3.4%(n=43)
■ Transfert d'ARN 1.3% (n=16)
■ Autres vecteurs 2.4% (n=31)
□ Vecteurs inconnus 2.9% (n=36)
Figure 2. Utilisation clinique des vecteurs de transfert (adaptée de The Journal ofGene
Médecine Clinical Trial site [19]).
Les principales caractéristiques des plus importants vecteurs ont été répertoriées dans le
Tableau 1 et seront abordées plus en profondeur dans les pages qui suivent.
6
Tableau 1. Vecteurs de transfert utilisés en thérapie génique et leurs principales
caractéristiques [15, 16, 23, 33, 34].
Vecteur
Capacité
d'empaquetage Tropisme
Intégration
Durée
Risque de
d'expression réponse
Désavantages
inflammatoire
ADN nu
Illimitée
Large
Episomal
Courte
Faible
Inefficacité du
transfert
génique
HSV-1
ADNdb
Jusqu'à 150 kb
Surtout
Épisomal
neurotropique
Courte sauf
dans les
neurones
Élevé
Risque de
recombinaison
Risque de lysc
de la cellule
hôte
Faibles titres
Adénovirus Jusqu'à 36 kb
ADNdb
Large
Episomal
Courte
Élevé
Risque de
recombinaison
AAV
ADNsb
5kb
Variable
selon
l'enveloppe
utilisée
Épisomal>90% Longue
Intégré<10%
Faible
Faible capacité
d'empaquetage
Rétrovirus
ARN
8kb
Cellules en
division
seulement
Intégré
Faible
Mutagenèse
insertionnelle
Longue
Faibles litres
Lentivirus
ARN
9kb
Variable
selon
l'enveloppe
ulilisée
Intégré
Longue
Faible
Mutagenèse
insertionnelle
Abréviations : sb, simple brin; clb, double brin.
1.1.4.1 Vecteurs non-viraux
Le fonctionnement des vecteurs non-viraux repose sur l'utilisation de l'ADN nu injecté
directement ou transporté par des liposomes, des nanoparticules ou d'autres moyens [22].
Leur plus grand avantage se situe au niveau de la sécurité (n'induisent pas de réponse
inflammatoire) ainsi que du coût et de la facilité d'utilisation. Le problème qu'ils présentent
concerne la cytotoxicité, le transfert génique inefficace et l'expression transitoire du
7
transgène, étant donné que l'ADN n'est pas intégré dans le génome de la cellule [22, 35,
36].
Les liposomes sont des molécules chargées positivement qui, lorsque mélangées avec de
l'ADN, se lient à ses groupements phosphates négatifs et forment le complexe
liposome/ADN. Ce complexe passe à travers la membrane cellulaire par un mécanisme
d'endocytose non-spécifique [23, 37]. Pour que le gène thérapeutique soit exprimé, l'ADN
doit évidemment être transporté dans le noyau de la cellule où la transcription a lieu.
L'obstacle principal de cette méthode est que ce transport nucléaire n'est observé que dans
un petit pourcentage de la population cellulaire ciblée.
Dans le but d'améliorer l'efficacité et la spécificité du transport ainsi que la longévité du
transgène, l'emploi de polymères synthétiques seuls [38-40] ou combinés aux différents
peptides ou protéines a été tenté. Les molécules qui ont démontré le plus de succès sont des
ligands spécifiques aux récepteurs cellulaires ayant la capacité de traverser la membrane
cellulaire et migrer dans le noyau, tels la protéine VP22 du virus HSV-1 [41] et le facteur
de transcription Tat du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) [42, 43].
1.1.4.2 Vecteurs viraux
1.1.4.2.1 Virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1)
Le virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1) est constitué d'une molécule d'ADN
double brin linéaire d'une taille d'environ 150 kb. Deux types de vecteurs HSV-1 existent :
des vecteurs recombinants et des amplicons. Les amplicons sont dérivés d'un plasmide
bactérien auquel sont intégrés des éléments du virus HSV-1 (séquences responsables de la
multiplication du virus et de la synthèse de l'enveloppe virale) [44]. Les amplicons
contiennent jusqu'à 15 copies du transgène, sont défectifs pour la réplication et non
pathogènes pour l'hôte [45]. Ils sont néanmoins produits à faibles titres ce qui limite leur
utilisation à des applications ex vivo [46]. Les virus recombinants contiennent deux ou
plusieurs segments d'acide nucléique provenant de virus différents (génome segmenté).
s
Dépendant de la position où le gène thérapeutique est inséré, un vecteur recombinant est
muté dans un ou plusieurs gènes viraux ce qui réduit sa toxicité [44].
Les principaux avantages que présente le HSV-1 sont sa grande capacité d'empaquetage et
le pouvoir d'infecter des cellules quiescentes. Ces vecteurs possèdent une affinité
particulière pour les neurones (neurotropiques) à l'intérieur desquels ils persistent dans un
état latent. L'inactivité du virus, cependant, entraîne l'inhibition du gène thérapeutique. Un
promoteur viral actif dans l'état latent comme LAP (latency-associated promoter) a déjà été
utilisé pour assurer une expression stable du transgène [22, 45, 47]. Le virus HSV-1
transduit efficacement des neurones et des cellules gliales [47]. Il est également capable de
délivrer au cerveau des facteurs neurotrophiques (NGF [48]) et neuroprotecteurs (protéine
anti-apoptotique Bcl-2 [49]). Il a été utilisé pour la thérapie génique dans différents
modèles expérimentaux de maladies neurologiques, dont le glioblastome [50].
Sa nature épisomale lui permet d'éviter les problèmes d'activation ou d'inactivation de
gènes cellulaires, ce qui est le cas avec des vecteurs intégrants comme les rétrovirus. Il faut
noter, néanmoins, qu'environ 80% de la population est porteur du virus sauvage, ce qui
peut être problématique en raison de la possibilité de recombinaison des deux virus alors
présents dans l'organisme [47] et de la diminution du transfert génique provoquée par
l'immunité développée contre le virus déjà présent [51]. Enfin, la lyse de la cellule hôte
lorsque le virus est dans sa phase lytique est un autre désavantage qui limite l'utilisation du
HSV-1 en thérapie génique.
1.1.4.2.2 Adénovirus
L'adénovirus est un virus non enveloppé à ADN double brin d'environ 36 kb. Plus d'une
cinquantaine de sérotypes existent dont les plus connus sont les sérotypes 2 et 5 [22, 52]. Il
est particulièrement approprié pour la thérapie génique en raison de sa stabilité, de la
possibilité de production à haut titre, de la facilité de manipulation et de son habileté de
transduire un grand nombre de types cellulaires, quiescents ou en division, incluant les
neurones [46, 53, 54]. Ce sont, d'ailleurs, les vecteurs les plus utilisés en clinique [19]. À
9
l'instar du virus HSV-1, l'adénovirus peut transporter une molécule d'ADN de grande taille
et n'est pas intégré dans le génome de la cellule [22]. L'avantage que cela représente est
l'absence du risque de mutagenèse insertionnelle. Le mauvais côté est que l'expression
transitoire du transgène rend l'adénovirus inapproprié pour le traitement de maladies
chroniques. En outre, une forte réponse pro-inflammatoire suite à la réadministration de
l'adénovirus a été notée [25, 53, 54]. La mort de la première victime de la thérapie génique
est, comme déjà mentionné, liée à l'administration d'un adénovirus. Le contrôle de la
réponse
inflammatoire
en
modifiant
le génome
adénoviral
pour en
diminuer
l'immunogénicité (le virus délété, « gutless » ou « high-capacity » adénovirus, est dépourvu
de tous les gènes viraux) ou en administrant des immunosuppresseurs ou des cytokines a
été rapporté [25, 52, 55, 56]. Dans d'autres études, afin de diminuer l'inflammation, les
macrophages étaient supprimés [57] ou des sérotypes différents d'adénovirus étaient
injectés [58].
1.1.4.2.3 Virus adéno-associé (AAV)
Le virus adéno-associé est un virus à ADN linéaire simple brin, non pathogène pour
l'homme [59, 60]. Les huit sérotypes connus infectent un grand nombre de cellules qu'elles
soient en cours de division ou quiescentes [34]. Ils nécessitent toutefois la présence d'un
virus auxiliaire (adénovirus ou virus de l'herpès) pour leur réplication [59]. Le virus
sauvage contient deux gènes codant pour des protéines de régulation et de réplication (rep)
et des protéines structurales (cap) entourés de régions ITR (inverted terminal repeat) [61].
Le virus recombinant (rAAV) n'encode pas pour les séquences rep et cap. Elles sont plutôt
portées par des vecteurs auxiliaires, ce qui résulte en une abolition de la réponse
inflammatoire, mais également en une perte de la capacité d'intégration [62]. Selon
certains, cette perte serait seulement réduite, n'étant due qu'au fait que des vecteurs rep'
s'intègrent ailleurs que dans le locus spécifique au virus adéno-associé de type sauvage
[61]. De toute manière, le rAAV assure une expression du transgène permanente même en
forme épisomale [63, 64]. On a démontré l'efficacité du transfert génique in vitro et in vivo
sous contrôle d'une variété de promoteurs dans les neurones, les cellules microgliales et les
10
astrocytes [59, 63, 65-67], ainsi que l'utilité des AAV dans l'étude de pathologies du
système nerveux central dans des modèles animaux [62].
La capacité d'empaquetage de l'AAV d'environ 5 kb est sa principale limitation. Son
habileté de former des concatémères après la transduction in vivo a été utilisée pour
circonscrire ce problème (recombinaison tête à queue des ITR). La transduction de cellules
par deux vecteurs rAAV, l'un codant pour la première partie de la protéine et l'autre pour la
deuxième, résulte ainsi en la reconstitution du gène fonctionnel [22, 23, 34]. L'expression
du transgène pourrait néanmoins en être réduite [68]. Le fait que le transgène ne soit
exprimé que plusieurs jours après l'injection du virus est un autre inconvénient. Un retard
de conversion de l'ADN simple brin en l'ADN double brin en serait la cause. Elle se ferait
donc plus lentement dans des cellules quiescentes et l'effet thérapeutique serait plus long à
obtenir. Le fait que jusqu'à 90% d'individus soient porteurs d'anticorps contre l'AAV qui
pourraient inhiber la transduction est un autre inconvénient lié à l'application de ce type de
vecteur [22, 60].
1.1.4.2.4 Rétro virus
Les rétrovirus sont des virus à ARN simple brin pouvant être classifiés selon leur
pathogénicité en :
•
oncorétrovirus
- induisent des tumeurs, des anémies et des syndromes
neurologiques; ex. MuLV (murine leukemia virus) et RSV (Rous sarcoma virus);
•
lentivirus - provoquent des maladies immunitaires et dégénératives à évolution
lente, d'où leur nom; ex. HIV (human immunodeficiency virus);
•
virus spumeux (spumavirus ou « foamy virus », FV) - ne démontrent pas de
symptômes particuliers [69].
Ils sont parmi les virus les plus fréquemment utilisés en clinique (voir Figure 2).
MLV proviral DNA (8.8 Kb)
V
mlii
iâ
(iAC
POI.
HNV
l i
l.'IR
I.TR
HIV-I proviral DNA (9.6 Kb)
NI:I-
RRl:
V
m
VPR l
vpu„. x
D lAL-Q
□
FV proviral DNA (12.3 Kb)
BITRm
GAG
rot
RI!V
ENV
□
fea
Bell BcO
U3
IIS
l.'IR
DHZZD
Ilcl2
Figure 3. Schéma de l'ADN proviral des rétrovirus (Kootstra and Verma, 2003 [33]).
Le génome rétroviral contient 3 gènes indispensables à la multiplication du virus (Fig. 3) :
gag qui code pour les protéines structurales; pol codant pour une protéase (l'aspartylprotéase), une transcriptase inverse et une integrase; et env qui encode la glycoprotéine
formant l'enveloppe virale et qui permet l'entrée du virus dans la cellule en reconnaissant
des récepteurs spécifiques à sa surface [33, 69]. Les rétrovirus comportent des séquences
non codantes appelées LTR (long terminal repeat) situées aux extrémités du génome viral
qui sont essentielles pour l'encapsidation, la transcription inverse et l'intégration du virus
dans le génome de la cellule hôte [33, 68].
Un des avantages que procure l'utilisation des rétrovirus est leur intégration stable qui
permet le transfert génique aux cellules-filles et une expression du transgène de longue
durée. Néanmoins, cette intégration se fait plutôt au hasard et comporte un risque de
mutagenèse insertionnelle. En effet, l'inactivation d'un gène suppresseur de tumeur et/ou
l'activation d'un oncogène pourraient conduire à la formation d'une tumeur [23]. À part le
lentivirus, les rétrovirus n'infectent que les cellules en division, ce qui les rend plus
sécuritaires pour les cellules non tumorales d'un côté, mais, d'un autre côté, cela empêche
leur application pour la transduction de cellules comme les neurones, les cellules souches
hématopoïétiques et les macrophages. De plus, leur utilisation est plutôt limitée à la
transduction de cellules ex vivo étant donné que les rétrovirus injectés par la voie
12
systémique sont rapidement inactivés par le complément [70]. Il est proposé que la réponse
inflammatoire qu'ils provoquent pourrait être due aux éléments spécifiques dans la
préparation virale plutôt qu'au vecteur lui-même [71]. L'optimisation de toutes les étapes
de la production est donc indispensable pour des études expérimentales dans les animaux et
surtout pour des études cliniques. Les titres des préparations rétrovirales obtenus sont assez
bas. Toutefois, en changeant d'enveloppe virale, ils peuvent être nettement augmentés [72,
73]. Enfin, les rétrovirus sont capables de recombinaison à très haute fréquence et le risque
de formation de virus compétents pour la réplication est plutôt élevé.
1.1.4.2.5 Lentivirus
1.1.4.2.5.1 Génome lentiviral
La famille des Lentiviridae, virus à ARN simple brin, regroupe plusieurs types de virus
infectant l'homme (H1V-1 et 2), le singe (simian immunodeficiency virus, SIV), le chat
(féline immunodeficiency virus, FIV), le cheval (equine infectious anémia virus, E1AV) et
d'autres espèces [74]. Ceux qui ont été développés pour une utilisation en thérapie génique
dérivent pour la plupart du virus HIV.
Outre les trois principaux gènes gag, pol et env, décrits dans la section précédente, qui
définissent la structure du virus, les lentivirus contiennent six autres gènes (tat, rev, vif, vpr,
vpu et nef) qui codent pour des protéines de régulation (Fig. 4a) :
•
Tat, une activatrice de la transcription;
•
Rev, qui régule le transport de l'ARN non-épissé hors du noyau;
•
Vif, qui est importante lors de l'assemblage de la particule virale;
•
Vpr, qui joue un rôle dans l'import nucléaire du génome viral;
•
Vpu et Nef qui régulent l'expression du récepteur CD4.
13
a)
TAR
4m
PBS
•
SD 41/E-DLS
0—D7
Éléments
c/s-actlls
cPPT
\
Leader
5'LTR
RRE
PPT
l 1
/
gag
m
pol
ver Tal ■
vpu
vil
tôt
fL,
3'LTR
rai-
Gènes
b)
Psi
5'-LTR
cPPT
RRE
WPRE
promoteur mGa 1-3
.
il l
Figure 4. a) Schéma général du génome lentiviral (Mangeot and Darlix, 2001 [74]);
b) Schéma du vecteur lentiviral LentiGal3EGFP.
Durant la replication, la région U3 (U pour unique) est recopiée en 5' et en 3' du provirus et
contrôle ainsi à la fois l'initiation, la terminaison de la transcription, et l'intégration [69].
En association avec une région de U5, elle détermine le site d'intégration du provirus dans
l'ADN cellulaire [69]. Elle est aussi liée à la pathogénicité du virus [75]. La courte région R
(redundant) permet la formation des LTR. Dans la séquence LTR du génome lentiviral se
trouve aussi la région « leader » (L) qui remplit plusieurs fonctions. Les fonctions de
différents éléments de régulation de l'expression et de la replication du lentivirus sont
résumées dans le Tableau 2.
14
Tableau 2. Différents éléments régulateurs de l'expression et de la replication du lentivirus
[69, 75-79].
Nom et abréviation
Fonction
TAR (Iransaclivation response élément)
Fixe la protéine Tal
SD (splice donor site)
Participe à l'épissage de l'ARNm viral
\|/, Psi (signal d'encapsidation)
Requis pour l'encapsidation des particules virales
PBS (primer binding site) et
PPT (polypurine tract)
Détiennent un rôle dans la synthèse de l'ADN
proviral
cPPT (central polypurine tract)
Améliore le transport nucléaire de l'ADN proviral
CTS (central termination séquence)
Forme avec le cPPT un segment d'ADN triple brin
(trip)
RRE (rev responsive élément)
Assure l'exportation de l'ARNm viral auquel est liée
la protéine Rev vers le cytoplasme
WPRE (woodehuck posltranscriptional regulatory
clément)
Séquence exogène ajoutée au vecteur lentiviral pour
augmenter l'expression du transgène porté par le
vecteur et le litre de la production
1.1.4.2.5.2 Avantages et limitations des vecteurs lentiviraux
Grâce à leur capacité d'accéder au noyau de la cellule-hôte sans qu'il y ait bris de la
membrane nucléaire qui est rompue lors de la mitose, les lentivirus sont capables d'infecter
des cellules quiescentes, d'où le grand intérêt de ces virus pour la thérapie génique [69]. D a
été noté qu'ils peuvent s'intégrer dans le génome cellulaire en plusieurs copies [80]. Ceci
améliore l'efficacité de la transduction et de l'expression du transgène, mais augmente,
toutefois, le risque d'oncogenèse insertionnelle. Pour augmenter la biosécurité des
lentivirus et leur efficacité, une réorganisation de leur génome en supprimant des éléments
reliés à leur pathogénicité ou en ajoutant des éléments de régulation optimisés (ex. WPRE)
a été essentielle (Fig. 4b). Les gènes nef, vif, vpr, vpu, associés à la replication du virus et à
sa pathogénicité, sont ainsi éliminés des vecteurs de deuxième génération [75, 77]. La
production de virus de troisième génération (virus auto-inactivants, S1N) qui consiste en la
délétion de quelques nucléotides dans la région U3 du 3'LTR minimise le risque
15
d'apparition de recombinants capables de se répliquer. L'absence du gène tat, un puissant
activateur de la transcription essentiel à la réplication du virus, est remédiée par l'ajout
d'une séquence promotrice en amont du transcrit [75]. La possibilité de remplacer le
promoteur viral par un promoteur tissu ou cellule spécifique ajoute à l'attrait de ces
vecteurs.
1.1.4.2.5.3 Production de vecteurs lentiviraux
A. (onctions auxiliaires : gag, pot, gènes régulateurs
HHH
( c j j ^ T W
W'.w.'.vaÊw.^
worféif™
vif
\ VPU
rev
SD AE/DLS
tat ,
rev
B. fonctions auxiliaires : env (pseudotype)
(CMV^
poïyÀ
Gène d'enveloppe
VSVG
Enveloppe Amphotroplque
C. vecteur lentiviral
il
»0
Leader
RRE
[CM
Ï'W
5'LTR/|\ ^
3'LTR
/ ! \ Gène rapporteur :
/ I \
GFP
PBS SD E/DLS lacZ
mcd2
Vecteur porteur
du transgène
Figure 5. Production de lentivirus (Mangeot and Darlix, 2001 [74]).
Tel qu'illustré à la Figure 5, la production de lentivirus se base sur la cotransfection de 3
plasmides dans une lignée cellulaire, telles que les cellules de tumeur de rein embryonnaire
humain 293T ou les cellules fibroblastiques humaines NIH 3T3 [81]. L'un des plasmides,
appelé le vecteur de transfert (C), code pour le transgène d'intérêt qui, dans des études
16
expérimentales, est fréquemment un gène rapporteur comme le GFP (green fluorescent
protein), le gène lacZ ou la luciférase {lue) sous le contrôle d'un promoteur d'intérêt [8284]. La présence des LTR assure l'intégration du transgène dans le génome de la cellule
hôte. Un deuxième plasmide, dit d'empaquetage ou auxiliaire (A), fournit les éléments
essentiels à la production du virus, excepté le gène de l'enveloppe. Les gènes portés par
cette construction ne sont pas encapsidés. Le troisième plasmide (B) code pour le gène de
l'enveloppe [74]. Cela permet de faire varier l'enveloppe selon les besoins (pseudotypage).
Le vecteur est encapsidé sous forme d'ARN dans un virion infectieux non propageable.
Une fois intégré dans la cellule hôte, seul le transgène est exprimé (Fig. 6).
Liaison récepteur
cellulaire et
glycoprotéine S U ^ t Z ;
Gène dïntfl rêt
B**
a
CELLULE CIBLE
Gène d'intérêt
Provirus défectif contenant la séquence d'encapsidation et le gène d'intérêt
=ï^™=3
N, /
ARN génomique viral
Protéines de Nucléocapside
Il
Transcriptase inverse et intégrase
JP
Protéines d'enveloppes SU et TM
Figure 6. Cycle viral abortif d'une particule virale contenant un virus défectif véhiculant
un gène d'intérêt (Masset et al., 2001 [69]).
17
1.1.4.2.5.4 Pseudotypage des lentivirus
Le pseudotypage des lentivirus avec différentes enveloppes peut augmenter leur stabilité
ainsi que leur tropisme, c'est-à-dire l'affinité du virus pour un type cellulaire, un tissu ou un
organe donné [16]. Ceci permet également d'améliorer le transfert génique et de minimiser
la toxicité [85]. Parmi les enveloppes les plus utilisées et les plus efficaces, on
retrouve celles des virus suivants : VSV (vesicular stomatitis virus) [71, 84, 86, 87], virus
de la rage [87], Mokola [84, 87], Ebola [84], LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus)
[84, 87, 88] et MuLV [84].
Le large tropisme de l'enveloppe du virus VSV (VSV-G), c'est-à-dire sa capacité d'infecter
un grand nombre de types cellulaires, est dû essentiellement à son habileté de reconnaître
des phospholipides membranaires comme récepteurs minimaux [89, 90]. Les virus
pseudotypés avec VSV-G sont également plus résistants à la désactivation par le
complément [73]. Ils peuvent être concentrés à hauts titres par ultracentrifugation et subir
des cycles gel/dégel sans que leur activité en soit affectée [72].
Les vecteurs lentiviraux pseudotypés avec différentes enveloppes transduisent efficacement
de nombreux types cellulaires : des neurones du cerveau de rats [75, 83, 87, 91-93], de
souris [31] et de singes, des neurones en culture [94], des cellules souches
hématopoïétiques [80], des macrophages primaires humains [91, 95, 96], des astrocytes
[31, 97] et des cellules dendritiques [78]. Malgré des résultats fort prometteurs dans des
études de maladies neurologiques utilisant des modèles animaux, les lentivirus ont été très
peu appliqués dans des études cliniques (8 études seulement) [19], en raison du danger que
représente la mutagenèse insertionnelle.
1.2 Macrophages cérébraux
Les macrophages cérébraux sont des cibles potentielles pour la thérapie génique, car ils ont
un rôle dans l'établissement et la progression de certaines conditions pathologiques du
système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et la sclérose latérale
!<S
amyotrophique [2-8]. Dans d'autres maladies, telles que la maladie d'Alzheimer et les
tumeurs cérébrales, leur rôle reste sujet à controverse [97-106]. Les macrophages
pourraient également être utilisés comme véhicules afin d'introduire des gènes
thérapeutiques à l'intérieur du tissu nerveux affecté par une blessure ou une maladie. Ceci
est possible grâce à la capacité unique des monocytes sanguins de traverser la barrière
hémato-encéphalique et se différencier en macrophages qui migreront ensuite vers la région
lésée.
1.2.1 Origine et caractéristiques des macrophages cérébraux
Les cellules souches sont des cellules qui donnent naissance à une multitude de types
cellulaires et qui sont nanties d'une capacité d'autorenouvellement. La moelle osseuse en
contient au moins deux populations : les cellules souches hématopoïétiques à l'origine de
toutes les cellules sanguines (les leucocytes, les érythrocytes et les plaquettes) et les
cellules mésenchymateuses dont dérivent les ostéocytes, les chondrocytes, les adipocytes et
les cellules musculaires lisses [98].
Originaires des cellules souches hématopoïétiques, les progéniteurs des macrophages, les
monocytes, quittent la moelle osseuse et entrent dans la circulation sanguine. Ils traversent
l'endothélium et pénètrent dans les différents tissus où ils se différencient. En fonction de
leur microenvironnement, les macrophages acquièrent des caractéristiques morphologiques
et physiologiques distinctes. Ainsi, différents types de macrophages existent : les cellules
microgliales et périvasculaires (cerveau), les cellules de Kiipffer (foie), les cellules
dendritiques (ganglions lymphatiques), les macrophages alvéolaires (poumons) et bien
d'autres [1].
Les macrophages périvasculaires sont des cellules d'une forme amiboïde ou allongée
situées entre la membrane basale qui entoure les vaisseaux sanguins et la glia limitans qui
délimite le parenchyme [99]. Les cellules microgliales se distinguent par leur morphologie
étoilée et leur localisation dans le parenchyme. La distinction phénotypique des deux types
cellulaires qui les discriminera des autres cellules monocytaires de l'organisme demeure un
19
problème majeur. Seulement la combinaison de plusieurs marqueurs membranaires et/ou
biochimiques permet de les caractériser avec plus de certitude. De plus, aucun gène
exprimé exclusivement dans les microglies ou les cellules périvasculaires n'est encore
identifié pour les distinguer les unes des autres. Quelques études ont cependant permis de
déterminer le profil phénotypique de la microglie. Ainsi, elles seraient CD45
+
CD1 lb , alors que les macrophages périvasculaires sont CD45
dcvc
e
et
[100-102]. On a aussi
noté que ces dernières expriment la protéine Ibal à des niveaux moins élevés par rapport
aux microglies [10].
1.2.2 Rôle des macrophages cérébraux dans des maladies du système nerveux
Les macrophages cérébraux, qui représentent environ 10% de la population gliale totale du
cerveau [103, 104], jouent un rôle critique dans les défenses immunitaires contre les
infections,
L'activation
l'inflammation,
des
les traumatismes et les maladies
macrophages
est
provoquée
par
tout
neurodégénératives.
changement
dans
leur
microenvironnement et dans l'intégrité structurale du cerveau. Dans le cas des cellules
microgliales, des canaux potassiques, les récepteurs de l'ATP, de l'acétylcholine et de la
noradrénaline pourraient y être impliqués [103, 105, 106]. Celles-ci réagissent en effectuant
des changements dans leur milieu ionique extracellulaire et en activant différentes voies de
transcription (ex.
NF-KB,
CREB) [105]. Suite à leur activation, les macrophages migrent
vers le site de la lésion, leur morphologie devient plus arrondie, leur capacité phagocytique
augmente et certaines propriétés phénotypiques changent (ex. induction et/ou augmentation
de l'expression de plusieurs récepteurs membranaires dont le CMH de classe I et II, le CD4
et les différentes molécules d'adhésion) [103].
Les macrophages activés sécrètent de nombreux
médiateurs cytotoxiques et/ou
inflammatoires, tels que les cytokines et les chimiokines. Les cytokines sont des petites
protéines solubles qui permettent aux macrophages d'induire des modifications chez
d'autres cellules, tandis que les chimiokines induisent le recrutement cellulaire. Les effets
biologiques dans l'inflammation et l'hématopoïèse des principales cytokines sécrétées par
des macrophages sont présentés dans le Tableau 3.
20
Tableau 3. Principales cytokines produites par les macrophages et leurs effets biologiques
dans l'inflammation et l'hématopoïèse (adapté de Caron and Dornand, 2002 [107]).
Cytokine
Effets biologiques dans l'inflammation et l'hématopoïèse
IL-I (a/|3)
Induction de la sécrétion de PGE2 par effet autocrine, prolifération des astrocyles et des cellules
endothéliales, induction de molécules d'adhérence sur les cellules endothéliales et les
neutrophiles, augmentation de l'hématopoïèse induite par CSF, induction de la sécrétion de
cytokines par les lymphocytes T et les monocytes.
IL-IRA
Antagonisme des effets de l'IL-1 (o/p).
IL-6
Augmentation de l'hématopoïèse et de la maturation des mégacaryocytes, prolifération des
lymphocytes, différenciation des lymphocytes B en cellules productrices d'IgG, et des T en
lymphocytes T cytotoxiques, activation des astrocytes et des cellules microgliales.
Chimiokines (IL-8,
MIP-l(a/p), MIP-2,
IP-10, MCP-l,2et3,
RANTES)
Chimiotactismc des lymphocytes, ncutrophiles, monocytes, basophiles et activation des
neutrophiles, monocytes, lymphocytes.
IL-10
Inhibition de la production de cytokines par les lymphocytes T et les monocytes, inhibition de la
capacité des monocytes à présenter l'antigène, désactivation des macrophages, stimulation de la
prolifération des mastocytes dépendante de l'IL-3 et de l'IL-4 et de la différenciation des
cellules B.
IL-12
Induction de la production d'IFNy par les cellules T et NK, activation de la différenciation des
lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK.
IL-13
Induction de la production de cytokines inflammatoires. Réduction de la production du TNFa et
duMIP-la.
IL-15
Différenciation et activation des lymphocytes T et des cellules NK.
IL-18
Induction faible de la production d'IFNy par les cellules NK et les lymphocytes T.
Amplification des fonctions de l'IL-12 (activité synergique de l'IL-12 et IL-18).
IFNa/p
Inhibition de la prolifération cellulaire, activation de la cytotoxicité des monocytes et de leur
capacité à produire des cytokines et a présenter l'antigène.
TNFa
Stimulation de la production de cytokines par les monocytes et les lymphocytes T, activation
des polynucléaires, des macrophages, stimulation de la prolifération des lymphocytes T et B,
stimulation de la capacité des monocytes et des cellules dendritiques à présenter l'antigène,
inhibition de la granulopoïèse et de l'érythropoïèse, stimulation de la cytotoxicité lymphocytaire
T et cytotoxicité vis-à-vis de cellules tumorales.
TGFP
Inhibition de la prolifération des lymphocytes T et B et des cellules endothéliales, désactivation
des monocytes et des macrophages, stimulation de la synthèse de la matrice extraccllulairc.
M-CSF
Prolifération et différenciation des précurseurs monocytaircs, induction de la production de
cytokines par les monocytes.
G-CSF
Prolifération et différenciation des précurseurs granulocytaires, induction de la production de
cytokines par les granulocytes.
GM-CSF
Prolifération des précurseurs granulocytaires et monocytaires, activation des polynucléaires, des
monocytes, des éosinophiles, des basophiles et des cellules dendritiques.
21
Les macrophages activés sécrètent non seulement différents facteurs protecteurs et
trophiques comme le BDNF (brain-derived neurotrophic factor) [103, 108], mais aussi des
molécules toxiques, telles que le monoxyde d'azote, les radicaux libres de l'oxygène et les
enzymes lysosomales [105]. L'effet
des macrophages cérébraux peut ainsi être
contradictoire, bénéfique ou nocif, selon la pathologie en question et selon son stade
d'avancement.
1.2.2.1 Macrophages et tumeurs cérébrales
Les gliomes sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives. Malgré
les traitements qui consistent en une chirurgie, une radiothérapie et une chimiothérapie,
l'espérance de vie des patients qui en sont atteints n'est que d'environ I an [109]. La
thérapie génique pourrait constituer une solution intéressante pour le traitement de ce type
de tumeurs. Des résultats très prometteurs ont été obtenus chez l'animal, mais les bénéfices
de ces nouveaux traitements chez l'humain, en termes de qualité de vie et de survie,
demeurent modestes.
Il a été établi qu'une place importante dans la composition des tumeurs malignes, dont les
glioblastomes, est détenue par des macrophages. Ces macrophages, aussi appelés les TAM
(tumor-associated macrophages), sont pour la plupart dérivés des monocytes du sang [110,
111]. Certains d'entre eux proviennent de la prolifération de macrophages résidents [112].
Les macrophages phagocytent les cellules tumorales apoptotiques et présentent des
antigènes tumoraux aux cellules T stimulant ainsi la réponse immunitaire [113, 114]. Il a
été démontré que le volume de la tumeur est réduit suite à l'expression d'une cytokine proinflammatoire sécrétée par les macrophages, le facteur TNF, grâce à laquelle les
macrophages promouvoient leur propre recrutement et favorisent la formation de
microcavités [111]. Toutefois, les cellules tumorales sont capables de profiter de certaines
des molécules sécrétées par les macrophages pour promouvoir leur propre survie et leur
croissance. Parmi ces molécules pro-tumorales, on retrouve celles qui favorisent
l'infiltration, l'immunosuppression, l'angiogenèse, la prolifération et les métastases. Un
exemple de molécules sécrétées par les TAM est donné dans la Figure 7.
22
Pro-angiogenic cyiokina
and enzymes
Cylokiiies (cg.
iiuimmo.stimulatory)
Réactive Oxygcn and
Nilmgcn Specics
Cliciimkincs(ci;.
lui lymphocytes)
Cytokincs (mitogens
and immunosuppressiv
fuctnrs)
Tumourcell
lysis
Tissuc Facloi/uPA
Mclalloproleascs (wide
range)
KL-iiLiive Oxygen
ami Nilrogen Spct ICS
Mclalloproteascs
(MMP7.9and
12)
ANTITUMOUR
PROTtMOUR
Figure 7. L'activité des macrophages dans les tumeurs : anti- ou pro-tumorale ? (Bingle et
al., 2002 [110])
Les macrophages sont déjà présents dans les tumeurs, alors pourquoi ne pas exploiter cette
présence plutôt que d'y introduire d'autres types de cellules qui, normalement, ne s'y
retrouvent pas? Le développement de nouveaux outils moléculaires, comme celui présenté
dans cette étude, pourrait renforcer l'intérêt de cette stratégie de thérapie génique et
permettre d'améliorer les traitements actuels.
1.2.3 Thérapie cellulaire des maladies du système nerveux
L'utilisation de véhicules cellulaires en thérapie génique et leur application clinique sont à
l'étude depuis plusieurs années. Les myoblastes, par exemple, ne se sont pas montrés
optimaux en terme de survie et d'expression du transgène [115], tandis que l'utilisation de
cellules souches embryonnaires soulève de sérieux questionnements éthiques. Une autre
méthode thérapeutique proposée contre les maladies du système nerveux est celle de la
macroencapsulation par membrane semi-perméable qui permet d'implanter dans le cerveau
des cellules de tout type sans risque de réponse immunitaire ou de formation de tumeur
[32]. L'efficacité de cette technique a été démontrée chez des patients atteints de la sclérose
23
latérale amyotrophique auxquels on a transplanté des cellules sécrétant le CNTF (ciliary
neurotrophic factor) [116, I 17]. Les fibroblastes ont été utilisés pour délivrer le facteur
neurotrophique NGF dans le cerveau de patients Alzheimer avec un succès qui reste à être
confirmé [118]. Plusieurs études rapportent également un potentiel intéressant des cellules
souches neurales pour le remplacement des neurones [119-121], mais aussi des cellules de
type glial, tels les oligodendrocytes [122, 123]. Leur possible utilisation pour le traitement
des tumeurs cérébrales a aussi été démontrée [124-126]. Parmi les autres types de cellules
utilisées, mentionnons aussi les cellules souches mésenchymateuses qui présentent la même
difficulté de contrôle de différenciation et de migration aux sites spécifiques que les
cellules souches neurales [127].
1.2.3.1 Macrophages cérébraux comme véhicules cellulaires dans la thérapie génique
des maladies du système nerveux
Le transfert indirect basé sur la transduction ex vivo de cellules monocytaires ou de leurs
précurseurs, qui migreraient dans le cerveau où ils se différencieraient et y délivreraient des
gènes thérapeutiques, représente une alternative prometteuse dans le traitement des
maladies du système nerveux. La reconstitution du système hématopoïétique soumis à un
traitement myéloablatif (ex. radiation létale), suite à la transplantation des cellules de la
moelle osseuse et la migration des cellules différenciées dans le cerveau, a confirmé
l'efficacité de ce type de transport cellulaire. En effet, l'analyse de la différenciation de
cellules de la moelle osseuse provenant des souris transgéniques exprimant la protéine
fluorescente GFP et transplantées dans des souris dont le système hématopoïétique a été
supprimé par irradiation, a démontré la capacité de ces cellules d'infiltrer le système
nerveux central et se transformer en cellules microgliales et perivasculaires [98, 128-130].
De plus, le nombre de cellules microgliales nouvellement formées à partir de monocytes se
voit augmenter considérablement dans différentes conditions neuropathologiques [9-13].
Bien que la plupart des macrophages cérébraux dérivent des monocytes sanguins, un
certain nombre d'entre eux sont également formés après la division de macrophages
préexistants [131, 132]. L'avantage principal des monocytes par rapport à d'autres types de
véhicules cellulaires repose donc sur leur capacité de transporter et d'exprimer des gènes
24
thérapeutiques à l'endroit exact où le tissu nerveux est affecté par une blessure ou par une
maladie. Cependant, l'absence de moyen efficace pour limiter l'expression du transgène
dans l'une ou l'autre des populations de macrophages cérébraux qui populent la région
affectée constitue un obstacle majeur à l'utilisation clinique de cette approche.
1.3 Utilisation d'un promoteur spécifique aux macrophages cérébraux
pour la thérapie génique
Afin d'exprimer ou d'inhiber des gènes d'intérêt exclusivement dans les macrophages
cérébraux, le contrôle de leur expression par un promoteur génique spécifique à cette
population est crucial. Cependant, un tel promoteur n'a pas encore été identifié. Comme
alternative, on pourrait
se servir d'un
promoteur d'un
gène qui serait actif
préférentiellement dans les macrophages cérébraux activés dans différentes conditions
pathologiques du cerveau, comme c'est le cas avec le gène de la galectine-3.
1.3.1 Galectine-3
Les galectines sont des protéines appartenant à la grande famille de lectines animales avec
lesquelles elles partagent un domaine de liaison aux carbohydrates [133]. Leurs fonctions
ne sont connues que partiellement, mais l'affinité de liaison aux P-galactosides est
commune aux 15 galectines identifiées jusqu'à aujourd'hui [134]. La galectine-3 est l'une
des galectines les plus étudiées, à cause de son implication dans une multitude de processus
physiologiques et pathologiques.
La galectine-3, aussi appelée Mac-2, est une protéine d'environ 30 kDa encodée par un
gène composé de 6 exons et 5 introns qui s'étendent sur une longueur de 17 kb [135-139].
Elle contient un domaine N-terminal riche en proline et en glycine, et un domaine COOHterminal dans lequel on retrouve le domaine de liaison aux hydrates de carbone. Décrite
pour la première fois par Ho et Springer en 1982 [140] comme une protéine exprimée à la
surface des macrophages, sa présence a ensuite été décelée aux niveaux intracellulaire
25
(cytoplasme et noyau) et extracellulaire (membrane plasmique et espace extracellulaire)
dans plusieurs autres lignées. Parmi les cellules qui peuvent exprimer la galectine-3, on
retrouve les monocytes et les différents macrophages : les cellules microgliales, les cellules
de Kupffer, les cellules dendritiques, les cellules alvéolaires, ainsi que les cellules de
Schwann, les fibroblastes, les cellules épitheliales de l'intestin et du rein [136, 141-146]. La
protéine sécrétée ne contient pas de séquence signal; elle est donc exportée par un
mécanisme de sécrétion alternatif [147]. La protéine ne possède pas de domaine
transmembranaire non plus et nécessite la présence d'un ligand pour s'attacher à une
cellule. La diversité d'effets qu'elle exerce sur différents types cellulaires révèle la grande
variété de récepteurs spécifiques à la galectine-3. Quelques glycoprotéines liant la
galectine-3 sont connues, dont :
•
lalaminine;
•
la fibronectine;
•
les glycoprotéines de la matrice : la tenascine-C et R;
•
les molécules d'adhésion neurale : Ll, N-CAM et MAG (myelin associated
glycoprotein) [148];
•
CD32 (FcyRII) sur les éosinophiles [ 149] ;
•
CD29 (intégrine p 1 ) et CD7 sur les cellules T [ 150] ;
•
CD66 sur les neutrophiles [151]
•
Mac-1 (CDllb/CD18), LAMP-1 et 2 (lysosomal membrane glycoproteins), CD98
et Mac-3 sur les macrophages [152].
1.3.2 Fonctions biologiques de la galectine-3
Les niveaux d'expression et la fonction de la galectine-3 sont en relation avec sa
localisation, ainsi qu'avec le type, l'état de prolifération et le microenvironnement de la
cellule qui l'exprime. La forme extracellulaire agit au niveau de l'activation des cellules, de
l'interaction cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire, de l'induction de la migration
de monocytes, de macrophages et de cellules endothéliales [153-156]. La forme
26
intracellulaire joue plutôt un roie
rôle uaus
dans il'épissage
epissage cde l'ARN messager, la régulation du cycle
cellulaire, l'apoptose et la phagocytose [157-159].
1.3.2.1 Galectine-3 et inflammation
L'induction de la migration des monocytes et des macrophages par la galectine-3 suggère
une participation importante de cette dernière dans l'inflammation [156]. La réponse
inflammatoire est atténuée suite à une mutation du gène de la galectine-3 [160] et à son
inactivation [161]. Ce sont les facteurs de transcription NF-KB et Jun qui seraient impliqués
dans la régulation de son expression [162]. Il a également été démontré que la galectine-3
supprimerait l'expression de l'interleukine-5, en suggérant qu'elle aurait aussi un effet antiinflammatoire [163]. Des effets multiples, anti- ou pro-inflammatoires, de la galectine-3 sur
différents types de cellules immunitaires sont résumés dans le Tableau 4.
Tableau 4. Rôle de la galectine-3 dans l'inflammation (adapté de Rubinstein et al., 2004
[164]).
Type de cellule immunitaire
Effet de la galectine-3
Macrophages
îChcmotaxic
t Phagocytose
f Production de l'IL-1 induite par la LPS
| Apoptose
Cellules T
l Apoptose (galectine-3 intracellulaire)
t Apoptose (galectine-3 extracellulaire)
f Prolifération
î Interaction entre les lymphocytes T naïfs et les
cellules dendritiques
l Adhésion des thymocyles
Neutrophiles
f Activation
t Adhésion à la laminine
î Extravasation en réponse à une infection
î Activité NADPH oxydase
Cellules B
Régulation de la survie des cellules B de mémoire
induite par l'IL-4
Basophiles et mastocytes
î Activation
Éosinophiles
| Production de l'IL-5
27
Le rôle de la galectine-3 dans la réponse inflammatoire a aussi été étudié à l'extérieur du
système nerveux central. Une lésion du système nerveux périphérique suivie d'une
dégénération Wallérienne, par exemple, induit l'expression de la galectine-3 par des
macrophages recrutés au site de la lésion et par des cellules de Schwann et, par conséquent,
la phagocytose de la myéline par ces deux types cellulaires [143, 145]. Il faut noter
toutefois que le rôle des cellules de Schwann dans la phagocytose est sujet à controverse.
La capacité phagocytaire et la rapidité de la dégénération Wallérienne seraient ainsi
dépendantes du niveau d'expression de la galectine-3 [143].
1.3.3 Galectine-3 dans le cerveau
La galectine-3 est fréquemment utilisée comme marqueur de l'activation et de la
différenciation des monocytes, des macrophages et de la microglie [138]. Ce qui a attiré
notre attention est effectivement le fait que la galectine-3 soit absente de la microglie
résidente du cerveau normal. Par contre, une forte expression de celle-ci dans les
macrophages activés a été rapportée dans de nombreuses études in vivo, surtout suite à une
lésion ou à une maladie du système nerveux central. La galectine-3 est également exprimée
par les cellules microgliales in vitro [165-167].
Les niveaux d'activation des cellules qui influent sur les niveaux d'expression de la
galectine-3 sont dépendants du type de lésion du système nerveux. Ainsi, dans le cas de
l'axotomie du nerf facial, où il y a l'absence du bris de la barrière hémato-encéphalique et
l'absence de la réponse inflammatoire, la galectine-3 n'est pas exprimée. Dans le cas de
l'ischémie cérébrale, où on observe le bris de la barrière hémato-encéphalique et une forte
inflammation, son expression se voit fortement augmentée autant dans la microglie
résidente que dans les macrophages recrutés du sang [167]. Dans le cas de la dégénération
du nerf optique, son expression est plutôt sporadique, ce qui s'explique par une activation
déficiente de la microglie [165]. Dans un modèle expérimental de la sclérose en plaques,
l'EAE (expérimental allergie encephalomyelitis), la galectine-3 est aussi présente [168].
28
1.4 Objectifs du projet
Le but général de ce projet de recherche était de valider la faisabilité de la méthode qui
consiste en l'introduction d'un gène extrinsèque dans les macrophages cérébraux à l'aide
d'un lentivirus, placé sous contrôle d'un promoteur connu pour être actif préférentiellement
dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons établi 4 objectifs spécifiques: 1) identifier un
gène exprimé de façon préférentielle dans les macrophages cérébraux activés dans
différentes conditions pathologiques du cerveau en utilisant l'hybridation in situ et
l'immunofluorescence ; 2) caractériser le promoteur de ce gène par des analyses de délétion
en transfection transitoire afin de déterminer la longueur minimale du promoteur capable
d'assurer une expression robuste et durable du transgène, pour ne pas limiter inutilement la
capacité d'empaquetage du virus ; 3) utiliser ce promoteur pour la conception d'un vecteur
lentiviral dont l'efficacité sera testée dans une série d'expériences in vitro; et 4) explorer la
possibilité d'utilisation des cellules microgliales transduites comme vecteurs pour la
thérapie génique en les transplantant dans un cerveau sain ou dans une tumeur.
Chapitre 2 : Matériel et méthodes
2.1 Etude de l'expression de la galectine-3
2.1.1 Hybridation in situ
La détection des ARNm codants pour la galectine-3 sur des coupes de cerveau a été réalisée
selon le protocole déjà décrit [111]. Les modifications suivantes y ont été apportées : la
sonde antisense d'ARNm a été transcrite à partir d'un ADNc de la galectine-3 de 1159
paires de bases et appliquée sur les lames à une concentration de 2 x 106 cpm/ml.
L'hybridation a été effectuée pendant 16 h à 60°C. Après la post-hybridation, les lames ont
été exposées sur un film pendant 20 h. Suite à l'autoradiographie, les lames ont été
dégraissées, trempées dans de l'émulsion photographique, exposées à 4°C pendant 17 jours,
développées, fixées, contre-colorées, déshydratées et montées avec du milieu DPX.
2.1.2 Immunofluorescence
Les tranches de cerveau ont été incubées dans du KPBS (potassium phosphate-buffered
saline; 0.45 g KH 2 P0 4 , 3.8 g K 2 HP0 4 , 8.1 g NaCl dans l 1 d'eau) contenant 5% de sérum
de chèvre et 0.4% de Triton X-100 pendant 30 minutes, avant d'être placées à 4°C pendant
toute la nuit dans la même solution contenant cette fois-ci les anticorps anti-Gal3 de rat
(1 : 500, American Type Culture Collection) et anti-GFP de lapin (1 : 1000, Molecular
Probes) ou la combinaison d'anticorps anti-Gal-3 de rat, anti-Ibal de lapin (1 : 2000, Waco
Chemicals) et anti-NeuN de souris (1 : 5000, Molecular Probes). Le lendemain, les coupes
ont été incubées durant 2 h à la température ambiante avec les anticorps secondaires de
chèvre anti-rat Rhodamine Red-X (1 : 500, Jackson ImmunoResearch) et anti-lapin Alexa
Fluor 488 (1 : 500, Molecular Probes), seuls ou combinés avec l'anticorps anti-souris Alexa
Fluor 633 (1 : 500, Molecular Probes). Chacune de ces étapes a été suivie de quatre
rinçages de 5 minutes dans du KPBS. Les coupes ont ensuite été montées sur des lames
gélatinées, contre-colorées avec 2 ^g/ml de diamidinophénylindole (DAPI, Molecular
Probes) pendant 1 minute, rincées à l'eau et montées avec du milieu PVA Dabco.
30
2.1.3 RT-PCR
L'ARN total a été extrait avec le TRIzol (Invitrogen) à partir des cellules BV2 (microglies),
Heplclclc7 (hepatocytes), F20 (fibroblastes), C2C12 (myoblastes), N2A (neuroblastes) et
GL261 (cellules de gliome). L'intégrité des échantillons d'ARN a été confirmée par
électrophorèse sur gel d'agarose. Les échantillons d'ARN ont été analysés en utilisant le kit
« one-step
RT-PCR »
(BD
Pharmingen)
avec
les
amorces
suivantes:
Gal-3,
5'-CTTAACGATGCCTTAGCTGGCTCTGGA-3' et 5'-CAGATCCTCCTGAGACAGGT
CAGGTCC-3'; p-actine, 5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3' et 5'-CTCTTTGATGT
CACGCACGATTTC-3'. Les produits de PCR (Gal-3, 1 159 pb ; p-actine, 540 pb) ont été
séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% et visualisés à l'aide de bromure
d'éthidium.
2.2 Analyse du promoteur de la galectine-3
2.2.1 Purification de l'ADN génomique
Des bouts de queues de souris C57BL/6 ont été coupés en petits morceaux et placés dans
un eppendorf contenant 100 ul de tampon de lyse pH 8.3 (0.121 g Tris, 0.186 g EDTA,
2.46 g sodium acétate, 1 ml Triton X-100 dans 100 ml d'eau) et 2.5 ul de protéinase K
(20 mg/ml). Les échantillons ont été incubés à 55°C pendant la nuit, centrifugés 1 minute à
3000 rpm, dilués vingt fois dans de l'eau et chauffés 5 minutes à 95°C pour détruire la
protéinase K.
2.2.2 Construction des vecteurs Gal3-pCAT
L'amplification du promoteur de la galectine-3 pleine longueur (2624 pb) à partir de l'ADN
génomique a été effectuée à l'aide de la polymérase Platinum Pfx (Invitrogen) et des
amorces sens 5'-CCGATGGGCAGTGAAGACCTAAGTTCG-3' et antisens 5'-TGAGCC
ACAACCTACGGAGATCCACCT-3'. À partir de l'amplicon obtenu, les différents
segments du promoteur Gal-3 ont ensuite été amplifiés en utilisant l'amorce antisens
5'-CCAAGAAAGGGCTGGGCTCCC-3' et les amorces sens : -589Gal-3, 5'-GCCCCTTG
31
CCCGTGCTGTA AC-3 ' ;
-1011 Gal-3,
5 ' -GGG ATTG ACCGGG A AGC AGGT-3 ' ;
-1594Gal-3, 5'-CATCCCTGGTGGCCTCAAATCG-3'; -2157Gal-3, 5'-TGGCAACCAT
TTCAGCTGTCCA-3'. Les conditions de PCR ont été identiques pour tous les
échantillons : une étape de dénaturation initiale à 94°C de 2 minutes, suivie de 35 cycles à
94°C pendant 15 sec, 55°C pendant 30 sec et 68°C pendant 3 minutes. Une étape
d'élongation finale a été effectuée à 68°C pendant 2 minutes. Leur identité a été confirmée
par séquençage automatique (Plateforme de séquençage et de génotypage du Centre de
recherche du CHUL). Les promoteurs ont été digérés avec les enzymes Sali et Xbal (New
England Biolabs) et sous-clonés dans le vecteur pCAT-Basic (Promega) préalablement
digéré avec les mêmes enzymes et déphosphorylé avec la phosphatase alcaline (Roche). La
ligation a été effectuée avec la T4 DNA ligase (New England Biolabs) et la transformation
avec des bactéries compétentes DH5a.
2.2.3 Culture cellulaire
Des cellules microgliales BV2, des fibroblastes F20, des neuroblastes N2A et des cellules
tumorales GL261, ont été cultivées à 37°C, sous 5% de C0 2 , dans le milieu de culture
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium, Wisent) contenant 10% de sérum bovin
fœtal inactivé à la chaleur, 100 U/ml de pénicilline et 100 \ig/m\ de streptomycine. Avant
l'utilisation, les cellules ont été incubées à 37°C avec de la trypsinc 0.25% (Invitrogen),
rincées et resuspendues dans du tampon DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline,
Invitrogen).
2.2.4 Transfection
Des cellules ont été cultivées pendant 24 h dans des plaques à 6 puits à une densité de
1 x 106/puit pour les cellules microgliales BV2 ou 3 x 107puit pour les fibroblastes F20 et
les neuroblastes N2A. Elles ont ensuite été transfectées en utilisant la Lipofectamine
(Invitrogen) selon le protocole du manufacturier. Brièvement, 1.5 u.g de l'un des vecteurs
Gal3-pCAT et 0.5 u.g du plasmide contrôle pXGH5 ont été ajoutés par puit. L'ADN
plasmidique avait été préalablement enrobé de 6 \i\ de réactif Plus suivi de 6 u.1 de
M
Lipofectamine. Ce complexe lipidique a été ajouté à chacun des puits contenant 800 fil de
milieu DMEM sans sérum nouvellement changé. Après 3 h d'incubation, 1 ml de DMEM
contenant 20% de sérum bovin fœtal a été rajouté. Le milieu a été changé 8 h après le début
de la transfection et les cellules ont été analysées pour l'expression génique transitoire par
essai CAT après 48 h. Un plasmide CAT sans promoteur et un plasmide contenant le
promoteur RSV ont servi de contrôles négatif et positif, respectivement. Toutes les analyses
ont été effectuées en triplicata.
2.2.5 Essai CAT
Les niveaux d'activité de CAT ont été déterminés selon le protocole déjà publié [169].
Brièvement, les cellules ont été récoltées dans un tampon contenant 15 mM de Tris pH 8.0,
60 mM de KC1, 15 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 0.15 mM de spermine, I mM de
dithiothréitol et 0.4 mM de PMSF, puis lysées par trois cycles d'incubation de 5 minutes
sur glace sèche et à 37°C. Les débris cellulaires ont été enlevés après deux centrifugations à
14 000 rpm pendant 5 minutes, la première étant suivie d'une incubation de 10 minutes à
70°C. 0.2 fiCi de chloramphénicol dilué vingt fois avec du 0.25 M Tris pH 8.0 et extrait
deux fois avec deux volumes de xylène, et 5 \i\ de bulyryl-CoA ont été ajoutés par essai.
Après une incubation de 18 h à 37°C, une extraction au xylène et deux dilutions des
échantillons avec 0.25 M de Tris pH 8.0, ont précédé le compte de la radioactivité dans un
compteur-(3. Les niveaux d'activité de CAT pour toutes les cellules transfectées ont été
normalisés par rapport à la quantité de hGH sécrétée dans le milieu de culture (encodée par
le plasmide cotransfecté pXGH5).
2.2.6 Dosage de la hGH
Le niveau de hGH a été mesuré avec une trousse radioimmunologique (hGH IRMA Solid
Phase, Medicorp) en suivant le protocole fourni par le manufacturier.
33
2.2.7 Dosage des protéines
La quantité de protéines contenues dans les échantillons provenant des cellules transfectées
a été dosée par la méthode de Bradford [170]. Un mélange d'extrait cellulaire et de réactif
de Bradford a été incubé 10 minutes à la température de la pièce avant d'en avoir mesuré la
densité optique à une longueur d'onde de 595 nm. Les valeurs comprises entre 0.1 et 0.35
ont été retenues.
2.3 Conception du vecteur lentiviral et validation de son efficacité
2.3.1 Construction du vecteur lentiviral pHR-Gal3-EGFP
Après avoir déterminé la longueur optimale du promoteur, celui-ci a été extrait du vecteur
-2157Gal3-pCAT en utilisant les enzymes Spel et Sali (New England Biolabs) et ligué dans
le vecteur pCR-BluntlI-TOPO. Le gène EGFP (729 pb) a été amplifié par PCR à partir du
vecteur
lentiviral
pHX-CMV-EGFP
[84]
à
l'aide
des
amorces
sens
5'-ATCATCGTCGACGCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3' et antisens 5'-CGGCATGG
ACGAGCTGTACAAGTAAGGATCCAAT-3'. Le PCR incluait une étape de dénaturation
initiale à 94°C pendant 2 minutes, suivie de 35 cycles à 94°C pendant 15 sec, 55°C pendant
30 sec et 68°C pendant 1 minute. L'étape d'élongation finale a été effectuée à 68°C
pendant 10 minutes. L'amplicon a été digéré avec les enzymes BamHl et Sali et ligué dans
le plasmide pCR-BluntII-TOPO-Gal3. Le fragment Gal3EGFP a ensuite été extrait en
utilisant les enzymes Spel et BamHI et introduit dans le vecteur lentiviral pHR-cPPTWPRE.
2.3.2 Production de lentivirus
La production de lentivirus a été exécutée selon le protocole publié antérieurement [171].
Les cellules 293T ont été transfectées par la méthode phosphate de calcium. Pour la
transfection, on a utilisé le vecteur d'empaquetage pCMV-AR8.2, le vecteur encodant
l'enveloppe VSV-G, pMDG, et le vecteur de transfert pHR-Gal3-EGFP. Pour la production
du virus contrôle positif, on a utilisé le vecteur de transfert pHR-CMV-EGFP. Après 16 h,
VI
les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu DMEM. Les particules virales ont été
récoltées du surnageant 48 h après le début de la transfection et passées à travers un filtre
de 0.45 u.m. Les virus ont été concentrés par ultracentrifugation, resuspendus dans du
milieu DMEM complet et entreposés à -80°C. Le titre des deux virus a été déterminé par
des dilutions en série dans des cellules 293T.
2.3.3 Culture primaire de cellules microgliales
Des cerveaux de souris âgées de 1 à 5 jours ont été rincés dans du DPBS, émincés avec des
lames de rasoir et passés dans une seringue de 10 ml munie d'une aiguille de calibre 20. Le
culot centrifugé à 1500 rpm a été resuspendu dans un mélange de trypsine à 0.25% et de
Dnasel à 0.05%, et incubé à 37°C pendant 15 minutes. La digestion a été arrêtée avec le
milieu DMEM contenant 10% de sérum bovin fœtal et l'échantillon centrifugé. Les cellules
ont été resuspendues dans le milieu DMEM complet et ensemencées dans des flacons T-75
à une densité minimale de 100 000 cellules/cm2. Le milieu a été changé tous les 2-3 jours.
Les cellules microgliales ont été purifiées à partir des cultures mixtes après une période
d'incubation d'au moins 10 jours. Brièvement, les flacons ont été agités sur un agitateur à
37°C à 200 rpm pendant une période de 4 h pour faire décoller les cellules microgliales et
le surnageant a été récolté. Après 15-20 minutes d'incubation dans un nouveau flacon, le
surnageant a été enlevé pour éliminer les cellules non microgliales contaminantes et
remplacé par du milieu frais.
2.3.4 Transduction in vitro
La transduction in vitro des cellules microgliales, des fibroblastes et des neuroblastes a été
réalisée en utilisant les virus LentiGalEGFP et LentiCMVEGFP à des MOI (multiplicity of
infection) de 1, 10 et 100. 50 000 cellules par puit dans une plaque à 6 puits ont été
incubées pendant 2 h dans un volume minimal de 600 [il de préparation virale et de milieu
DMEM complet. Le volume a ensuite été complété à 2 ml. Le milieu a été changé après
24 h et les cellules ont été analysées pour l'expression de la protéine EGFP par cytométrie
en flux aux temps 2, 4 et 8 jours.
35
La transduction de cultures primaires de cellules microgliales a été exécutée en utilisant des
virus LentiGaBEGFP et LentiCMVEGFP à un MOI de 100. Les cellules purifiées ont été
incubées dans des flacons T-25 avec la quantité appropriée du virus dans un volume
minimal de 2 ml de milieu DMEM complet pendant 2 h. Le volume du milieu a ensuite été
complété à 4 ml et changé après 24 h. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux
après 48 h.
2.3.5 Immunocytofluorescence
Une lamelle poly-L-lysinée a été déposée au fond de chaque puit d'une plaque à 6 puits.
50 000 cellules par lamelle ont été laissées dans 250 [i\ de milieu DMEM complet pendant
30 minutes. Le volume a ensuite été complété à 1 ml. Après 24 h, les cellules ont été
rincées deux fois avec du DPBS, fixées avec de la paraformaldehyde 4% pH 7.4 pendant
30 minutes et rincées trois autres fois. L'incubation des cellules dans le KPBS contenant
5% de sérum de chèvre et 0.2% de Triton X-100 pendant 15 minutes a été suivie de
l'incubation durant 1 h dans la même solution contenant les anticorps primaires anti-CDl lb
de rat (1 : 1000, Molecular Probes) et anti-GFP de lapin (1 : 1000, Molecular Probes).
Quatre rinçages au KPBS avant et après l'ajout des anticorps secondaires fluorescents de
chèvre, anti-rat Rhodamine Red-X (1 : 500, Jackson ImmunoResearch) et anti-lapin Alexa
Fluor 488 (1 : 500, Molecular Probes), ont été effectués. Les lamelles ont été montées sur
des lames gélatinées, contre-colorées avec 2 [ig/ml de diamidinophénylindole (DAPI,
Molecular Probes) pendant 1 minute, rincées trois fois dans de l'eau et montées avec du
milieu PVA DABCO.
2.3.6 Cytométrie en flux
Avant d'être transplantées, les cellules microgliales transduites ont été marquées en
immunofluorescence et analysées par cytométrie en flux. Environ 1 u.g de l'anticorps de
blocage anti-souris FcylII/II de rat (BD Pharmingen) pendant 5 minutes et 0.25 u.g de
l'anticorps anti-souris CD1 lb couplé à la phycoérythrine (R-PE, BD Pharmingen) pendant
36
30 minutes ont été ajoutées pour 1 x 106 de cellules. Seulement les cellules doublement
marquées PE+GFP+ ont été utilisées pour la transplantation.
2.3.7 Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo avec ou sans cellules
tumorales
Des souris mâles C57BL/6 (Charles River) ont été anesthésiées et immobilisées dans un
appareil stéréotaxique. Une incision faite sur le cuir chevelu a été suivie d'une craniotomie
au-dessus de l'hémisphère droit, 1.7 mm latéral et 1.5 mm rostral à partir du bregma. Après
avoir enlevé la dure-mère, une seringue de 5 \xl munie d'une aiguille de calibre 27 a été
introduite dans le caudoputamen à une profondeur de 3.5 mm. Deux u.1 d'une suspension
contenant 5 x 104 de cellules microgliales transduites avec le vecteur LentiGaBEGFP ou
LentiCMVEGFP, avec ou sans 5 x 104 de cellules GL261, ont été injectés pendant
2 minutes à l'aide d'une micropompe. La seringue a été laissée en place 2 minutes après
l'injection et ensuite lentement retirée. La plaie a été cousue et enduite d'iode. Les souris
ont été sacrifiées 1, 7 ou 21 jours après la chirurgie.
2.3.8 Préparation de tissus
Toutes les souris sacrifiées dans ces expériences ont été anesthésiées et perfusées avec
10 ml de saline, suivi d'une perfusion d'une durée de 10 minutes avec une solution de
paraformaldéhyde 4%, pH 7.4. Les cerveaux ont été enlevés, postfixés durant 5 h à 4°C et
laissés dans une solution de KPBS contenant 20% de sucrose durant la nuit. Des tranches
de cerveaux de 30 u.m d'épaisseur ont été coupées avec un microtome, récoltées dans une
solution cryoprotectrice et entreposées à -20°C jusqu'à l'analyse histologique.
Chapitre 3 : Résultats
3.1 Etude de l'expression de la galectine-3
3.1.1 Expression de la galectine-3 est induite dans les macrophages cérébraux activés
Pour confirmer notre hypothèse que le gène de la galectine-3 est spécifique aux
macrophages activés, nous avons analysé son expression dans certaines conditions
anormales du système nerveux central, telles que le glioblastome et la démyélinisation.
Pour examiner la présence de l'ARN messager du gène de la galectine-3 dans le cerveau,
nous avons utilisé la technique d'hybridation in situ. Dans des cerveaux de souris injectés
avec des cellules tumorales GL261, les résultats indiquent que l'expression de l'ARNm du
gène de la galectine-3 était restreinte à la tumeur (Fig. 8a). Dans le modèle de
démyélinisation induite par la cuprizone, on a observé un signal très fort dans le corps
calleux et autres régions de matière blanche (Fig. 8c). L'absence totale du transcrit du gène
de la galectine-3 a été confirmée chez des souris contrôles (Fig. 8b). Pour confirmer la
production de la protéine galectine-3, nous avons utilisé l'immunofluorescence. Les
macrophages activés, doublement positifs pour le marqueur de macrophages Iba-1 et pour
la galectine-3, ont été trouvés principalement dans la substance blanche des souris traitées
avec la cuprizone (Fig. 811), comme observé précédemment. Ces résultats indiquent que
l'expression de la galectine-3 est induite dans les macrophages cérébraux activés.
3.1.2 Galectine-3 est exprimée par des cellules microgliales in vitro
L'expression du gène de la galectine-3 a été analysée par RT-PCR en utilisant de l'ARN
extrait de différentes lignées cellulaires. Les résultats ont indiqué que le gène de la
galectine-3 est exprimé de base dans des cultures de cellules microgliales BV2 et de
cellules tumorales GL261, mais pas dans des neuroblastes N2A (Fig. 9). Des niveaux
faibles ont été détectés dans des lignées de fibroblastes (F20), de myoblastes (C2C12) et
d'hépatocytes (Heplclc7).
38
3.2 Analyses de délétion du promoteur du gène de la galectine-3
3.2.1 Choix du promoteur minimal le plus robuste et spécifique : -2157Gal3
Pour caractériser le promoteur du gène de la galectine-3 et déterminer la longueur minimale
requise pour son efficacité et sa spécificité, une série de promoteurs de différentes
longueurs (-589, -1011, -1594, -2157 paires de bases en amont du site de l'initiation de la
transcription) ont été sous-clonés dans un vecteur portant le gène rapporteur
chloramphénicol-acétyltransférase (CAT) (Fig. 10a). Ces constructions ont été cotransfectées avec le plasmide contrôle pXGH5, exprimant l'hormone de croissance
humaine (hGH), dans des lignées permissives (cellules microgliales BV2), sémipermissives (fibroblastes F20) et non-permissives (neuroblastes N2A). Après 48 heures,
l'activité des promoteurs a été analysée en mesurant les niveaux de la CAT dans des lysats
de cellules et en normalisant ces résultats par rapport à la quantité d'hormone de croissance
humaine sécrétée dans le milieu. Le pourcentage d'activité de la CAT a été déterminé par
rapport au plasmide servant de contrôle positif RSV-pCAT (100% d'activité). Le vecteur
sans promoteur pCAT a été employé comme contrôle négatif. Les données présentées dans
la Figure 10b correspondent aux valeurs de trois expériences de transfection exécutées en
triplicata.
Le promoteur du gène de la galectine-3 n'a pas eu un effet significatif dans les cellules N2A
comme indiqué par les niveaux bas de l'activité de la CAT obtenus pour chacun des quatre
fragments du promoteur (4%, 3%, 4%, 8%). Dans les fibroblastes F20, le fragment le plus
court du promoteur contenait tous les éléments nécessaires pour une expression basale
(19%). Prolonger l'extrémité 5' au-delà de la position -589 (-101 lGal3-pCAT) a eu comme
conséquence une légère diminution de l'expression de la CAT (15%), tandis que les 1005
nucléotides plus en 5' (-1594Gal3-pCAT) n'ont provoqué aucun changement significatif
(21%). La séquence la plus longue a induit une augmentation de 1.7 fois (35%) par rapport
à la séquence la plus courte, ce qui représente un tiers de l'expression de la CAT sous
contrôle du promoteur RSV dans les fibroblastes, suggérant une présence d'un élément de
régulation positive de la transcription dans cette région. La transfection de cellules
microgliales BV2 a indiqué que le fragment -589 pb du promoteur de la galectine-3 assure
39
une expression de base du gène CAT (8%). L'addition de séquences subséquentes de 422
(-101 lGal3-pCAT) et 1005 nucléotides (-1594Gal3-pCAT) a eu comme conséquence une
diminution de 2 fois de l'expression de la CAT (4% et 2%, respectivement). La séquence
-2157Gal3 a démontré une activité de la CAT fortement augmentée (96%), qui égalise
pratiquement l'expression de la CAT régulée par le promoteur RSV. Le dernier résultat
confirme clairement la présence d'un élément activateur dans la région située entre les
paires de bases -1594 et -2157.
3.3 Conception du vecteur lentiviral et validation de son efficacité
3.3.1 Expression de la protéine EGFP sous le contrôle du promoteur du gène de la
galectine-3 dans des cellules microgliales transduites par le vecteur lentiviral in vitro
Le promoteur minimal du gène de la galectine-3 déterminé comme le plus robuste et le plus
spécifique, -2157Gal3, a été inséré dans un vecteur lentiviral qui exprime la protéine EGFP.
Pour examiner l'efficacité de ce lentivirus, nous l'avons comparé au virus exprimant la
protéine EGFP sous le contrôle du promoteur ubiquitaire CMV dans des cellules
microgliales et des fibroblastes en tant que cellules permissives et sémi-permissives,
respectivement, ainsi que dans des neuroblastes en tant que cellules non-permissives. Les
résultats de la transduction des cellules à des MOI de 1 et 10 n'ont pas été retenus en raison
du faible pourcentage obtenu de cellules transduites, sensiblement inférieur à celui obtenu à
un MOI de 100. Ainsi, seulement les résultats obtenus à un MOI de 100 seront présentés
ici. L'activité des promoteurs a été évaluée par cytométrie en flux 2, 4 et 8 jours après la
transduction des cellules.
La transduction des microglies par le vecteur lentiviral GaBEGFP à un MOI de 100 a eu
comme conséquence une expression stable du transgène dans plus de 64% des cellules. Le
ratio des MFI obtenu avec le vecteur LentiGal3EGFP était nettement plus élevé que celui
obtenu avec le vecteur LentiCMVEGFP (147%, 156%, 181%). Par ailleurs, l'intensité
moyenne de fluorescence (MFI) des fibroblastes (2.0) et des neuroblastes (2.4) transduits
avec le vecteur GaBEGFP était plus basse que celle des cellules microgliales transduites
40
avec le même vecteur (6.9). De plus, le ratio des MFI des fibroblastes et des neuroblastes
transduits avec le vecteur LentiCMVEGFP était sensiblement plus haut que le ratio des
MFI de ces mêmes cellules transduites avec le vecteur LentiGaBEGFP (Fig. 11b). Ces
résultats nous ont permis de conclure que le vecteur LentiGaBEGFP permettait d'obtenir
une expression robuste et durable dans les cellules microgliales in vitro, mais qui ne leur est
pas tout à fait spécifique.
3.4 Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo avec ou
sans cellules tumorales
Nous avons vérifié la possibilité d'utiliser des cellules microgliales comme vecteurs pour la
thérapie génique afin d'introduire des gènes thérapeutiques à l'intérieur du tissu nerveux
affecté par une blessure ou une maladie. Pour ce faire, nous avons transduit des cultures
primaires de cellules microgliales provenant de souris nouveau-nées et les avons triées à
l'aide d'un cytomètre en flux avant de les transplanter dans un cerveau sain et dans une
tumeur. Dû à un nombre restreint de cellules obtenues pour la transplantation, nous avons
été contraints de limiter le nombre d'animaux pour cette étude.
Dans un premier temps, 5 x 104 cellules microgliales dans un volume total de 2 fil ont été
injectées par voie intracérébrale. Des souris ont été sacrifiées 1 et 21 jours après l'injection.
Les cerveaux ont été marqués par immunofluorescence et analysés en microscopie
confocale. Le patron d'expression de la protéine EGFP dans le cas des cellules transduites à
l'aide des virus LentiGaBEGFP et LentiCMVEGFP était semblable (Fig. 12). Au jour 1,
nous avons noté un grand nombre de cellules doublement marquées pour la galectine-3 et la
GFP. En effet, toutes les cellules GFP+ étaient aussi positives pour la galectine-3. À travers
le temps, toutefois, le nombre de ces cellules diminuait pour manifestement disparaître
après 21 jours, où nous avons noté qu'une ou deux cellules GFP+ par tranche de cerveau.
L'expression de la galectine-3 persistait après 21 jours. Elle semblait être liée à la réponse
des macrophages à la blessure mécanique provoquée par l'injection. La morphologie de ces
cellules suggère qu'il s'agit bel et bien de macrophages activés, résidents ou recrutés au site
41
de la blessure. Cependant, des analyses plus approfondies sur un plus grand nombre
d'animaux seront nécessaires pour confirmer les observations de cette étude préliminaire.
Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'utiliser les cellules microgliales
transduites par un vecteur lentiviral en thérapie génique dans un contexte inflammatoire, en
l'occurrence une tumeur cérébrale. Cinq x 104 cellules microgliales transduites avec le
vecteur LentiCMVEGFP ont été cotransplantées avec 5 x 104 cellules tumorales GL261
dans un volume total de 2 [il. Les souris ont été sacrifiées 7 jours après l'injection. Les
cerveaux ont été marqués par immunofluorescence et analysés en microscopie confocale.
Une présence persistante d'un grand nombre de cellules transduites 7 jours après la
chirurgie, ainsi que leur distribution exclusive à la tumeur, ont pu être observées (Fig. 13).
Ceci valide notre hypothèse quant à une utilisation possible des cellules microgliales en
thérapie génique. Toutefois, pour admettre que le vecteur lentiviral assure une expression
spécifique et durable du transgène dans un contexte inflammatoire, il faudrait entreprendre
d'autres analyses.
!!
Il
Figure 8. Galectine-3 est exprimée dans les macrophages activés dans des conditions
pathologiques du système nerveux central.
I, Production de l'ARNm du gène de la galectine-3 est induite dans un modèle expérimental de
glioblastome (a) et de démyélinisation induite par la cuprizone (c et d). L'absence totale du tran­
scrit du gène de la galectine-3 est noté dans le cerveau des souris contrôles (b).
II, Images de microscopie confocale démontrant la présence de macrophages activés marqués
avec les anticorps lba-1 et Gal-3 (flèches) et de quelques cellules faiblement marquées ou nonmarquées avec Gal-3 (têtes de flèche).
Abréviations : AC, commissure antérieure ; Hypo, hypothalamus ; 3V; 3e ventricule.
# /
4? § # d?
— Gal-3(1159pb)
— (J-actine (540 pb)
Figure 9. Expression de l'ARNm du gène de la
galectine-3 dans différentes lignées cellulaires in
vitro.
Analyse sur le gel d'agarose des échantillons de
l'ARN
extrait
des
hépatocytes
Hep1c1c7,
fibroblastes F20, myoblastes C2C12, neuroblastes
N2A, cellules tumorales GL261 et cellules
microgliales BV2,et amplifiés par RT-PCR.
-2157
+1 -124
B3y
Gal-3
-1594
2157Gal-3-pCAT
■
1
1
|
>s
H
+1 +124
JQJw
Gal-3
-1011
+1 +124
I
±
Gal-3
P5y
-589 +1+124
Gal-3
B3y
1594Gal-3-pCAT
i— 4
| BV2 (microglies)
i
1011Gal-3-pCAT
D
«y
F20 (fibroblastes)
^C
| N2A (neuroblastes)
<<?
^
<?
rfP
M
:
-589Gal-3-pCAT
H
■W
0
10 20
1
1
30 40
1
1
50 60
1
1
70 80
1
1
1
1
90 100 110 120
% de l'activité RSV-pCAT
Figure 10. Analyse de délétion du promoteur du gène de la galectine-3.
a, Une série de promoteurs mGal-3 de différentes longueurs ont été sous-clonés dans un vecteur portant le gène rapporteur CAT.
b, Ces constructions ont été analysées par transfection transitoire dans des cellules permissives (cellules microgliales BV2),
sémi-permissives (fibroblastes F20) et non-permissives (neuroblastes N2A). Les résultats ont été normalisés par rapport au plasmide
servant de contrôle positif RSV-pCAT (100% d'activité; mean±SE). L'effet de la construction -2157Gal-3-pCAT par rapport aux autres
constructions a été statistiquement significatif dans les cellules microgliales et les fibroblastes (Tukey HSD test, ***p<0,0001, **p<0,0002).
c, Position présumée des éléments de régulation de la transcription.
BV2 microglies
F20 fibroblastes N2A neuroblastes
Figure 11. Analyse de transduction in vitro des vecteurs LentiGaBEGFP
et LentiCMVEGFP.
a,Cellules microgliales BV2 transduites à l'aide du lentivirus exprimant la
protéine EGFP sous le contrôle du promoteur du gène de la galectine-3.
b, L'intensité moyenne de fluorescence (MFI) dans les cellules microglia­
les transduites avec le vecteur LentiGal3EGFP a été sensiblement plus
élevée que celle des cellules transduites par le vecteur contenant le
promoteur CMV. Sa valeur a été statistiquement significative par rapport
aux autres types cellulaires (Tukey HSD test, p<0,0001). Les cellules ont
été analysées par cytométrie en flux 2,4 et 8 jours après la transduction.
L'expérience a été effectuée en triplicata.
LentiGal3EGFP
LentiCMVEGFP
Jour 1
Jour 21
Figure 12. Transplantation de cellules microgliales transduites ex vivo.
Le patron d'expression de la protéine EGFP dans le cas des cellules transduites par
les virus LentiGal3EGFP et LentiCMVEGFP est semblable. Le jour 1,on retrouve un
grand nombre de cellules doublement positives pour Gal-3 (en rouge) et EGFP (en
vert). À travers le temps, leur nombre diminue pour presque disparaître au bout de
21 jours.
Figure 13. Expression de la protéine EGFP dans des cellules microgliales
transduites avec le vecteur LentiCMVEGFP et co-injectées avec des
cellules tumorales GL261.
Un nombre important de cellules microgliales transduites a été retrouvé
à l'intérieur de la tumeur 7 jours après l'injection. La morphologie
amiboïde des cellules suggère un état activé.
Chapitre 4 : Discussion
La principale raison de l'activité non-spécifique du promoteur de la galectine-3 dans les
fibroblastes, la lignée semi-permissive, comme observé dans les analyses de délétion, ainsi
que la non sélectivité du vecteur LentiGal3EGFP, observée dans les transductions in vitro,
serait le fait que certains éléments de régulation transcriptionnelle pourraient être
manquants dans notre promoteur. En effet, la plupart des éléments d.v-actifs sont localisés
en 5' du site de l'initiation de la transcription, mais certains peuvent être situés en 3' de la
séquence codante, voire dans un intron. Ces séquences régulatrices peuvent exercer une
influence sur des distances de plusieurs milliers de paires de bases en aval du site de
l'initiation de la transcription. Notre promoteur contenait effectivement une séquence de
128 pb en amont du site de l'initiation de la transcription, mais elle semble insuffisante,
c'est-à-dire que les éléments responsables de la spécificité de l'expression du gène de la
galectine-3 se trouvent à l'extérieur de cette région.
Le manque de spécificité du vecteur lentiviral LentiGal3EGFP pourrait aussi être expliqué
par l'interférence des séquences promotrices contenues dans le LTR avec le promoteur de
la galectine-3 (aclivation transcriptionnelle ou levée d'inhibition) [172]. Toutefois, les LTR
d'un vecteur lentiviral sans la présence du facteur de transactivation tut, comme dans le cas
du vecteur LentiGaBEGFP, sont en théorie inactifs. Il a été noté que le problème
d'interférence associée aux régions LTR ainsi que le risque d'apparition de virus
recombinants pourraient être minimisés en utilisant des vecteurs de troisième génération
(vecteurs auto-inactivants) [75]. Cependant, malgré des délétions dans les régions LTR, une
étude a rapporté que ce type de vecteur était tout de même capable de promouvoir la
transcription grâce à l'activité de la région « leader » [173J.
Finalement, le problème de spécificité du vecteur lentiviral pourrait en partie découler du
fait que celui-ci peut s'intégrer dans le génome de la cellule hôte en plusieurs copies,
surtout dans le cas des transductions à des hauts MOI [174]. Ceci influencerait en même
temps les niveaux de l'intensité de fluorescence [175]. Pour compléter ces expériences, il
49
serait donc important de déterminer le nombre de copies virales à l'intérieur de la
population cellulaire donnée, et d'établir un lien entre ces résultats et les niveaux de MFI
obtenus.
Il faut rappeler que nos expériences in vitro étaient effectuées sur des cellules
immortalisées et qu'idéalement, les études du promoteur devraient être effectuées avec des
cultures primaires. En outre, les résultats obtenus par transfection transitoire pourraient
grandement différer de ceux obtenus par transduction, c'est-à-dire dans le cas d'une
expression stable du transgène, étant donné la différence entre les deux contrôles
d'expression génique. Il faut mentionner également que malgré le fait que les études in
vitro soient un excellent moyen d'évaluation d'efficacité des vecteurs lentiviraux, la
différence entre celles-ci et les études in vivo met en évidence l'importance d'effectuer des
études quantitatives in vivo.
Nous avons vérifié la possibilité d'utiliser des cellules microgliales transduites avec le
vecteur lentiviral en thérapie génique ex vivo en les transplantant dans un cerveau sain.
Toutes les cellules GFP+ étaient aussi Gal-3+, mais l'expression de la galectine-3 persistait
dans le temps, tandis que la presque totalité des cellules GFP+ était disparue. L'éventuelle
variation de l'expression de la galectine-3, c'est-à-dire son augmentation ou sa diminution,
ni la destinée exacte des cellules GFP+ à travers le temps n'ont pas pu être étudiées plus en
profondeur. Ce qui semble le plus probable est que les cellules transplantées avaient
migrées vers les ganglions lymphatiques cervicaux pour exercer leur fonction de
présentation d'antigène, ou qu'elles avaient été carrément éliminées. Toutefois, une autre
hypothèse, qui veut que la plupart des intégrants proviraux ont été méthylés et sont ainsi
demeurés silencieux à l'intérieur des cellules transplantées, ne peut être complètement
écartée [176-178].
En ce qui concerne le comportement adopté par les cellules transplantées dans un contexte
pathologique, une présence persistante d'un grand nombre de cellules transduites avec le
vecteur LentiCMVEGFP 7 jours après l'injection, ainsi que leur distribution exclusive à la
tumeur, ont pu être observées. Ceci valide notre hypothèse quant à une utilisation possible
50
des cellules microgliales en tant que véhicule cellulaire en thérapie génique. D'autres
analyses plus approfondies sur un plus grand nombre d'animaux seront toutefois
nécessaires pour confirmer les observations de cette étude préliminaire et pour admettre que
le vecteur lentiviral assure une expression spécifique et durable du transgène dans un
contexte inflammatoire. Ces résultats pourraient ainsi s'ajouter aux résultats prometteurs
obtenus dans d'autres études de thérapie génique où les macrophages étaient transplantés
dans différents tissus atteints d'une tumeur [179-182]. Dans une étude clinique, des
monocytes prélevés du sang et différenciés en macrophages cytotoxiques par stimulation ex
vivo avec de la LPS ou de l'IFNy ont été réinjectés aux patients [183]. Malgré le fait qu'une
activité anti-tumorale évidente n'a pas été observée, la perspective de manipulation des
macrophages présente une bonne base pour la conception de nouveaux traitements
immunothérapeutiques.
Chapitre 5 : Conclusion
Le traitement des maladies neurologiques demeure un des importants défis de la recherche
médicale d'aujourd'hui. Malgré l'énorme progrès dans le domaine de la thérapie génique,
le transfert efficace et sécuritaire de gènes thérapeutiques au cerveau demeure un obstacle
majeur. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à la stratégie
de transfert génique qui consiste en l'introduction d'un gène extrinsèque dans les
macrophages cérébraux à l'aide d'un lentivirus, placé sous le contrôle d'un promoteur
génique connu pour être actif préférentiellement dans ces cellules. Pour valider la faisabilité
de cette méthode, nous avons identifié le gène de la galectine-3 comme étant exprimé de
façon préférentielle dans les macrophages cérébraux activés et examiné la possibilité
d'utiliser son promoteur pour limiter l'expression d'un transgène à ce type de cellules. De
plus, nous avons exploré la possibilité d'utiliser des cellules microgliales modifiées
génétiquement pour la thérapie génique.
Nous avons obtenu des résultats prometteurs quant à une utilisation potentielle des cellules
microgliales en thérapie génique. Toutefois, pour confirmer que le vecteur lentiviral assure
une expression spécifique et durable du transgène dans ces cellules, il faudrait entreprendre
d'autres analyses. On est en mesure d'affirmer avec plus de certitude que la méthodologie
empruntée, modifiée en fonction des recommandations émises, pourrait bien être réutilisée
lorsqu'un gène spécifique à l'une ou à l'autre des populations de macrophages cérébraux
aura été identifié. De récentes études, par exemple, proposent l'utilisation de nouveaux
marqueurs sensibles pour distinguer la population de macrophages activés : GPR84 et
TREM-2 [184-186]. Les aspects fonctionnels et sécuritaires du vecteur lentiviral doivent
également être améliorés. Pour augmenter la biosécurité du vecteur, le système gène
suicide/prodrogue constitué du gène de la thymidine kinase du virus Herpès simplex de
type 1 (HSVl-f/c) et du ganciclovir, qui a déjà fait ses preuves dans la thérapie antitumorale, serait recommandé [187-194].
52
Les possibilités que représente le transfert génique dirigé qui consiste en la transplantation
de cellules monocytaires ou de leurs précurseurs modifiés ex vivo, qui ont la capacité de
traverser la barrière hémato-encéphalique et se différencier en macrophages qui migreront
ensuite vers les régions lésées, sont très prometteuses. Le fait que certains macrophages
trouvés dans les tumeurs cérébrales proviennent de ces cellules renforce l'hypothèse d'une
utilisation réussie de ce type de cellules pour la thérapie génique anti-tumorale. Toutefois,
les effets du nombre de cellules injectées, ainsi que les différents moyens et les voies
d'administration doivent être étudiés plus en profondeur. Il faut également définir avec plus
de précision les modifications génétiques des cellules souches et de leurs précurseurs (ex.
les effets de différents stades de différenciation et d'activation). Le développement de
nouveaux outils moléculaires, comme celui présenté dans cette étude, devrait renforcer
l'intérêt de la thérapie génique pour le traitement des maladies du système nerveux.
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